全 文 ：湖北麦冬花药愈伤组织诱导及再生植株的获得
周群，周健丘，王小刚，王菁菁，李敬文，陈家春
（华中科技大学 同济药学院 天然药物化学与资源评价湖北省重点实验室，湖北 武汉 ４３００３０）
［摘要］　目的：探讨药用植物湖北麦冬花药愈伤组织诱导和植株再生条件。方法：以湖北麦冬花药为外植体，采用ＭＳ培
养基，附加不同的植物激素进行实验。常规压片法结合显微镜进行再生植株染色体的计数分析。结果：ＭＳ＋２，４Ｄ１０ｍｇ·
Ｌ－１＋ＫＴ２０ｍｇ·Ｌ－１诱导愈伤组织效果最好，愈伤组织诱导率可达４１０７％。ＭＳ＋６ＢＡ１５～２０ｍｇ·Ｌ－１＋ＮＡＡ０１～０３
ｍｇ·Ｌ－１适于不定芽的诱导，不定芽转入附加ＮＡＡ０１～０３ｍｇ·Ｌ－１的１／２ＭＳ的生根培养基上，生根后获得完整的再生植
株，再生植株为体细胞起源。同时，讨论了４℃低温预处理对愈伤组织诱导的影响。结论：建立了湖北麦冬花药体细胞组织培
养体系和快速繁殖途径。
［关键词］　湖北麦冬；花药培养；愈伤组织；植株再生
［收稿日期］　２００９０１１３
［基金项目］　国家“十一五”科技支撑计划项目（２００６ＢＡＩ０６Ａ１５
４）；高等学校博士学科点专项科研基金项目（２００６０４８７０７１）
［通信作者］　陈家春，教授，Ｔｅｌ：（０２７）８３６９２７９３，Ｅｍａｉｌ：ｈｏｍｅｓｐｒｉ
ｎｇｃｈｅｎ＠ｓｏｈｕ．ｃｏｍ
［作者简介］　周群，讲师，主要从事生药资源与品质评价研究。Ｅ
ｍａｉｌ：ｚｑｔｃｍ＠１６３．ｃｏｍ
　　湖北麦冬 Ｌｉｒｉｏｐｅｓｐｉｃａｔａ（Ｔｈｕｎｂ．）Ｌｏｕｒ．ｖａｒ．
ｐｒｏｌｉｆｅｒａＹ．Ｔ．Ｍａ是《中国药典》２００５年版收载的
中药“山麦冬”的主要原植物。它以块根入药，具有
养阴生津，润肺清心之功效，是商品中药麦冬的主流
品种，产量已占全国麦冬总产量的５０％［１］。
湖北麦冬开花不结实，在种植生产中采用无性
分株繁殖。由于长期无性繁殖，导致病毒累积且种
质已呈明显退化趋势，其产量和质量受到严重影响。
湖北麦冬的提纯复壮和品种改良是目前生产中亟需
解决的重要问题。由于其“花而不实”，无法采用常
规方法育种。花药离体培养不仅是植物快速繁殖并
获得脱毒植株的有效途径［２５］，所获得的体细胞株也
为基因工程、细胞工程等生物技术改良植物品种的
遗传特性提供良好的材料和实验体系。本研究首次
以药用植物湖北麦冬花药为外植体，探索花药愈伤
组织诱导和植株再生的条件，建立湖北麦冬快速繁
殖的新途径，为进一步对其进行提纯复壮和采用现
代生物工程技术选育新品种奠定基础。
１　材料
湖北麦冬Ｌ．ｓｐｉｃａｔａｖａｒ．ｐｒｏｌｉｆｅｒａ为湖北省襄樊
市襄城区欧庙镇（湖北麦冬 ＧＡＰ试验基地）栽培植
株，经华中科技大学同济药学院生药教研室陈家春
教授鉴定后，２００７年３月移栽于华中科技大学同
济医学院苗圃内。２００８年７月开花后，用改良卡
宝品红染色检查花粉发育时期，选取花粉发育处于
单核期的花蕾。
２　方法
２．１　花蕾消毒与花药的接种　将采摘的花蕾用自
来水冲洗干净，滤纸吸干后，７０％乙醇处理２０ｓ，无
菌水冲洗１次，然后用０１％升汞处理１０ｍｉｎ，无菌
水冲洗５遍。接种前用无菌滤纸吸干水分，剥出花
药，去除花丝，接种于含不同激素配比的 ＭＳ诱导培
养基中。另将采摘的花蕾放入４℃冰箱，分别低温
预处理０，２，４，６ｄ。接种在 ＭＳ附加２，４Ｄ１０ｍｇ
·Ｌ－１＋ＫＴ２０ｍｇ·Ｌ－１的培养基中，观察低温预处
理对愈伤组织形成的影响。
２．２　培养基及培养条件　以 ＭＳ培养基为基本培
养基，分别附加 ＫＴ２０ｍｇ·Ｌ－１和不同质量浓度
２，４Ｄ（１０，１５，２０，３０ｍｇ·Ｌ－１）的培养基进行
花药愈伤组织的诱导培养，分化培养基采用ＭＳ＋６
ＢＡ１５～２０ｍｇ·Ｌ－１＋ＮＡＡ０１～０３ｍｇ·Ｌ－１，
生根培养基采用１／２ＭＳ＋ＮＡＡ０１～０３ｍｇＬ－１。
以上培养基中均加入３％蔗糖，０６％琼脂，ｐＨ５８。
培养温度（２５±２）℃，诱导培养为连续暗培养２周
后转光培养，分化培养全程采用光照养，光照１２ｈ·
ｄ－１，光强１５００～２０００ｌｘ，每３０ｄ继代培养１次。
２．３　愈伤组织诱导、芽的形成和生根培养　观察花
药接种后愈伤组织的生长情况，接种后３０ｄ统计不
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同２，４Ｄ浓度的 ＭＳ诱导培养基的愈伤组织诱导
率，采用诱导愈伤组织效果较好的培养基进行继代
培养。当诱导形成的胚性愈伤组织长至直径１０～
３０ｍｍ时，转入分化培养基。每１５０ｍＬ三角瓶中
接种４～５个愈伤组织。当愈伤组织长出芽后，转接
于生根培养基上进行生根培养。
２．４　再生植株的细胞学分析　对３６个再生植株染
色体进行计数观察。取旺盛生长的根尖，用０１％
秋水仙素水溶液预处理２ｈ（常温），蒸馏水洗净，卡
诺氏固定液（冰醋酸无水乙醇为１∶３）中固定１８～
２４ｈ，然后转入７０％乙醇中４℃保存备用。制片时，
用１ｍｏｌ·Ｌ－１盐酸６０℃解离１０ｍｉｎ，蒸馏水洗净，
用改良卡宝品红染色５ｍｉｎ，常规方法压片，光学显
微镜下观察，统计细胞分裂中期染色体数目并拍照。
２．５　组培苗的移栽　当组培苗长出３条以上不定根
时，打开瓶盖，在室内炼苗２ｄ后移栽至细颗粒、松软
的土壤中，适当遮光保湿，温度保持在２０℃左右。
３　结果与分析
３．１　激素对愈伤组织诱导的影响　将花药接种在
ＭＳ附加不同激素浓度的培养基上，２周后观察到部
分花药体积膨大，３周后发生纵裂，形成淡黄绿色的
愈伤组织。接种后３０ｄ花药愈伤组织的诱导率结
果见表１。结果表明，附加２，４Ｄ１０ｍｇ·Ｌ－１＋ＫＴ
２０ｍｇ·Ｌ－１的ＭＳ培养基诱导愈伤组织效果最好，
诱导率可达４１０７％。
表１　２，４Ｄ对花药愈伤组织诱导的影响
２，４Ｄ
／ｍｇ·Ｌ－１
ＫＴ
／ｍｇ·Ｌ－１
接种花
药数
形成愈伤
组织数
诱导率
／％
１０ ２０ １１２ ４６ ４１０７
１５ ２０ １１８ ４０ ３３９０
２０ ２０ １０６ １４ １３２１
３０ ２０ ９８ １４ １４２９
３．２　低温预处理对诱导愈伤组织的影响　湖北麦
冬花药在４℃条件下经不同时间的低温预处理，接
种在 ＭＳ附加 ２，４Ｄ１０ｍｇ·Ｌ－１＋ＫＴ２０ｍｇ·
Ｌ－１培养基上，接种后３０ｄ统计花药愈伤组织的诱
导率，见表２。结果表明，４℃低温预处理４ｄ，愈伤
组织的诱导率最高但差别不大，低温预处理对湖北
麦冬花药诱导影响不显著。
３．３　愈伤组织的分化和再生植株的获得　将由花
药诱导产生的胚性愈伤组织转入分化培养基上进行
培养，３个月后，可见部分愈伤组织上形成绿色的芽
　　 表２　低温预处理对花药愈伤组织诱导的影响
４℃预处理时间／ｄ 接种花药数 形成愈伤组织数 诱导率／％
０ １０６ ４０ ３７７４
２ １０８ ４２ ３８８９
４ １１９ ４６ ３９６６
８ ９４ ３７ ３９３６
点，芽点进一步发育，形成不定芽或芽丛。不定芽培
养基中所含细胞分裂素６ＢＡ与生长激素ＮＡＡ质量
浓度比为２０∶１较好。待不定芽长至２～３ｃｍ高时
将其切下，转入生根培养基上，１周后观察到部分无
根幼苗茎基部有白色愈伤组织产生，随后形成白色
的根，２周后即可获得完整的再生植株。４周时，根
长可达５ｃｍ左右。生根率可达４０％。
３．４　再生植株的细胞学分析　再生植株根尖细胞
分裂中期染色体数目都为５４条，见图１，和花药供
体植株染色体数目相同［６］，未发现单倍体和非整倍
体。结果表明，本实验所获得的花药再生植株为体
细胞起源。
图１　再生植株细胞分裂中期染色体（比例尺＝５μｍ）
３．５　组培苗的移栽　组培苗移入大田后，叶色浓
绿，生长良好，并对环境具有较强的适应能力。移栽
成活率为８０％。
４　讨论
适合用于花药培养的花粉发育的临界时期在物
种之间是不同的。一般来说，培养处于单核中期至
晚期的花粉效果较好。因为处于花粉减数分裂时期
的幼嫩花药和花粉充满淀粉粒的较老花药都不能产
生胚状体。湖北麦冬花药小孢子大多发育异常，花
药愈伤起源于体细胞，但花药的发育时期同样对花
药出愈率有着明显影响，以小孢子处于单核期的花
药愈伤诱导率最高（４１０７％）。因此，湖北麦冬花
药培养以含单核期孢子的花药作外植体为适宜。
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植物花药愈伤组织形成受多种因素的制约。普
遍认为低温预处理能提高花药的诱导率［７］，大多数
植物花药培养时，多进行低温预处理。本研究中，低
温预处理对湖北麦冬花药愈伤组织的诱导影响不显
著。张利平等也得到类似的结果［８１０］，这表明不同
种类或品种花药愈伤组织形成对温度的要求不一
样。本试验在诱导愈伤的过程中除了使用不同浓度
２，４Ｄ进行筛选外，还附加了 ＫＴ２０ｍｇ·Ｌ－１。
２，４Ｄ１０ｍｇ·Ｌ－１与 ＫＴ２０ｍｇ·Ｌ－１合用的 ＭＳ
培养基诱导胚性愈伤组织效果良好。而在分化培养
基中去掉了２，４Ｄ。２，４Ｄ若不及时去掉，则芽难以
产生。花药愈伤组织分化为植株一般需要将其转移
到含低浓度生长素和高浓度细胞分裂素的分化培养
基上，才能诱导形成完整植株。因此，本试验中采用
细胞分裂素６ＢＡ与生长激素 ＮＡＡ浓度比为２０∶ｌ
的分化培养基，愈伤组织分化效果良好。
本研究的初始目的是以湖北麦冬花药为外植体
进行组织培养获得单倍体植株，但检测发现再生植
株实际上均起源于体细胞，所建立的花药培养体系
不仅污染率极低，而且体细胞胚性愈伤诱导率高、愈
伤组织的分化效果也较好，组培苗移栽后生长良好，
成活率达８０％。湖北麦冬花药再生植株与供试品
种间品质差异还有待进一步研究。
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ＣａｌｕｓｉｎｄｕｃｔｉｏｎａｎｄｐｌａｎｔｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆＬｉｒｉｏｐｅｓｐｉｃａｔａ
ｖａｒ．ｐｒｏｌｉｆｅｒａａｎｔｈｅｒ
ＺＨＯＵＱｕｎ，ＺＨＯＵＪｉａｎｑｉｕ，ＷＡＮＧＸｉａｏｇａｎｇ，ＷＡＮＧＪｉｎｇｊｉｎｇ，ＬＩＪｉｎｇｗｅｎ，ＣＨＥＮＪｉａｃｈｕｎ
（ＨｕｂｅｉＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＮａｔｕｒａｌＭｅｄｉｃｉｎａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＲｅｓｏｕｒｃｅＥｖａｌｕａｔｉｏｎ，ＴｏｎｇｊｉＳｃｈｏｏｌｏｆ
Ｐｈａｒｍａｃｙ，ＨｕａｚｈｏｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｗｕｈａｎ４３００３０，Ｃｈｉｎａ）
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏｓｔｕｄｙｔｈｅｔｅｃｈｎｉｑｕｅｏｆｔｈｅｃａｌｕｓｉｎｄｕｃｔｉｏｎｆｒｏｍａｎｔｈｅｒａｎｄｐｌａｎｔｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆｍｅｄｉｃｉｎａｌｐｌａｎｔｓ
Ｌｉｒｉｏｐｅｓｐｉｃａｔａｖａｒ．ｐｒｏｌｉｆｅｒａ．Ｍｅｔｈｏｄ：ＣａｌｕｓｗａｓｉｎｄｕｃｅｄｆｒｏｍａｎｔｈｅｒｏｆＬ．ｓｐｉｃａｔａｖａｒ．ｐｒｏｌｉｆｅｒａｏｎａＭＳｍｅｄｉｕｍｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄｗｉｔｈ
ｄｉｆｅｒｅｎｔｈｏｒｍｏｎｅｓ．Ｔｈｅｓｑｕａｓｈｍｅｔｈｏｄｓｃｏｍｂｉｎｅｄｗｉｔｈａｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅｗｅｒｅｕｓｅｄｔｏａｎａｌｙｚｅｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓｏｆｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄｐｌａｎｔｌｅｔｓ．
Ｒｅｓｕｌｔ：ＭＳ＋２，４Ｄ１．０ｍｇ·Ｌ－１＋ＫＴ２．０ｍｇ·Ｌ－１ｇａｖｅｔｈｅｈｉｇｈｅｓｔｉｎｄｕｃｔｉｏｎｒａｔｉｏｗｈｉｃｈｗａｓ４１．０７％．ＭＳ＋６ＢＡ１．５２．０ｍｇ·
Ｌ－１＋ＮＡＡ０．１０．３ｍｇ·Ｌ－１ｗａｓｓｕｉｔａｂｌｅｆｏｒｔｈｅｉｎｄｕｃｔｉｏｎａｎｄｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆｉｎｄｅｆｉｎｉｔｅｂｕｄｓ．Ｔｈｅｂｕｄｓｗｅｒｅｔｒａｎｓｆｅｒｅｄｔｏ１／２ＭＳ
ｍｅｄｉｕｍｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄｗｉｔｈＮＡＡ０．１０．３ｍｇ·Ｌ－１ｆｏｒｒｏｏｔｉｎｇ．Ｔｈｅｓｈｏｏｔｓｐｒｏｄｕｃｅｄｒｏｏｔｓｏｆｃｕｌｔｕｒｅａｎｄｆｏｒｍｅｄｃｏｍｐｌｅｔｅｐｌａｎｔｌｅｔｓ．Ｔｈｅ
ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄｐｌａｎｔｌｅｔｓｏｒｉｇｉｎａｔｅｄｆｒｏｍｓｏｍａｔｉｃｃｅｌｓ．Ａｔｔｈｅｓａｍｅｔｉｍｅ，ｔｈｅｅｆｅｃｔｓｏｆｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｌｏｗｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅａｔ４℃ ｏｎｔｈｅｃａｌｕｓ
ｉｎｄｕｃｔｉｏｎｗｅｒｅｓｔｕｄｉｅｄａｎｄｄｉｓｃｕｓｓｅｄ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｔｈｉｓｐａｐｅｒｓｅｔｓｕｐｔｈｅｍｅｔｈｏｄｏｆｔｉｓｓｕｅｃｕｌｔｕｒｅｏｆａｎｔｈｅｒｓｏｍａｔｉｃｃｅｌｓａｎｄｉｎｔｅｒｍｅ
ｄｉａｔｅｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎｏｆＬ．ｓｐｉｃａｔａｖａｒ．ｐｒｏｌｉｆｅｒａ．
［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］　Ｌｉｒｉｏｐｅｓｐｉｃａｔａｖａｒ．ｐｒｏｌｉｆｅｒａ；ａｎｔｈｅｒｃｕｌｔｕｒｅ；ｃａｌｕｓ；ｐｌａｎｔｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ
［责任编辑　吕冬梅］
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第３４卷第１７期
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