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Callus induction and plant regeneration of Liriope spicatavar. prolifera anther

湖北麦冬花药愈伤组织诱导及再生植株的获得



全 文 :湖北麦冬花药愈伤组织诱导及再生植株的获得
周群,周健丘,王小刚,王菁菁,李敬文,陈家春
(华中科技大学 同济药学院 天然药物化学与资源评价湖北省重点实验室,湖北 武汉 430030)
[摘要] 目的:探讨药用植物湖北麦冬花药愈伤组织诱导和植株再生条件。方法:以湖北麦冬花药为外植体,采用MS培
养基,附加不同的植物激素进行实验。常规压片法结合显微镜进行再生植株染色体的计数分析。结果:MS+2,4D10mg·
L-1+KT20mg·L-1诱导愈伤组织效果最好,愈伤组织诱导率可达4107%。MS+6BA15~20mg·L-1+NAA01~03
mg·L-1适于不定芽的诱导,不定芽转入附加NAA01~03mg·L-1的1/2MS的生根培养基上,生根后获得完整的再生植
株,再生植株为体细胞起源。同时,讨论了4℃低温预处理对愈伤组织诱导的影响。结论:建立了湖北麦冬花药体细胞组织培
养体系和快速繁殖途径。
[关键词] 湖北麦冬;花药培养;愈伤组织;植株再生
[收稿日期] 20090113
[基金项目] 国家“十一五”科技支撑计划项目(2006BAI06A15
4);高等学校博士学科点专项科研基金项目(20060487071)
[通信作者] 陈家春,教授,Tel:(027)83692793,Email:homespri
ngchen@sohu.com
[作者简介] 周群,讲师,主要从事生药资源与品质评价研究。E
mail:zqtcm@163.com
  湖北麦冬 Liriopespicata(Thunb.)Lour.var.
proliferaY.T.Ma是《中国药典》2005年版收载的
中药“山麦冬”的主要原植物。它以块根入药,具有
养阴生津,润肺清心之功效,是商品中药麦冬的主流
品种,产量已占全国麦冬总产量的50%[1]。
湖北麦冬开花不结实,在种植生产中采用无性
分株繁殖。由于长期无性繁殖,导致病毒累积且种
质已呈明显退化趋势,其产量和质量受到严重影响。
湖北麦冬的提纯复壮和品种改良是目前生产中亟需
解决的重要问题。由于其“花而不实”,无法采用常
规方法育种。花药离体培养不仅是植物快速繁殖并
获得脱毒植株的有效途径[25],所获得的体细胞株也
为基因工程、细胞工程等生物技术改良植物品种的
遗传特性提供良好的材料和实验体系。本研究首次
以药用植物湖北麦冬花药为外植体,探索花药愈伤
组织诱导和植株再生的条件,建立湖北麦冬快速繁
殖的新途径,为进一步对其进行提纯复壮和采用现
代生物工程技术选育新品种奠定基础。
1 材料
湖北麦冬L.spicatavar.prolifera为湖北省襄樊
市襄城区欧庙镇(湖北麦冬 GAP试验基地)栽培植
株,经华中科技大学同济药学院生药教研室陈家春
教授鉴定后,2007年3月移栽于华中科技大学同
济医学院苗圃内。2008年7月开花后,用改良卡
宝品红染色检查花粉发育时期,选取花粉发育处于
单核期的花蕾。
2 方法
2.1 花蕾消毒与花药的接种 将采摘的花蕾用自
来水冲洗干净,滤纸吸干后,70%乙醇处理20s,无
菌水冲洗1次,然后用01%升汞处理10min,无菌
水冲洗5遍。接种前用无菌滤纸吸干水分,剥出花
药,去除花丝,接种于含不同激素配比的 MS诱导培
养基中。另将采摘的花蕾放入4℃冰箱,分别低温
预处理0,2,4,6d。接种在 MS附加2,4D10mg
·L-1+KT20mg·L-1的培养基中,观察低温预处
理对愈伤组织形成的影响。
2.2 培养基及培养条件 以 MS培养基为基本培
养基,分别附加 KT20mg·L-1和不同质量浓度
2,4D(10,15,20,30mg·L-1)的培养基进行
花药愈伤组织的诱导培养,分化培养基采用MS+6
BA15~20mg·L-1+NAA01~03mg·L-1,
生根培养基采用1/2MS+NAA01~03mgL-1。
以上培养基中均加入3%蔗糖,06%琼脂,pH58。
培养温度(25±2)℃,诱导培养为连续暗培养2周
后转光培养,分化培养全程采用光照养,光照12h·
d-1,光强1500~2000lx,每30d继代培养1次。
2.3 愈伤组织诱导、芽的形成和生根培养 观察花
药接种后愈伤组织的生长情况,接种后30d统计不
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同2,4D浓度的 MS诱导培养基的愈伤组织诱导
率,采用诱导愈伤组织效果较好的培养基进行继代
培养。当诱导形成的胚性愈伤组织长至直径10~
30mm时,转入分化培养基。每150mL三角瓶中
接种4~5个愈伤组织。当愈伤组织长出芽后,转接
于生根培养基上进行生根培养。
2.4 再生植株的细胞学分析 对36个再生植株染
色体进行计数观察。取旺盛生长的根尖,用01%
秋水仙素水溶液预处理2h(常温),蒸馏水洗净,卡
诺氏固定液(冰醋酸无水乙醇为1∶3)中固定18~
24h,然后转入70%乙醇中4℃保存备用。制片时,
用1mol·L-1盐酸60℃解离10min,蒸馏水洗净,
用改良卡宝品红染色5min,常规方法压片,光学显
微镜下观察,统计细胞分裂中期染色体数目并拍照。
2.5 组培苗的移栽 当组培苗长出3条以上不定根
时,打开瓶盖,在室内炼苗2d后移栽至细颗粒、松软
的土壤中,适当遮光保湿,温度保持在20℃左右。
3 结果与分析
3.1 激素对愈伤组织诱导的影响 将花药接种在
MS附加不同激素浓度的培养基上,2周后观察到部
分花药体积膨大,3周后发生纵裂,形成淡黄绿色的
愈伤组织。接种后30d花药愈伤组织的诱导率结
果见表1。结果表明,附加2,4D10mg·L-1+KT
20mg·L-1的MS培养基诱导愈伤组织效果最好,
诱导率可达4107%。
表1 2,4D对花药愈伤组织诱导的影响
2,4D
/mg·L-1
KT
/mg·L-1
接种花
药数
形成愈伤
组织数
诱导率
/%
10 20 112 46 4107
15 20 118 40 3390
20 20 106 14 1321
30 20 98 14 1429
3.2 低温预处理对诱导愈伤组织的影响 湖北麦
冬花药在4℃条件下经不同时间的低温预处理,接
种在 MS附加 2,4D10mg·L-1+KT20mg·
L-1培养基上,接种后30d统计花药愈伤组织的诱
导率,见表2。结果表明,4℃低温预处理4d,愈伤
组织的诱导率最高但差别不大,低温预处理对湖北
麦冬花药诱导影响不显著。
3.3 愈伤组织的分化和再生植株的获得 将由花
药诱导产生的胚性愈伤组织转入分化培养基上进行
培养,3个月后,可见部分愈伤组织上形成绿色的芽
   表2 低温预处理对花药愈伤组织诱导的影响
4℃预处理时间/d 接种花药数 形成愈伤组织数 诱导率/%
0 106 40 3774
2 108 42 3889
4 119 46 3966
8 94 37 3936
点,芽点进一步发育,形成不定芽或芽丛。不定芽培
养基中所含细胞分裂素6BA与生长激素NAA质量
浓度比为20∶1较好。待不定芽长至2~3cm高时
将其切下,转入生根培养基上,1周后观察到部分无
根幼苗茎基部有白色愈伤组织产生,随后形成白色
的根,2周后即可获得完整的再生植株。4周时,根
长可达5cm左右。生根率可达40%。
3.4 再生植株的细胞学分析 再生植株根尖细胞
分裂中期染色体数目都为54条,见图1,和花药供
体植株染色体数目相同[6],未发现单倍体和非整倍
体。结果表明,本实验所获得的花药再生植株为体
细胞起源。
图1 再生植株细胞分裂中期染色体(比例尺=5μm)
3.5 组培苗的移栽 组培苗移入大田后,叶色浓
绿,生长良好,并对环境具有较强的适应能力。移栽
成活率为80%。
4 讨论
适合用于花药培养的花粉发育的临界时期在物
种之间是不同的。一般来说,培养处于单核中期至
晚期的花粉效果较好。因为处于花粉减数分裂时期
的幼嫩花药和花粉充满淀粉粒的较老花药都不能产
生胚状体。湖北麦冬花药小孢子大多发育异常,花
药愈伤起源于体细胞,但花药的发育时期同样对花
药出愈率有着明显影响,以小孢子处于单核期的花
药愈伤诱导率最高(4107%)。因此,湖北麦冬花
药培养以含单核期孢子的花药作外植体为适宜。
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植物花药愈伤组织形成受多种因素的制约。普
遍认为低温预处理能提高花药的诱导率[7],大多数
植物花药培养时,多进行低温预处理。本研究中,低
温预处理对湖北麦冬花药愈伤组织的诱导影响不显
著。张利平等也得到类似的结果[810],这表明不同
种类或品种花药愈伤组织形成对温度的要求不一
样。本试验在诱导愈伤的过程中除了使用不同浓度
2,4D进行筛选外,还附加了 KT20mg·L-1。
2,4D10mg·L-1与 KT20mg·L-1合用的 MS
培养基诱导胚性愈伤组织效果良好。而在分化培养
基中去掉了2,4D。2,4D若不及时去掉,则芽难以
产生。花药愈伤组织分化为植株一般需要将其转移
到含低浓度生长素和高浓度细胞分裂素的分化培养
基上,才能诱导形成完整植株。因此,本试验中采用
细胞分裂素6BA与生长激素 NAA浓度比为20∶l
的分化培养基,愈伤组织分化效果良好。
本研究的初始目的是以湖北麦冬花药为外植体
进行组织培养获得单倍体植株,但检测发现再生植
株实际上均起源于体细胞,所建立的花药培养体系
不仅污染率极低,而且体细胞胚性愈伤诱导率高、愈
伤组织的分化效果也较好,组培苗移栽后生长良好,
成活率达80%。湖北麦冬花药再生植株与供试品
种间品质差异还有待进一步研究。
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CalusinductionandplantregenerationofLiriopespicata
var.proliferaanther
ZHOUQun,ZHOUJianqiu,WANGXiaogang,WANGJingjing,LIJingwen,CHENJiachun
(HubeiKeyLaboratoryofNaturalMedicinalChemistryandResourceEvaluation,TongjiSchoolof
Pharmacy,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430030,China)
[Abstract] Objective:Tostudythetechniqueofthecalusinductionfromantherandplantregenerationofmedicinalplants
Liriopespicatavar.prolifera.Method:CaluswasinducedfromantherofL.spicatavar.proliferaonaMSmediumsupplementedwith
diferenthormones.Thesquashmethodscombinedwithamicroscopewereusedtoanalyzechromosomesofregeneratedplantlets.
Result:MS+2,4D1.0mg·L-1+KT2.0mg·L-1gavethehighestinductionratiowhichwas41.07%.MS+6BA1.52.0mg·
L-1+NAA0.10.3mg·L-1wassuitablefortheinductionandproliferationofindefinitebuds.Thebudsweretransferedto1/2MS
mediumsupplementedwithNAA0.10.3mg·L-1forrooting.Theshootsproducedrootsofcultureandformedcompleteplantlets.The
regeneratedplantletsoriginatedfromsomaticcels.Atthesametime,theefectsofpretreatmentoflowtemperatureat4℃ onthecalus
inductionwerestudiedanddiscussed.Conclusion:Thispapersetsupthemethodoftissuecultureofanthersomaticcelsandinterme
diatepropagationofL.spicatavar.prolifera.
[Keywords] Liriopespicatavar.prolifera;antherculture;calus;plantregeneration
[责任编辑 吕冬梅]
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