全 文 ：蟾毒灵血浆蛋白结合率的测定
刘颖，陈志强，陶蓓蕾，冯年平，赵继会
（上海中医药大学 中药学院，上海 ２０１２０３）
［摘要］ 目的：建立血浆中蟾毒灵浓度的分析方法，测定蟾毒灵血浆蛋白结合率。方法：采用平衡透析法测定蟾毒灵血
浆蛋白结合率，利用ＨＰＬＣ测定血浆中蟾毒灵浓度，测定并比较大鼠和人血浆中蟾毒灵的血浆蛋白结合率。结果：在０１～１０
μｇ·ｍＬ－１，药物浓度对血浆蛋白结合率无显著影响，蟾毒灵与大鼠和人的血浆蛋白结合率存在显著性差异，蟾毒灵与人血浆
蛋白结合率高于与大鼠血浆蛋白结合率。结论：蟾毒灵与血浆蛋白具有较强的结合。
［关键词］ 蟾毒灵；血浆蛋白结合率；平衡透析法
［收稿日期］ ２００９０５１０
［基金项目］ 上海市教委重点学科建设项目（Ｊ５０３０２）；上海市教委
优秀青年教师科研专项基金项目（ｓｚｙ０６０２２）
［通信作者］ 冯年平，Ｔｅｌ：（０２１）５１３２２１９８，Ｆａｘ：（０２１）５１３２２１９７，
Ｅｍａｉｌ：ｎｐｆｅｎｇ＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｍ
蟾毒灵（ｂｕｆａｌｉｎ）是从中华大蟾蜍 Ｂｕｆｏｇａｒｇａｒｉ
ｚａｎｓＣａｎｔｏｒ或黑框蟾蜍 ＢｕｆｏｍｅｌａｎｏｓｔｉｃｔｕｓＳｃｈｎｅｉｄｅｒ
皮肤腺体及耳后腺体的分泌物中提取分离出的一种
有效成分，具有较强的抗肿瘤作用，作用机制涉及诱
导细胞凋亡、分化、抑制肿瘤的血管生成等［１３］。药
物血浆蛋白结合率是药物体内重要参数之一，不仅
影响药物代谢动力学，还密切关系到药物的药理作
用强度、作用机制等。蟾毒灵的大鼠在体肠吸收研
究表明蟾毒灵在小肠吸收较好［４］，但关于蟾毒灵的
血浆蛋白结合率未见文献报道，为此，本研究采用平
衡透析法测定了蟾毒灵的血浆蛋白结合率，为其进
一步研究提供依据。
１ 材料与仪器
蟾毒灵原料（江西本草天工科技有限公司，含
量＞９８％）；蟾毒灵对照品（Ｓｉｇｍａ公司）；甲醇（色谱
纯，上海安谱科学仪器有限公司）；水为纯化水；其
余试剂均为分析纯；正常人血浆由上海浦东新区血
站提供。
Ａｎｇｉｌｅｎｔ１２００ｓｅｒｉｅｓ高效液相色谱仪；Ａｇｉｌｅｎｔ
Ｇ１３１４Ａ紫外检测器；ＢＰ２１０Ｓ电子天平（德国Ｓａｒｔｏ
ｒｉｕｓ）；ＰＨＳ３Ｓ型ｐＨ计（上海精密科学仪器有限公
司）；ＤＫＢ５０１Ａ型超级恒温水槽（上海精宏实验设
备有限公司）；ＸＷ８０旋涡混合器（上海医科大学仪
器厂）；ＴＧＬ１６Ｂ离心机（上海安亭科学仪器厂）；透
析袋（截留相对分子质量１２０００～１４０００，上海源聚
生物科技有限公司）。
ＳＤ大鼠，２００±２０ｇ，清洁级，雄性，上海中医药
大学实验动物中心提供，合格证号：ＳＣＸＫ（沪）２００３
０００２。
２ 方法与结果
２．１ 溶液的配制
空白透析液的配制：每１０００ｍＬ内含磷酸氢二
钾１４１１ｇ，磷酸二氢钾２５９ｇ，氯化钠１９９ｇ（ｐＨ
７４）。蟾毒灵标准溶液的配制：精密称取蟾毒灵对
照品５０ｍｇ，于１０ｍＬ量瓶中，用甲醇溶解并稀释
至刻度，摇匀，得蟾毒灵贮备液（０５ｍｇ·ｍＬ－１），于
４℃冰箱保存。分别用蒸馏水稀释配制成 ２５，
６２５，２５，５０，１００，１５０，２５０μｇ·ｍＬ－１标准系列溶液
Ａ；用空白透析液配制成１２５，２５，５，１２５，２０，２５ｎｇ
·μＬ－１标准系列溶液Ｂ。
２．２ 分析方法的建立
２．２．１ 色谱条件 ＤｉａｍｏｎｓｉｌＣ１８色谱柱（４６ｍｍ×
２５０ｍｍ，５μｍ）；流动相甲醇水（７０∶３０）；流速 １０
ｍＬ·ｍｉｎ－１；柱温 ３０℃；检测波长 ３００ｎｍ；进样量
２０μＬ。
２．２．２ 透析液样品的预处理 精密取血浆样品
（透析内液）或透析外液样品０５ｍＬ，涡旋混匀后加
入乙醚醋酸乙酯（４∶１）２ｍＬ，涡旋３ｍｉｎ，于３０００ｒ
·ｍｉｎ－１离心１０ｍｉｎ，将上层有机相转移至离心管
中，室温下氮气吹干，加入甲醇水（７０∶３０）１００μＬ，
超声１ｍｉｎ，涡旋１０ｓ，于１３０００ｒ·ｍｉｎ－１离心 １０
ｍｉｎ，取上清液２０μＬ进样。
２．２．３ 方法学验证 分别取空白血浆、空白透析液
５１
第３４卷第２１期
２００９年１１月
Ｖｏｌ．３４，Ｉｓｓｕｅ ２１
Ｎｏｖｅｍｂｅｒ，２００９
及含蟾毒灵的血浆样品或透析液样品，按照２２２
项下方法处理，在２２１色谱条件下测定，色谱图如
图１所示。空白血浆、空白透析液在此条件下对蟾
毒灵的测定无干扰。
ⅠＡ．空白大鼠血浆；ⅠＢ．空白大鼠血浆＋蟾毒灵；ⅠＣ．透析内液大鼠血浆样品；ⅡＡ．空白人血浆；ⅡＢ．空白人血浆＋蟾毒灵；
ⅡＣ．透析内液人血浆样品；ⅢＡ．空白透析液；Ⅲ Ｂ．空白透析液＋蟾毒灵；Ⅲ Ｃ．透析外液样品。
图１ 蟾毒灵色谱图
透析内液：分别取空白大鼠血浆０５ｍＬ，加入
蟾毒灵标准系列溶液 Ａ２０μＬ，配制成蟾毒灵质量
浓度为０１，０２５，１０，２０，４０，６０，１０μｇ·ｍＬ－１
的血浆标准溶液，按照２２２项下方法操作，进样，
测定。以蟾毒灵的峰面积（Ｙ）对血浆中蟾毒灵浓度
（Ｃ）作线性回归，得蟾毒灵的标准曲线方程为：Ｙ＝
４５０５８Ｃ＋６６５２６，ｒ＝０９９９１（ｎ＝６）。线性范围
０１～１０μｇ·ｍＬ－１。定量限为 ０１μｇ·ｍＬ－１。
高、中、低３种质量浓度（０２５，４，１０μｇ·ｍＬ－１）的
样品方法回收率为９４３％ ～１０４０％（ｎ＝５），提取
回收率分别为：（８０５±４４）％，（８２６±６１）％，
（７９８±８５）％。日内精密度 ＲＳＤ均小于 ６％、日
间精密度ＲＳＤ均小于９％（ｎ＝６）。
透析外液：分别取空白透析液０５ｍＬ，加入蟾
毒灵标准系列溶液 Ｂ２０μＬ，配制成蟾毒灵质量浓
度为００５，０１，０２，０５，０８，１０μｇ·ｍＬ－１的透析
标准溶液，按照 ２２２项下方法操作，进样，测定。
以蟾毒灵的峰面积（Ｙ）对血浆中蟾毒灵浓度（Ｃ）作
线性回归，得蟾毒灵的标准曲线方程为：ｒ＝３７４９Ｃ
＋１２６８３，ｒ＝０９９９２（ｎ＝６）。线性范围 ００５～
１０μｇ·ｍＬ－１。定量限为００５μｇ·ｍＬ－１。高、中、
低３种质量浓度（０１，０５，１０μｇ·ｍＬ－１）的方法
回收率为９７３％ ～１０１８％（ｎ＝５），提取回收率分
别为：（７２３±５１）％，（７５０±４４）％ ，（８１８±
７２）％。日内精密度ＲＳＤ均小于５％、日间精密度
ＲＳＤ均小于１０％（ｎ＝６）。
２．３ 蟾毒灵血浆蛋白结合率的测定
２．３．１ 实验方法 平衡透析法：实验前先将透析
袋预处理后在空白透析液中室温浸泡２４ｈ。取一端
扎紧的透析袋，除去袋内外水份，精密吸取１ｍＬ空
白血浆加至透析袋中，扎紧袋口，悬浮于盛有２０ｍＬ
含药透析液的蓝盖试剂瓶中，调整透析袋位置，透析
袋内外液面应保持同一水平，并避免贴瓶壁，密封瓶
口，置于３７℃ 恒温水浴中放置２４ｈ（注：在考察平
衡时间对血浆蛋白结合率的影响实验中，按照指定
时间放置）。透析结束时，吸取透析外液，加入等量
６１
第３４卷第２１期
２００９年１１月
Ｖｏｌ．３４，Ｉｓｓｕｅ ２１
Ｎｏｖｅｍｂｅｒ，２００９
３％三氯醋酸溶液检查是否有血浆蛋白漏出，若有白
色絮状物析出，则该样品作废［５］。无血浆蛋白漏出
者，分别取透析袋内外样品并测定药物浓度，血浆蛋
白结合率的计算公式如下［６］，其中，Ｄｔ为透析袋内血
浆药物浓度，Ｄｆ为透析外液药物浓度。
血浆蛋白结合率＝
（Ｄｔ－Ｄｆ）
Ｄｔ
×１００％
２．３．２ 透析膜物理吸附的考察 参照文献方法
［７］，考察透析膜对药物的物理吸附作用。结果为
透析平衡后低、中、高３种质量浓度（０１，０５，１０
μｇ·ｍＬ－１）的样品透析膜吸附率（透析膜吸附的药
物量占总药物量的百分比）分别为 （３３８±
１５５）％，（２８５±１６１）％，（２９２±１３８）％，表明
存在微量吸附作用，并且吸附作用不受浓度的影响，
但对测定结果无显著影响，因此，透析膜对药物的物
理吸附作用可忽略不计。
２．３．３ 平衡时间的考察 取空白透析液１ｍＬ加至
透析袋中，扎紧袋口，分别置于 ２０ｍＬ蟾毒灵为
０１，０５，１０μｇ·ｍＬ－１透析液中（ｎ＝３），按照
２３１方法操作，分别于８，１２，２４，３２ｈ结束实验，按
照２２２项下方法操作，分别测定透析袋内外的蟾
毒灵浓度，计算血浆蛋白结合率。结果如图２所示。
结果表明：蟾毒灵透析达到平衡时间约为２４ｈ。
图２ 蟾毒灵在不同时间下的血浆蛋白结合率
（珋ｘ±ｓ，ｎ＝３）
２．３．４ 不同因素对药物血浆蛋白结合率的影响
药物浓度：精密吸取空白血浆１ｍＬ加至透析袋中，
扎紧袋口，分别置于２０ｍＬ含蟾毒灵０１，０５，１０
μｇ·ｍＬ－１透析液中（ｎ＝３），按照２３１方法操作，
分别测定透析袋内外的蟾毒灵浓度，计算血浆蛋白
结合率。低、中、高３种浓度样品血浆蛋白结合率分
别为：（９０８±１７）％，（９００±０８）％，（８９１±
０７）％。经统计分析，结果无显著性差异（Ｐ＞
００５），表明在该浓度范围内浓度因素对大鼠血浆
蛋白结合率无显著性影响。
血浆种类：人血浆作为透析内液（ｐＨ７４），按
照２２３项下透析内液的处理方法，将空白大鼠血
浆替换为正常人血浆，其余方法相同，制备的标准曲
线方程为：Ｙ＝６８０６１Ｃ－１４８５１，ｒ＝０９９９６（ｎ＝
６）。线性范围０１～１０μｇ· ｍＬ－１。定量限为０１
μｇ·ｍＬ－１。高、中、低３种质量浓度（０２５，４，１０μｇ
·ｍＬ－１）的样品方法回收率为 ９４３％ ～１０４０％
（ｎ＝５），提取回收率分别为 （８０５±４４）％，
（８２６±６１）％，（７９８±８５）％。日内精密度 ＲＳＤ
均小于９％、日间精密度 ＲＳＤ均小于１１％（ｎ＝６）。
考察在低、中、高３种质量浓度下（０１，０５，１０μｇ
·ｍＬ－１）蟾毒灵与人血浆蛋白结合率，结果分别为
（９８５±０８）％，（９７２±０７）％，（９７４±１４）％。
经过ｔ检验分析，无显著性差异（Ｐ＞００５），表明在
０１～１０μｇ·ｍＬ－１，浓度因素对人血浆蛋白结合
率无显著性影响。
经过ｔ检验分析比较蟾毒灵与大鼠和人的血浆
蛋白结合率，结果存在显著性差异（Ｐ＜００５），表明
不同种属之间的血浆蛋白结合率是不同的，蟾毒灵与
人血浆蛋白结合率要高于与大鼠的血浆蛋白结合率。
３ 讨论
３．１ 目前，国内外研究药物血浆蛋白结合率测定方
法包括平衡透析法、超滤法、超速离心法、透析法、光
谱法等［８９］，其中，平衡透析法是测定血浆蛋白结合
率的经典方法，较为常用，该法的优点是可以在平衡
状态下测定透析袋内外药物的浓度，根据公式计算
即可知药物的血浆蛋白结合率，操作方法简单［１０］。
采用平衡透析法测定药物的血浆蛋白结合率时，透
析膜的截留相对分子质量大小对实验结果将产生一
定的影响。血浆中参与与药物结合的蛋白有：白蛋
白（相对分子质量６５０００Ｄａ）、酸性糖蛋白（相对分子
质量４４０００Ｄａ），脂蛋白（相对分子质量 ２０００００～
３４０００００Ｄａ），其中前两者是最重要的与药物结合
的蛋白组分。合适的透析袋应该既能确保药物分子
能够及时释放、对药物的物理吸附低，又要确保血浆
中的成分及内源性物质在透析的过程中能较稳定存
在于透析袋内，避免大量进入透析外液，尽可能地接
近体内环境，同时保持恒定的环境温度、ｐＨ值、离子
强度，在此基础上体外测得的数据才能最大限度地
反映体内情况。本实验中采用截留相对分子质量为
７１
第３４卷第２１期
２００９年１１月
Ｖｏｌ．３４，Ｉｓｓｕｅ ２１
Ｎｏｖｅｍｂｅｒ，２００９
１２０００～１４０００的透析膜进行实验，由 ＨＰＬＣ图可
知，与空白透析液的样品相比，透析外液的样品图谱
基线较平稳，无明显杂质峰，表明血浆中并无大量内
源性物质从透析袋中渗出。此外，透析袋对药物的
吸附微量，不影响测定结果，表明采用该型号的透析
膜以平衡透析法测定蟾毒灵的血浆蛋白结合率是可
行的。
３．２ 本实验根据相关参考文献设定了用于血浆蛋
白结合实验的蟾毒灵浓度范围［１１１２］。本实验结果
表明，蟾毒灵与人血浆蛋白结合率约为９７％ ，属于
高血浆蛋白结合，且在实验浓度内蛋白结合率与透
析液中药物浓度无关。由血中游离药物的作用机制
可知，高结合率药物只有少部分游离药物作为活性
药物分子参与体内药物处置，继而发生药理效应，在
体内受病理因素或其他因素影响若药物血浆蛋白结
合率发生变化时，可能对药物的药理作用产生影响，
如存在竞争结合蛋白位点的物质将药物置换后，游
离型的药物浓度增加，易导致毒性反应。因此，在其
应用时应注意病理因素及与其他药物合用时对血浆
蛋白结合率的影响。值得注意的是药理效应的变化
除了受药物血浆蛋白结合的影响之外，还与药物与
蛋白的结合性质、治疗浓度范围、内在清除率、分布
容积、药动药效平衡时间、给药方式等都有关
系［１８］。所以，在合理分析药物血浆蛋白结合对药效
或毒性的影响时，同时也要考虑其他影响因素。蟾
毒灵的体内行为有待于进一步研究。
［参考文献］
［１］ ＮｕｍａｚａｗａＳ，ＩｎｏｕｅＮ，ＮａｋｕｒａＨ，ｅｔａｌ．Ａｃａｒｄｉｏｔｏｎｉｃｓｔｅｒｏｉｄ
ｂｕｆａｌｉｎｉｎｄｕｃｅｄｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆＴＨＰ１ｃｅｌｓ．Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔｏｆ
Ｎａ＋，Ｋ＋ＡＴＰａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｉｎｔｈｅｅａｒｌｙｃｈａｎｇｅｓｉｎｐｒｏｔｏｏｎｃｏ
ｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ［Ｊ］．ＢｉｏｃｈｅｍＰｈａｒｍａｃｏｌ，１９９６，５２（２）：３２１．
［２］ 赵建斌，崔勤，王文亮．蟾毒灵诱导人急性早幼粒细胞性白血
病细胞凋亡的实验观察［Ｊ］．解放军药学学报，２００４，２０（３）：
１６１．
［３］ ＬｅｅＤＹ，ＹａｓｕｄａＭ，ＹａｍａｍｏｔｏＴ，ｅｔａｌ．Ｂｕｆａｌｉｎｉｎｈｉｂｉｔｓｅｎｄｏ
ｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｎｄａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓｉｎｖｉｔｒｏ［Ｊ］．ＬｉｆｅＳｃｉ，
１９９７，６０（２）：１２７．
［４］ 刘颖，冯年平，许洁，等．蟾毒灵的大鼠在体肠吸收研究［Ｊ］．
时珍国医国药，２００９，２０（２）：４２８．
［５］ 李艳凤，马超，马英丽，等．香叶木苷的血浆蛋白结合率研究
［Ｊ］．哈尔滨商业大学学报：自然科学版，２００８，２４（１）：７．
［６］ 刘晓，陈晓辉，刘文涛，等．阿比朵尔人血浆蛋白结合率的测
定［Ｊ］．中国新药与临床杂志，２００７，２６（２）：１１５．
［７］ 卢来春，蒋学华，杨俊毅，等．阿莫西林对格列美脲血浆蛋白
结合率的影响［Ｊ］．华西药学杂志，２００３，１８（４）：２４６．
［８］ ＢｅｒｔｕｃｃｉＣ，ＤｏｍｅｎｉｃｉＥ．Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅａｎｄｃｏｖａｌｅｎｔｂｉｎｄｉｎｇｏｆ
ｄｒｕｇｓｔｏｈｕｍａｎｓｅｒｕｍａｌｂｕｍｉｎ：ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｃａｌａｐｐｒｏａｃｈｅｓａｎｄ
ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｒｅｌｅｖａｎｃｅ［Ｊ］．ＣｕｒＭｅｄＣｈｅｍ，２００２，９（１５）：
１４６３．
［９］ 周大炜．药物蛋白结合作用的分析方法研究［Ｊ］．色谱，
２００４，２２（２）：１１６．
［１０］ 韩雯，傅韶，方晓玲．三七皂苷中人参皂苷Ｒｇ１与Ｒｂ１口服吸
收及其体内药代动力学的研究和比较［Ｊ］．药学学报，２００７，
４２（８）：８４９．
［１１］ 张莉，白雪，齐刚，等．ＲＰＨＰＬＣ法测定大鼠血清中蟾蜍灵浓
度［Ｊ］．药物分析杂志，２００４，２４（５）：５２３．
［１２］ 苏永华，黄雪强，张大志，等．华蟾素注射液中蟾毒内酯类成
分含量检测［Ｊ］．中成药，２００３，２５（１）：２４．
［１３］ 郭宾，李川药物与血浆蛋白结合的药理学基础及其研究进
展［Ｊ］中国临床药理学与治疗学，２００５，１０（３）：２４１
Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｐｌａｓｍａｐｒｏｔｅｉｎｂｉｎｄｉｎｇｒａｔｅｏｆｂｕｆａｌｉｎ
ＬＩＵＹｉｎｇ，ＣＨＥＮＺｈｉｑｉａｎｇ，ＴＡＯＢｅｉｌｅｉ，ＦＥＮＧＮｉａｎｐｉｎｇ，ＺＨＡＯＪｉｈｕｉ
（ＳｈａｎｇｈａｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，Ｓｈａｎｇｈａｉ２０１２０３，Ｃｈｉｎａ）
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏｓｔｕｄｙｐｌａｓｍａｐｒｏｔｅｉｎｂｉｎｄｉｎｇｒａｔｅｏｆｂｕｆａｌｉｎ．Ｍｅｔｈｏｄ：ＨＰＬＣｗａｓｅｍｐｌｏｙｅｄｔｏｄｅｔｅｒｍｉｎｅｔｈｅｃｏｎ
ｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｂｕｆａｌｉｎ．Ｐｌａｓｍａｐｒｏｔｅｉｎｂｉｎｄｉｎｇｒａｔｅｓｔｕｄｉｅｓｗｅｒｅｃｏｎｄｕｃｔｅｄｂｙｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍｄｉａｌｙｓｉｓｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｅｉｎｆｌｕｅｎｃｅｏｆｄｒｕｇｃｏｎｃｅｎ
ｔｒａｔｉｏｎａｎｄｐｌａｓｍａｉｎｄｉｆｅｒｅｎｔｓｐｅｃｉｅｓｏｎｐｌａｓｍａｐｒｏｔｅｉｎｂｉｎｄｉｎｇｒａｔｅｗｅｒｅｓｔｕｄｉｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔ：Ｔｈｅｒｅｗａｓｎｏｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｅｒｅｎｃｅｉｎｔｈｅ
ｐｌａｓｍａｐｒｏｔｅｉｎｂｉｎｄｉｎｇｒａｔｅｓａｔｌｏｗ，ｍｉｄｄｌｅａｎｄｈｉｇｈｂｕｆａｌｉｎｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｉｎｄｉｌｕｔｉｏｎｍｅｄｉｕｍ．Ｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎｂｉｎｄｉｎｇｒａｔｅｏｆｂｕｆａｌｉｎｉｎ
ｈｕｍａｎｐｌａｓｍａｗａｓｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｉｎｔｈｅｒａｔｐｌａｓｍａ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｂｕｆａｌｉｎｈａｓｈｉｇｈｅｒｐｒｏｔｅｉｎｂｉｎｄｉｎｇｅｘｔｅｎｔｗｉｔｈｂｏｔｈｒａｔｐｌａｓｍａａｎｄｈｕ
ｍａｎｐｌａｓｍａ．
［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］ ｂｕｆａｌｉｎ；ｐｌａｓｍａｐｒｏｔｅｉｎｂｉｎｄｉｎｇｒａｔｅ；ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍｄｉａｌｙｓｉｓｍｅｔｈｏｄ
［责任编辑 张宁宁］
８１
第３４卷第２１期
２００９年１１月
Ｖｏｌ．３４，Ｉｓｓｕｅ ２１
Ｎｏｖｅｍｂｅｒ，２００９