全 文 ：明党参遗传多样性的 ＳＲＡＰ分子标记
王长林，郭巧生，武玉妹
（南京农业大学 中药材研究所，江苏 南京 ２１００９５）
［摘要］ 目的：研究明党参的遗传多样性，为明党参种质资源利用提供理论依据。方法：以１０个不同居群的明党参为材
料，通过ＳＲＡＰ分析，计算各样品间的遗传相似系数，在此基础上采用ＵＰＧＭＡ方法进行聚类，构建树状图。结果：从１６０个引
物组合中筛选得到１７个多态性引物组合，共检测到３６３个基因位点，其中多态性位点有３１４个，平均每个引物组合产生１８４７
个多态性位点，多态性位点百分率为８６５０％，显示了较高的多态性比率；各居群遗传相似系数在０４９５９～０８１８２；根据聚
类结果可将１０个不同居群的明党参分为两大类。结论：明党参不同居群间具有高度的遗传多样性；不同居群的亲缘关系与其
地理分布有一定的相关性。
［关键词］ 明党参；遗传多样性；ＳＲＡＰ
［收稿日期］ ２００９０３２６
［基金 项 目］ 国 家 科 技 攻 关 计 划 项 目 （２００１ＢＡ７０１Ａ５９；
２００１ＢＡ７０１Ａ６２０４）
［通信作者］ 郭巧生 ，Ｔｅｌ：（０２５）８４３９６５９１，Ｅｍａｉｌ：ｇｑｓ＠
ｎｊａｕｅｄｕｃｎ
明党参ＣｈａｎｇｉｕｍｓｍｙｒｎｉｏｉｄｅｓＷｏｌｆ为我国特有
的伞形科单种属植物［１］，１９８４年被国家列为三级珍
稀濒危植物［２］。其药用部位为干燥根，具有润肺化
痰、养阴和胃、平肝、解毒的功效，用于肺热咳嗽、呕
吐反胃、食少口干、目赤眩晕、疔毒疮疡［３］。明党参
主要分布在浙江西北部、江苏西南部和安徽的东南
部，向西可延伸到江西北部及湖北东南部。邱英雄
等在明党参的资源状况、种群生态、遗传多样性和遗
传结构等方面研究了明党参的濒危机制和保护对
策［４５］，并通过分子鉴定的 ＩＳＳＲ分析认为明党参的
遗传变异主要存在于不同群体间［６］。潘泽惠等［７］
对明党参的系统演化进行了研究，认为在地理分布
上初步显示了明党参属从西向东扩散迁移的演化路
线。厉彦森等［８］对野生明党参居群生物学特征进
行了调查比较，并通过明党参的酯酶同工酶电泳酶
谱探讨了明党参野生居群间的亲缘关系。
ＳＲＡＰ分子标记操作简便迅速、成本低、可靠性
好、重复性高，是近几年发展起来的一种新型分子标
记技术，已成功应用于多种植物的遗传图谱构建、遗
传多样性分析、基因定位及比较基因组学等方面，在
药用植物遗传物质分析上有着广阔的应用前景。目
前，该项技术已在部分药用植物上得以应用，建立了
一些药用植物 ＳＲＡＰ分析的反应体系［９］，并进行了
一些药用植物的遗传多样性分析［１０１３］。本研究将
ＳＲＡＰ分子标记技术首次应用于明党参的遗传多样
性分析，以便为明党参种质资源利用提供理论依据。
１ 材料与方法
１１ 材料 实验用明党参样品来源见表１，原植物
经郭巧生教授鉴定均为伞形科植物明党参Ｃｓｍｙｒ
ｎｉｏｉｄｅｓ。各居群多点随机取样 ３０株，盆栽成活后，
随机取样１０株幼嫩茎叶，混合后趁鲜提取ＤＮＡ。
表１ 明党参供试样品及来源
Ｎｏ．
样品
名称
样品来源
样品采集点地理信息
经度Ｅ 纬度Ｎ 海拔／ｍ
１ 大龙山 安徽安庆大龙山 １１６°５４＇３０°３６＇７９．５～８３．２
２ 青龙山 江苏高淳青龙山 １１８°５８＇３１°５８＇８８．９～９７．５
３ 茅山 江苏句容茅山 １１９°１８＇３１°４７＇９６．５～１１８．３
４ 浮山 江苏
$
水浮山 １１９°１０＇３１°４１＇９２．３～１０１．１
５ 红山 江苏句容红山栽培基地 １１９°１３＇３１°４２＇４１．３～４１．８
６ 老山 南京江浦老山 １１８°３５＇３２°０５＇８８．７～９５．３
７ 紫金山 南京紫金山 １１８°２８＇３２°０２＇７１．６～９４．３
８ 九华山 安徽青阳九华山 １１７°４５＇３０°３７＇４９．２～５５．９
９ 琅琊山 安徽滁州琅琊山 １１８°１７＇３２°１７＇６７．６～７４．２
１０南高峰 浙江杭州南高峰 １２０°０８＇３０°１３＇５２．３～６５．１
１２ 试剂与仪器 ＣＴＡＢ，Ｔｒｉｓ，ＥＤＴＡ，氯仿，乙醇，
ＮａＣｌ，丙烯酰胺等试剂（分析纯）；ＲＮＡ酶，ｄＮＴＰｓ，
Ｔａｑ酶，ＤＮＡｍａｒｋｅｒ（ＰＵＣ１８ＤＮＡ／Ｍｓｐｌ）（均购自北
京天根生化科技有限公司）；ＳＲＡＰ引物（上海英俊
生物技术有限公司合成）；超纯水；高速冷冻离心
机，ＰＴＣ２００型ＰＣＲ仪（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ公司），ＪＹ６００Ｃ
电泳仪。
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１３ ＤＮＡ提取 采用 ＣＴＡＢ法提取明党参基因组
ＤＮＡ，运用 ＴＥ缓冲液置于４℃条件下保存。紫外
检测所保存的 ＤＮＡ浓度，稀释成 ２５ｍｇ·Ｌ－１的
ＤＮＡ模板，４℃保存备用。
１４ ＰＣＲ扩增和引物筛选 ＰＣＲ反应体系总体积
２０μＬ，其中 １０×Ｂｕｆｌｅ２０μＬ；ｄＮＴＰ（１０ｍｍｏｌ·
Ｌ－１）０５μＬ；Ｍｇ２＋（２５ｍｍｏｌ·Ｌ－１）１６μＬ；引物（１０
μｍｏｌ·Ｌ－１）０６μＬ；Ｔａｑ酶（５Ｕ·μＬ－１）０２μＬ；
ＤＮＡ（２５ｍｇ·Ｌ－１）２μＬ。ＰＣＲ程序为：９４℃预变性
５ｍｉｎ；９４℃变性１ｍｉｎ，３５℃复性１ｍｉｎ，７２℃延伸
１ｍｉｎ，５个循环；９４℃变性１ｍｉｎ，５０℃复性１ｍｉｎ，
７２℃延伸１ｍｉｎ，３５个循环；７２℃延伸７ｍｉｎ，４℃保
存。从ＭＥ１ＭＥ２０与 ＥＭ１ＥＭ８共１６０个引物组合
中，筛选出条带清晰、重复性好、多态性丰富的引物
组合，用于ＳＲＡＰＰＣＲ扩增。
１５ ＳＲＡＰ扩增产物的电泳检测 取６μＬ扩增产
物与２μＬ溴酚蓝混合后用于 ５％聚丙烯酰胺凝
胶电泳分析，电泳缓冲液为 １×ＴＢＥ。电泳时，用
６０Ｖ的电压预电泳３０ｍｉｎ，上样后用１２０Ｖ的电
压电泳约１ｈ。电泳结束后通过固定（１０％无水
乙醇 ＋０５％醋酸，１５ｍｉｎ），银染（０２％硝酸银，
１５ｍｉｎ），洗涤（蒸馏水，２～３次），显色（４００ｍＬ
蒸馏水 ＋６ｇ氢氧化钠 ＋４４ｍＬ甲醛 ＋１００μＬ
１％硫代硫酸钠，２０ｍｉｎ）等步骤得到扩增结果，
将结果拍照保存。
１６ 数据记录与处理 实验中以 ＰＵＣ１８ＤＮＡ／
Ｍｓｐｌ作相对分子质量标记，电泳图谱中的每一条带
均视为１个分子标记。每个样品的扩增带按有或无
记录，有带赋值为１，无带赋值为０，得到原始数据矩
阵。用ＰｏｐＧｅｎ３２软件计算各样品间的遗传相似系
数，用 ＮＴｓｙｓｐｃ２０２软件 ＵＰＧＭＡ方法进行聚类，
构建树状图。
２ 结果与分析
２１ ＳＲＡＰ引物筛选 从１６０个引物组合中，共筛
选出１７个条带清晰、重复性好、多态性丰富的引物
组合，见表２，３。进行ＳＲＡＰＰＣＲ扩增。
表２ 明党参ＳＲＡＰ分析所用引物及其序列
引物 序列 引物 序列
ＭＥ２ ５′ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＡＧＣ３′ ＭＥ１５ ５′ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＴＣＡ３′
ＭＥ５ ５′ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＴＧＣ３′ ＭＥ１８ ５′ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＧＧＴ３′
ＭＥ７ ５′ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＡＣＧ３′ ＭＥ２０ ５′ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＣＡＴ３′
ＭＥ９ ５′ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＡＡＣ３′ ＥＭ１ ５′ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＣＡＡ３′
ＭＥ１０ ５′ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＡＡＴ３′ ＥＭ３ ５′ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＧＡＣ３′
ＭＥ１１ ５′ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＡＡＧ３′ ＥＭ５ ５′ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＡＡＣ３′
ＭＥ１２ ５′ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＴＡＧ３′ ＥＭ６ ５′ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＧＣＡ３′
ＭＥ１３ ５′ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＴＴＧ３′ ＥＭ７ ５′ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＧＡＧ３′
ＭＥ１４ ５′ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＴＧＴ３′ ＥＭ８ ５′ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＧＣＣ３′
表３ １７个引物组合的扩增
引物
组合
总位
点数
多态性
位点数
引物
组合
总位
点数
多态性
位点数
ＭＥ２／ＥＭ６ １５ １２ ＭＥ１３／ＥＭ６ ２３ ２３
ＭＥ５／ＥＭ３ １７ １７ ＭＥ１３／ＥＭ７ ２５ ２２
ＭＥ７／ＥＭ６ １９ １７ ＭＥ１４／ＥＭ６ ２２ １６
ＭＥ９／ＥＭ１ ２０ １７ ＭＥ１４／ＥＭ７ ２５ ２５
ＭＥ１０／ＥＭ１ ２１ １７ ＭＥ１５／ＥＭ６ ２３ ２１
ＭＥ１０／ＥＭ８ ２６ ２４ ＭＥ１８／ＥＭ１ ２１ ２０
ＭＥ１１／ＥＭ１ １９ １６ ＭＥ２０／ＥＭ５ ２１ ２０
ＭＥ１２／ＥＭ６ ２２ １６ ＭＥ２０／ＥＭ７ ２４ １７
ＭＥ１２／ＥＭ７ ２０ １４ 合计 ３６３ ３１４
２２ ＳＲＡＰ扩增结果的多态性分析 ＳＲＡＰ扩增结
果见图１。统计表明１７个引物组合共产生３６３个
清晰位点，平均每个引物产生２１４个。其中，多态
性条带 ３１４个，每个引物组合的多态性条带数在
１２～２５条不等，平均每个引物组合产生１８４７条多
态性位点。多态性位点百分率为８６５０％，显示了
较高的多态性水平。明党参的总基因多样性指数
Ｈｔ为０３２５４（ＳＤ＝００２８９）。
图１ 明党参ＳＲＡＰ分析ＰＣＲ扩增
（引物组合为ＭＥ１４／ＥＭ６）
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２３ 亲缘关系的聚类分析 对供试的明党参材料
基于上述１７个引物组合产生的３６３个标记数据，用
ＰｏｐＧｅｎ３２软件计算各样品间的遗传相似系数，见
表４，用ＮＴｓｙｓｐｃ２０２软件ＵＰＧＭＡ方法进行聚类，
构建树状图，见图２。１０个居群的明党参遗传相似
系数在０４９５９～０８１８２。在遗传相似系数０５８
的水平上，可将１０个居群的明党参分成２个大类：
Ⅰ类和Ⅱ类。Ⅰ类包括Ａ，Ｂ２个小类，Ａ类包括浮山
和红山２个居群，其遗传相似系数为０７５４８，Ｂ类可
分成Ｃ，Ｄ２个小类，Ｃ类包括青龙山、紫金山、老山和
茅山４个居群，其中青龙山和紫金山２个居群相似系
数为０８１８２，亲缘关系最近，Ｄ类包括琅琊山和大龙
山２个居群，遗传相似系数为０７２１８；Ⅱ类包括九华
山和南高峰２个居群，其遗传相似系数为０７７６９。
表４ 明党参各样品之间的遗传相似系数
样品 浮 山 红山 青龙山 紫金山 老山 茅山 琅琊山 大龙山 九华山 南高峰
浮山 １．００００
红山 ０．７５４８ １．００００
青龙山 ０．６９７０ ０．７２７３ １．００００
紫金山 ０．６８０４ ０．６７２２ ０．８１８２ １．００００
老山 ０．６１７１ ０．６０３３ ０．７１６３ ０．７４９３ １．００００
茅山 ０．５９２３ ０．６１７１ ０．６６９４ ０．６６９４ ０．７４９３ １．００００
琅琊山 ０．５８６８ ０．６０６１ ０．６５２９ ０．６５２９ ０．６８８７ ０．６９１５ １．００００
大龙山 ０．５７３０ ０．５９７８ ０．６４４６ ０．６６１２ ０．６５８４ ０．６３９１ ０．７２１８ １．００００
九华山 ０．５３１７ ０．５５１０ ０．５９２３ ０．５７５８ ０．６１７１ ０．６３０９ ０．６２５３ ０．７１６３ １．００００
南高峰 ０．５３４４ ０．５５９２ ０．５１７９ ０．４９５９ ０．５６４７ ０．５７８５ ０．５５１０ ０．６０３３ ０．７７６９ １．００００
图２ 明党参遗传相似系数聚类分析图
３ 讨论
３１ 明党参居群间亲缘关系与其地理分布 厉彦
森等［８］通过明党参酯酶同工酶分析认为，不同产地
明党参居群间亲缘关系的远近，与其自然地理区域
有着极大的一致性，地理区域越近的地区居群，亲缘
关系越近，差异越小，而相隔越远，则差异越大。本
研究的１０个明党参居群 ＳＲＡＰ聚类分析结果进一
步证明了此观点，即不同居群明党参的亲缘关系与
其地理分布有一定的相关性。地理位置相近的浮山
和红山２个居群聚为一小类，南京附近的青龙山、紫
金山、老山和茅山４个居群也聚成一小类，而与其地
理位置较远的杭州南高峰和安徽九华山２个居群均
与它们遗传距离较远。
３２ 明党参的遗传多样性 邱英雄等［６］研究表
明，明党参居群间的遗传多样性显著高于居群内的
遗传多样性。陶晓瑜等［１４］也认为，明党参居群全基
因组水平的基因位点存在丰富的遗传变异，居群
ＤＮＡ水平涵盖较高的遗传变异。本研究检测到我
国明党参主要分布区不同居群间的多态性位点百分
率高达８６５０％，总基因多样性指标 Ｈｔ为０３２５４，
亦表明明党参的总遗传变异较高，这与前面的研究
结果一致。明党参对生境要求极高，喜凉爽湿润，怕
高温高湿，在自然条件下，其分布范围狭窄且封闭，
居群间基因交流机率很低，各居群在长期的演化过
程中自成体系。另外，明党参又是典型的异花授粉
植物，居群内基因交流濒繁，造成居群内个体之间遗
传的相似性较高。明党参这种自然的地理隔离一定
程度上形成了各分布区特有的种质资源，为明党参
优良品种的选育提供了良好的基础。
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ＧｅｎｅｔｉｃｄｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＣｈａｎｇｉｕｍｓｍｙｒｎｉｏｉｄｅｓｂａｓｅｄｏｎＳＲＡＰ
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［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＴｏｓｔｕｄｙｔｈｅｇｅｎｅｔｉｃｄｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＣｈａｎｇｉｕｍｓｍｙｒｎｉｏｉｄｅｓａｎｄｇｉｖｅａｒｅｆｅｒｅｎｃｅｆｏｒｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｇｅｒｍ
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ｗａｓａｂｕｎｄａｎｔｇｅｎｅｔｉｃｄｉｖｅｒｓｉｔｙａｍｏｎｇｔｈｅｔｅｓｔｅｄｍａｔｅｒｉａｌｓ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓｉｍｉｌａｒｉｔｙｃｏｅｆｉｃｉｅｎｔｗａｓｒａｎｇｅｄｆｒｏｍ０．４９５９ｔｏ０．８１８２．Ｃｌｕｓｔｅｒ
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