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Effects of Gaultheria yunnanensis on adjuvant arthritis in rats

滇白珠抗风湿性关节炎活性成分研究



全 文 :滇白珠抗风湿性关节炎活性成分研究
熊玉兰1,肖冰1,马小军2,李长龄1,郑俊华3,叶加1
(1.北京大学 药学院 分子与细胞药理学系,北京 100191;
2.中国医学科学院 药用植物研究所,北京 100193;
3.北京大学 药学院 天然药物学系,北京 100191)
[摘要] 目的:对滇白珠的各提取液进行抗大鼠佐剂性关节炎活性筛选,为临床应用滇白珠治疗风湿性关节炎提供实验
基础。方法:制备滇白珠的水提取总液、乙醇提取总液、醋酸乙酯提取液、正丁醇提取液、乙醇提取总液剩余部分液。滇白珠的
正丁醇部分,在大孔树脂中用不同溶液洗脱,得到水洗脱部分、30%乙醇洗脱部分和95%乙醇洗脱部分。采用大鼠佐剂性关
节炎模型,观察滇白珠不同部分提取液对大鼠关节肿胀的影响。结果:滇白珠的水提液组(A)、酸酸乙酯提取液组(C)和正丁
醇提取液组(D)可明显减轻大鼠关节肿胀程度,正丁醇提取液组(D)作用最强(P<005,P<001)。进一步研究显示,滇白珠
正丁醇提取液中水洗脱液和30%乙醇洗脱液均有抗大鼠佐剂性关节炎作用,而30%乙醇洗脱液作用更明显(P<005,P<
001)。结论:滇白珠正丁醇提取液30%乙醇洗脱部分有明显的抗大鼠佐剂性关节炎作用。
[关键词] 滇白珠;风湿性关节炎;佐剂性关节炎
[收稿日期] 20090000
[通信作者] 叶加,Tel:(010)82802653,Email:yejia@bjmu.edu.
cn
  滇白珠来源于杜鹃花科白珠树属植物滇白珠
Gaultheriayunnanensis(Franch.)Rehd.的干燥根或
全草,广泛分布于我国西南地区和华南地区。始载
于明初兰茂所著的《滇南本草》(1459年)[1],《中国
民族药志》[2]和《中药大辞典》[3]均有记载。滇白珠
具有祛风除湿,活血化瘀,通络止痛,清热解毒等功
效,主要用于治疗风湿性关节炎[3]。风湿性关节炎
属变态反应性疾病,是风湿热的主要表现之一,属中
医“痹证”范畴,易反复发作,可累及心脏[4]。长期
以来,滇白珠治疗风湿病一直停留在民间药用水平
上,缺乏深入的实验研究。本研究采用大鼠佐剂性
关节炎模型(adjutantarthritis,AA),对滇白珠的不
同提取液进行抗关节炎活性的筛选,以期寻找滇白
珠的抗关节炎活性成分。
1 材料
1.1 动物 Wistar大鼠,SPF级,雌雄各半,体重
(180±20)g,由北京大学实验动物部提供(许可证
号SCXK11000008)。以标准颗粒饲料饲养,由北
京大学实验动物部提供。动物饲养于标准环境:温
度(22±1)℃,相对湿度(60±5)%,人工光照,12h
明暗周期。
1.2 药物 滇白珠根由广西民族医药研究所戴斌
教授提供和鉴定。药材存放于北京大学药学院天然
药物学系生药生物技术室。
1.3 试剂 弗氏完全佐剂 (lifetechnologies,
USA),GiBcoBRL CatNo 15721038,LotNo
1020159;石油醚(北京北化精细化学品有限责任公
司,批号20080313),氯仿(北京北化精细化学品有
限责任公司,批号20060803),醋酸乙酯(北京化工
厂,批号20061012),正丁醇(北京北化精细化学品
有限责任公司,批号20060928)。
1.4 仪器 D101型大孔树脂(天津树脂厂),测厚
表 (北京量具刀具厂,GB121985)。
2 方法
2.1 样品制备 第1次筛选:滇白珠水提液(A):
滇白珠根药材530g,粉碎,过20目筛,水煮3次,每
次30min,合并水煎液,浓缩为1145g,配成270g
·L-1。醇提液(B):取滇白珠药材125kg,用95%
乙醇温浸(60℃)提取3次,每次1250mL,滤过,滤
液合并,减压回收溶剂得浸膏,依次用石油醚、氯仿、
醋酸乙酯、正丁醇萃取,分别减压回收溶剂,得醋酸
乙酯部分(C)、正丁醇部分(D),回收剩下的水溶液
的水部分(E)。B,C,D,E均用蒸馏水配成214g
·L-1,相当于生药125g·mL-1。
第2次筛选:另取滇白珠9kg,用同样方法提取
正丁醇部分上大孔树脂,分别用蒸馏水、30%乙醇、
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95%乙醇洗脱,得水部分(F)、30%乙醇部分(G)、
95%乙醇部分(H)。F,G和 H均按原生药含量
125g·mL-1用蒸馏水配成相应溶液。
2.2 分组与给药 第1次筛选:大鼠随机分6组,
每组8只,雌雄各半。设生理盐水对照组;滇白珠A
组;滇白珠 B组;滇白珠 C组;滇白珠 D组;滇白珠
E组。各组含量相当于生药125g·mL-1。大鼠均
按每100g体重1mL灌胃给药。
A:滇白珠的水提取总液;B:滇白珠的乙醇提取
总液;C:滇白珠的醋酸乙酯提取液;D:滇白珠的正
丁醇提取液;E:滇白珠的乙醇提取总液剩余部分
液。
第2次筛选:大鼠随机分5组,每组8只,雌雄
各半。设生理盐水对照组;滇白珠 D组;滇白珠 F
组;滇白珠 G组;滇白珠 H组。各组生药含量为
125g·mL-1。大鼠均按每100g体重1mL灌胃
给药。
D:滇白珠的正丁醇提取液(分离自乙醇提取总
液);F:滇白珠的正丁醇部分,在大孔树脂中以水洗
脱部分;G:滇白珠的正丁醇部分,在大孔树脂中以
30%乙醇洗脱部分;H:滇白珠的正丁醇部分,在大
孔树脂中以95%乙醇洗脱部分。
2.3 佐剂性关节炎模型[5] 大鼠灌服滇白珠提取
物及生理盐水1h后,于大鼠右后足趾皮下注射弗
氏完全佐剂005mL,诱导关节炎发生。此后,每天
灌服滇白珠提取物及生理盐水共15d,并测量大鼠
右后足厚度。
2.4 观察指标 致炎前及致炎后每天测量大鼠右
后足厚度(三点均值法:大鼠足前、中、后三点的测
量值的均值)。用足肿胀率来表示大鼠关节趾肿胀
的程度。
足肿胀率 =(致炎后足厚度均值 -致炎前足厚度均
值)/致炎前足厚度均值
2.5 统计学处理 结果以 珋x±s表示,用SPSS160
软件进行重复测量的方差分析,并对各天给药组与
相应盐水对照组之间进行简单主效应分析,显著性
检验标准为P<005。
3 结果
3.1 滇白珠抗风湿性关节炎活性成分的第一次筛
选 盐水对照组致炎后,大鼠足肿胀率在第2天出
现高峰,第3天后持续下降,在第7天出现回升,持
续肿胀15d。与盐水对照组相比,滇白珠的水提液
组(A)、醋酸乙酯提取液组(C)和正丁醇提取液组
(D)明显减轻大鼠关节肿胀。其中水提液组(A)在
致炎后的各个时期(1~3d,6d,7d,9~13d)对大
鼠关节肿胀均有抑制作用(P<005,P<001);醋
酸乙酯提取液组(C)在致炎后期(10~13d)对大
鼠关节肿胀有抑制作用(P<005);正丁醇提取液
组(D)抗炎作用最明显,在致炎后持续抑制了大鼠
的关节肿胀(P<005,P<001)。乙醇提取总液组
(B)和乙醇提取总液剩余部分液组(E)对大鼠关节
肿胀无明显抑制作用(表1)。
表1 滇白珠提取液对大鼠佐剂性关节炎足肿胀率的影响(珋x±s,n=8)
组别
足肿胀率/%
1d 3d 5d 7d 9d 11d 13d 15d
对照 125±006 128±007 122±006 121±006 115±007 115±004 114±004 113±005
A 117±0032) 119±0071) 115±006 110±0072) 107±0061) 110±0031) 108±0032) 109±004
B 119±009 126±008 119±005 117±005 114±008 113±009 111±006 112±005
C 123±006 126±006 123±006 115±007 110±007 109±0061) 109±0051) 110±008
D 116±0091) 114±0102) 113±0081) 110±0092) 105±0071) 103±0082) 103±0052) 099±0052)
E 122±007 123±008 118±007 117±006 112±008 113±007 111±004 109±005
  注:与对照组比1)P<005,2)P<001(表2同)。
3.2 滇白珠抗风湿性关节炎活性成分的第 2次
筛选 第1次筛选结果显示,滇白珠正丁醇提取
部分抗大鼠佐剂性关节炎作用明显,由此,对滇白
珠正丁醇提取液进行进一步的分离,并进行第 2
次活性筛选。盐水对照组致炎后,大鼠足肿胀率
在第3天出现高峰,之后持续下降,在第8天出现
回升。滇白珠的正丁醇提取液组(D)、正丁醇水洗
脱组(F)和正丁醇30%乙醇洗脱组(G)都有显著
的抗大鼠佐剂性关节炎活性。其中30%乙醇洗脱
组(H)的抗炎作用最明显,对致炎后各个时期大
鼠关节肿胀均有明显的抑制作用(P<005,P<
001)(表2)。
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表2 滇白珠正丁醇提取液对大鼠佐剂性关节炎足肿胀率的影响(珋x±s,n=8)
组别
足肿胀率/%
1d 3d 5d 7d 9d 11d 13d
对照 128±005 130±004 120±003 114±003 115±003 114±002 114±004
D 127±007 122±0062) 116±0031) 110±0022) 112±005 111±0041) 108±0041)
F 122±0042) 126±003 119±007 114±005 116±005 111±003 109±0031)
G 123±005 120±0062) 118±008 110±0031) 110±0051) 109±0051) 106±0032)
H 126±007 126±005 119±007 115±007 116±005 116±004 114±003
4 讨论
风湿性关节炎由风寒湿侵袭所致,最早记载
于《黄帝内经·痹论篇》[6]。现代医学认为风湿性
关节炎是一种病因较为复杂的全身性结缔组织炎
症,一般认为与 A族溶血性链球菌感染有关,以成
人为多见,受累关节以大关节为主。可侵犯至心
脏,引起风湿性心脏病的发生。西医治疗主要用
抗生素、甾体或非甾体类抗炎药及改善症状的抗
风湿药[7]。风湿性关节炎病情复杂,病程漫长,易
于反复。滇白珠在民间主要用于治疗风湿病,并
获得较好的疗效,但对滇白珠抗风湿病的活性成
分缺乏深入系统的研究。孙学蕙采用小鼠耳廓
肿、小鼠腹腔毛细血管通透性和大鼠角叉菜胶诱
发足趾肿胀方法证明滇白珠浸膏有显著的抗炎作
用[8]。张治针证明了滇白珠醋酸乙酯提取部分能
显著抑制小鼠腹腔毛细血管通透性而具有抗炎作
用,同时抑菌实验显示滇白珠挥发油具有广谱抑
菌活性[9]。目前,尚未有对滇白珠抗风湿性关节
炎活性进行详细研究的报道。
本研究采用大鼠佐剂性关节炎模型对滇白珠的
不同极性部分进行抗关节炎活性筛选,为临床应用
滇白珠治疗风湿性关节炎提供实验和理论基础。大
鼠佐剂性关节炎是一种免疫性炎症模型,其发病机
制和病理特征与人类风湿性关节炎类似。大鼠足趾
皮内注射弗氏完全佐剂致炎后,足趾肿胀明显,持续
3d后逐渐减轻,7,8d时再度肿胀。实验结果显
示,滇白珠有明显的抗佐剂性关节炎作用,但滇白珠
不同成分的抗佐剂性关节炎活性不同。滇白珠水提
取液、醋酸乙酯提取液和正丁醇提取液明显抑制了
大鼠关节肿胀,正丁醇提取液的活性最为显著,对大
鼠关节肿胀的抑制作用持续到致炎后15d。作者进
一步分离正丁醇,发现正丁醇的3种洗脱液中,30%
乙醇洗脱液的抗关节炎活性最明显。后续的研究显
示,滇白珠30%乙醇洗脱液主要含木脂素类化合物
如滇白珠苷A、(-)5′甲氧基异落叶松树脂醇2α
OβD木糖苷、(-)异落叶松树脂醇2αOβD木
糖苷和 (+)lyoniresinol2αOβDglueopyranoside
等。这类化合物的化学结构不同于已知的抗风湿药
物,可能存在独特的作用机制。作者将深入开展滇
白珠化学物质成分与其活性相关性的研究,并探讨
滇白珠的抗风湿性关节炎的作用机制。
[参考文献]
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XIONGYulan1,XIAOBing1,MAXiaojun2,LIChangling1,ZHENGJunhua3,YEJia1
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(1.DepartmentofMolecularandCelularPharmacology,SchoolofPharmaceuticalSciences,PekingUniversity,
Beijing100191,China;
2.TheInstituteofMedicinalPlantDevelopment,Beijing100193,China;
3.DepartmentofNaturalMedicines,SchoolofPharmaceuticalSciences,PekingUniversity,Beijing100191,China)
[Abstract] Objective:Gaultheriayunnanensis(Franch.)Rehd.areusedwidespreadlyinthesouthofChinatotreatrheuma
toidarthritis.TheaimofthisstudywastoprovideanexperimentalbasisforG.yunnanensistotherapyrheumatoidarthritis.Method:
Wepreparedwaterextracts,ethanolextracts,nbutanolextracts,ethylacetateextractsandtherestofethanolextractsfromG.yun
nanensis.Then,thenbutanolextractswereappliedtomacroporousresinandelutedwithwater,30% ethanol,and95% ethanol.
RheumatoidarthritiswasinducedbyFreund'scompleteadjuvantinjectedintorightpostpedesinWistarratswhichwasutilizedtoeluci
datetheantiinflammatoryefectofdiferentextractedliquidofG.yunnanensis.Ratsintragastricinjected(i.g.)withextractsasex
perimentalgroupornormalsodiumascontrolgroup.Result:Freund'scompleteadjuvantinducedarthritiswassuccessfulyestablished:
pawedemawereincreasedafterFreund'scompleteadjuvantinjection,peakedat2or3day,thendecreased,thepawedemawerein
creasedagainat7or8day,andpersisted15d.Datashowthatratswereadministeredwithwaterextracts,nbutanolextractsorethyl
acetateextractsproducedasignificantdecreasepawedemawhichinducedbyFreund'scompleteadjuvantascomparedwiththecontrol
group(P<005,P<001).Theefectofnbutanolextractswasthemostpowerful,whichbeganat1dandpersisted15dafterintra
gastricinjection.Further,nbutanolextractseluantwithwaterand30% ethanoldecreasedtheFreund'scompleteadjuvantinducedpaw
edema.Theactivityofextractseluantwith30% ethanolwasstrongerthaneluantwithwater.Conclusion:G.yunnanensisdisplayed
considerableefectsagainstFreund'scompleteadjuvantinducedarthritisinrats,whichisinconcordancewithclinicalpractice.Nbuta
nolextractsandbothoftheeluantswithwaterand30% ethanolproducedasignificantdecreasepawedema.30% ethanoleluantsshow
astrongeractivitythanothers.TheefectsagainstrheumatoidarthritisofdiferentpartsofG.yunnanensisdiferedindegree.Itisde
servedtoexplorethepotentialmechanismsofantiinflammtionoftheG.yunnanensis,especialythenbutanolextractseluantwith30%
ethanol.
[Keywords] Gaultheriayunnanensis;rheumaticarthritis;adjuvantarthritis
[责任编辑 古云侠]
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