全 文 ：丹参功能基因组学研究Ⅳ———丹参乙烯应答因子
（ＥＲＦ）基因的分析
胥彬１，２，黄璐琦１，崔光红１，毛莹１，张辉２
（１．中国中医科学院 中药研究所，北京 １００７００；
２．长春中医药大学，吉林 长春 １３０１１７）
［摘要］ 目的：获得丹参乙烯应答因子结合蛋白基因序列，并进行生物信息学分析和初步的表达特性研究。方法：利用
ｃＤＮＡ芯片技术，从不同时期毛状根中获得目的基因。利用ＢＬＡＳＴ进行序列比对，ＯＲＦｆｉｎｄｅｒ寻找开放读码框，Ｐｒｏｓｉｔｅ分析蛋
白质的基本结构域。用半定量ＲＴＰＣＲ检测其在丹参组培苗根、茎、叶中的表达情况。结果：得到１个乙烯应答因子结合蛋白
基因全长序列，全长９５２ｂｐ，具有１个６９９ｂｐ的开放读码框和８７ｂｐ的５′非编码区、１６６ｂｐ的３′非编码区，推测的氨基酸序列
中含有１个高度保守的ＡＰ２／ＥＲＦＤＮＡ结合域，ＧｅｎＢａｎｋＥＦ６６７０００，命名为ＳｍＥＲＦ。半定量ＲＴＰＣＲ表明，ＳｍＥＲＦ基因在丹参
组培苗根、茎、叶中均有转录水平的表达，根中表达量高于茎和叶中的。结论：首次得到丹参乙烯应答因子结合蛋白基因，为
其功能研究提供了基础。
［关键词］ 丹参；乙烯应答因子结合蛋白；序列
［收稿日期］ ２００９０３０２
［基金 项 目］ 国 家 重 点 基 础 研 究 发 展 计 划 （９７３）项 目
（２００６ＣＢ５０４７００）；国 家 高 技 术 研 究 发 展 计 划 （８６３）项 目
（２００７ＡＡ０２Ｚ１０４）
［通信作者］ 崔光红，Ｔｅｌ：（０１０）６４０１４４１１２９５６，Ｅｍａｉｌ：ｇｕａｎｇ
ｈｏｎｇｃｕｉ＠１６３．ｃｏｍ
乙烯应答因子（ｅｔｈｙｌｅｎｅｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｆａｃｔｏｒ，ＥＲＦ）
属于ＡＰ２／ＥＲＦ转录因子家族，是植物所特有的一类
转录因子［１］，最早作为烟草中与ＰＲ基因启动子中顺
式作用元件ＧＣＣ盒的结合蛋白分离得到［２］，主要参
与调控植物对乙烯、干旱、高盐和低温等胁迫应答反
应［３］。近来的研究表明它不仅调控植物病害相关的
应答，还参与了植物渗透胁迫应答、ＡＢＡ应答、生长发
育以及不同信号途径间相互作用等的调控［４］。
本研究通过不同时期丹参 Ｓａｌｖｉａｍｉｌｔｉｏｒｈｉｚａ毛
状根的ｃＤＮＡ芯片杂交试验，得到１个丹参乙烯应
答因子结合蛋白基因的全长 ｃＤＮＡ序列，对其进行
详细的生物信息学和在丹参组培苗根、茎、叶中的表
达分析，为进一步深入研究ＥＲＦ基因在丹参中的功
能和调控机制奠定基础。
１ 材料和方法
１．１ ＥＲＦ基因的克隆 采用 ｃＤＮＡ芯片技术克隆
ＥＲＦ基因［５６］。流程为 ＣＴＡＢ法提取丹参根总
ＲＮＡ，采用Ｐｈａｒｍａｃｉａ公司 ＱｕｉｃｈｐｒｅｐＴＭ ＭｉｃｒｏｍＲＮＡ
ＰｕｒｉｆｉＣａｔｉｏｎＫｉｔ分离ｍＲＮＡ后，通过在ｃＤＮＡ分子两
端加上 ＥｃｏＲⅠ／ＮｏｔⅠ接头，在 Ｔ４多核苷酸激酶的
作用下磷酸化，与表达载体 λＺＡＰＥｘｐｒｅｓｓＰｒｅｄｉｇｅｓ
ｔｅｄＶｅｃｔｏｒ连接，然后用包装蛋白在体外包装连接产
物，感染Ｅ．ｃｏｌｉＸＬ１ＢｌｕｅＭＲＦ＇构建成 ｃＤＮＡ文库。
挑取分离良好的噬菌斑进行ＰＣＲ扩增，经过电泳检
测、纯化、再次电泳检测后得到４３５４个克隆用于芯
片点制。以丹参 ａｃｔｉｎ基因作为阳性对照，不含
ＤＮＡ的点样液和ＰｏｌｙＡ为阴性对照。取６，７Ｖ固体
培养基上生长 ４５，６０ｄ的丹参毛状根进行芯片杂
交，探针标记采用间接标记法，芯片用 ＬｕｘＳｃａｎ１／Ａ
双通道激光扫描仪进行扫描，用 ＧｅｎｅＰｉｘＰ４０图像
分析软件对芯片图像进行分析，数据用 Ｌｏｗｅｓｓ方法
进行归一化。采用２倍差异标准结合 Ｔｔｅｓｔ方法来
确定差异表达基因。
１．２ ＥＲＦ生物信息学分析 差异基因经单侧测序
后，经过ｇａｐ４软件进行拼接聚类形成 Ｕｎｉｇｅｎｅ后进
行ＢＬＡＳＴＸ，ＢＬＡＳＴＮ比对分析，并对不同物种来源
的ＥＲＦ基因用 ＤＮＡＭＡＮ进行多序列同源性分析。
采用ＮＣＢＩ的开放读码框寻找程序（ＯＲＦｆｉｎｄｅｒ）确
定该基因的开放读码框。通过 Ｐｒｏｓｉｔｅ数据库（ｈｔ
ｔｐ：／／ｕｓ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｐｒｏｓｉｔｅ／）分析 ＳｍＥＲＦ蛋白的结
构位点。
１．３ ＳｍＥＲＦ基因表达分析 用半定量 ＲＴＰＣＲ检
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第３４卷第２０期
２００９年１０月
Ｖｏｌ．３４，Ｉｓｓｕｅ ２０
Ｏｃｔｏｂｅｒ，２００９
测ＳｍＥＲＦ基因在丹参组培苗根、茎、叶中的表达情
况。取６０ｄ的丹参根、茎、叶，按 ＴＲｉｚｏｌ试剂盒（Ｉｎ
ｖｉｔｒｏｇｅｎ公司产品）说明书操作提取总ＲＮＡ，取１μｇ
总ＲＮＡ模板按 ＲＴ试剂盒（Ｔａｋａｒａ公司）说明书反
转录得到 ｃＤＮＡ。ＳｍＥＲＦ引物为 ＥＲＦ１１１：５′
ＣＧＡＴＴＣＴＴＣＡＡＡＴＧＡＴＧＴＣＣ３′， ＥＲＦ３１０： ５′
ＧＣＧＴＧＴＴＡＡＡＧＧＴＴＣＣＧＡＧＣ３′，扩增 ＥＲＦ编码区
２２０ｂｐ片段。内参 ａｃｔｉｎ引物根据 ＮＣＢＩ网站上公
布的丹参 ａｃｔｉｎ编码区 ｍＲＮＡ序列（ＤＱ２４３７０２）设
计，ａｃｔｉｎ１０１：５′ＣＴＧＧＣＴＴＡＣＡＴＴＧＣＴＴＴＧＧ３′，ａｃ
ｔｉｎ４８８：５′ＡＧＧＡＡＣＣＡＣＣＧＡＴＣＣＡＧＡＣＡ３′，扩 增
ａｃｔｉｎ编码区内 ４０８ｂｐ的片段。反应体系为 ２μＬ
ｃＤＮＡ产物，２μＬ１０×ＥｘＢｕｆｅｒ，１μＬｄＮＴＰ，０５μＬ
引物，０３μＬＥｘＴａｑ酶，终体积为２０μＬ。反应条件
为９４℃预变性５ｍｉｎ，然后进行２７个循环９４℃ ３０
ｓ，５４℃ ３０ｓ，７２℃ １ｍｉｎ，循环结束后７２℃延伸５
ｍｉｎ。取５μＬ反应产物在含 ＥＢ的１５％的琼脂糖
凝胶上电泳，用ＳＹＮＧＥＮＥ型凝胶成像系统照像，以
２２０ｂｐ和 ４０８ｂｐ条带吸光度之比作为 ＥＲＦ基因
ｍＲＮＡ的相对表达量。
２ 结果
２．１ 基因芯片杂交结果 通过ｃＤＮＡ芯片杂交、差
异基因测序、序列拼接及 ＢＬＡＳＴ比对分析，１个
Ｕｎｉｇｅｎｅ被注释为乙烯应答因子结合蛋白基因，该基
因包含４条ＥＳＴ，在６０／４５ｄ，即在６０ｄ材料中的表
达量明显低于４５ｄ中的表达量（表１）。由于４５ｄ
时为丹参毛状根的快速生长期，而６０ｄ时为次生代
谢产物的快速积累期［６］，提示该基因可能与丹参的
生长发育相关。
２．２ 丹参 ＥＲＦ基因序列分析 该基因 ｃＤＮＡ全
长９５２ｂｐ，命名为 ＳｍＥＲＦ，并提交到 ＧｅｎＢａｎｋ，注
册号为 ＥＦ６６７０００。ＳｍＥＲＦ具有 １个 ６９９ｂｐ的
开放读码框和８７ｂｐ的５′非编码区、１６６ｂｐ的３′
非编码区，编码１个具有 ２３２个氨基酸残基的多
肽，相对分子质量约为 ２６３，等电点为 ８０６。
Ｐｒｏｓｉｔｅ在线分析表明在 ７１～１２８位氨基酸的 ５８
个氨基酸为高度保守的 ＡＰ２／ＥＲＦＤＮＡ结合域，
该结合域富含碱性氨基酸，是许多转录因子 ＤＮＡ
结合域的典型特征［２］。ＳｍＥＲＦＤＮＡ结合域与马
铃薯 Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ、棉 花 Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｂａｒｂａ
ｄｅｎｃｅ、拟南芥 Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ等植物 ＥＲＦ结
合域的一致性很高，与马铃薯的相似性最高
（８９７％）。但全从序列来看，它们之间的一致性
比较低，与棉花的相似性最高５０３％。
表１ ＳｍＥＲＦ基因的ｃＤＮＡ芯片杂交
ＥＳＴ
基因表达量
１ ２ ３ ４ ５ ６ ７ ８
平均值 标准差
ｃｈｉｐ２５ａ０４ ０４１４０ ０３７２２ ０３８３２ ０４２１０ ０４２９７ ０５５７８ ０４６２８ ０５４８０ ０４４８６１） ００７０１
ｃｈｉｐ２６ｈ０８ ０４２４５ ０４７４９ ０４２１８ ０５２０５ ０３９７３ ０４０９１ ０４２２８ ０３５６５ ０４２８４１） ００４９６
ｃｈｉｐ１５ｃ０３ ０３２０３ ０３２９２ ０３２６２ ０３８３６ ０４７９０ ０４４３７ ０４０９５ ０４９９２ ０３９８８１） ００７０８
ｃｈｉｐ０５ａ０９ ０４３９７ ０３２９８ ０５１３７ ０３０７１ ０３６５９ ０５５４８ ０５４４５ ０５９５７ ０４５６４１） ０１１１４
注：１～８．６０ｄ与４５ｄ的芯片杂交结果；１）单样本ｔ检验在９９％水平上为极显著差异。
２．３ ＳｍＥＲＦ在丹参植株不同部位中的表达 以引
物ＥＲＦ１１１和 ＥＲＦ３１０对丹参组培苗的根、茎、叶
等组织的总 ＲＮＡ进行半定量 ＲＴＰＣＲ分析。结果
表明，ＳｍＥＲＦ在丹参组培苗根、茎、叶等组织中均有
转录水平的表达（图１）。ＳｍＥＲＦ与 ａｃｔｉｎ面积的比
值分别为根０７８，茎０５６，叶０２９，可见该基因在根
中的表达量显著高于茎和叶的表达量，暗示 ＳｍＥＲＦ
在转录水平具有组织特异性。
３ 讨论
植物体内存在大量的转录因子［２］。根据 ＤＮＡ
结合域的不同，其被划分成很多家族，如参与植物防
卫与胁迫反应的转录因子家族主要有 ＡＰ２／ＥＲＦ，
１．根；２．茎；３．叶。
图１ ＳｍＥＲＦ在丹参不同组织中的表达情况
ｂＺＩＰ，ＭＹＢ／ＭＹＣ和 ＷＲＫＹ家族等［７］。植物 ＡＰ２／
ＥＲＦ超家族根据 ＡＰ２／ＥＲＦ结构域的不同可分为３
个家族，ＡＰ２家族含有 ２个重复的 ＡＰ２／ＥＦＲ结构
域，ＥＲＦ家族含有１个 ＡＰ２／ＥＲＦ结构域，ＲＡＶ家族
除含有１个ＡＰ２／ＥＲＦ结构域外，还含有１个 Ｂ３结
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构域［８］。本研究克隆的丹参 ＥＲＦ基因具有１个由
６０个左右氨基酸残基组成的非常保守的 ＡＰ２／ＥＲＦ
结合域，属于ＡＰ２／ＥＲＦ超家族中的ＥＲＦ家族基因。
ＳｍＥＲＦ在丹参不同生长阶段的表达量具有显著的
差异，表明其可能在丹参的生长发育中起着重要的
作用，在植株中的表达分析表明它具有组织表达特
异性，该基因的克隆对于研究丹参的生长发育和对
各种胁迫反应的应答机制具有重要的意义。
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ＦｕｎｃｔｉｏｎａｌｇｅｎｏｍｉｃｓｏｆＳａｌｖｉａｍｉｌｉｔｉｏｒｒｈｉｚａⅣ———Ａｎａｌｙｓｉｓｏｆ
ｅｔｈｙｌｅｎｅｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｅｌｅｍｅｎｔｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎｇｅｎｅ
ＸＵＢｉｎ１，２，ＨＵＡＮＧＬｕｑｉ１，ＣＵＩＧｕａｎｇｈｏｎｇ１，ＭＡＯＹｉｎｇ１，ＺＨＡＮＧＨｕｉ２
（１．ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭａｔｅｒｉａＭｅｄｉｃａｌ，ＣｈｉｎａＡｃａｄｅｍｙｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１００７００，Ｃｈｉｎａ；
２．ＣｈａｎｇｃｈｕｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ１３０１１７，Ｃｈｉｎａ）
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＴｏｓｔｕｄｙｔｈｅｅｔｈｙｌｅｎｅｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｅｌｅｍｅｎｔｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎｇｅｎｅｓｏｆＳａｌｖｉａｍｉｌｔｉｏｒｈｉｚａｔｈｒｏｕｇｈｂｉｏｉｎｆｏｒ
ｍａｔｉｃｓａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｉｔｓｔｉｓｓｕｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄｐｌａｎｔｌｅｔｓ．Ｍｅｔｈｏｄ：Ｔｈｅｅｔｈｙｌｅｎｅｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｅｌｅｍｅｎｔｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ
ｇｅｎｅｓｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄｂｙｃＤＮＡｍｉｃｒｏａｒａｙａｎａｌｙｚｅ．ＢＬＡＳＴｗａｓｕｓｅｄｆｏｒａｌｉｇｎｍｅｎｔ，ＯＲＦｆｉｎｄｅｒｓｏｆｔｗａｒｅｗａｓｕｓｅｄｔｏｆｉｎｄｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇ
ｆｒａｍｅ，Ｐｒｏｓｉｔｅｄａｔａｂａｓｅｗａｓｕｓｅｄｔｏａｎａｌｙｚｅｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎ．ＳｅｍｉｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＲＴＰＣＲｍｅｔｈｏｄｗａｓｕｓｅｄｔｏｄｅｔｅｃｔｔｈｅｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖ
ｅｌ．Ｒｅｓｕｌｔ：Ｏｎｅｅｔｈｙｌｅｎｅｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｅｌｅｍｅｎｔｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎｗａｓｏｂｔａｉｎｅｄ，ｎａｍｅｄａｓＳｍＥＲＦ．ＳｍＥＲＦｈａｄａｎｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅｏｆ
６９９ｂｐｗｉｔｈ５′ＵＲＴ８７ｂｐａｎｄ３′ＵＲＴ１６６ｂｐ．ＴｈｅｐｕｔａｔｉｖｅｐｒｏｔｅｉｎＳｍＥＲＦｃｏｎｔａｉｎｓａｈｉｇｈｌｙｃｏｎｓｅｒｖｅｄＥＲＦ／ＡＰ２ｄｏｍａｉｎ．Ｓｅｍｉ
ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＲＴＰＣＲｉｌｕｓｔｒａｔｅｄｔｈａｔＳｍＥＲＦｗａｓｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎａｌｔｉｓｓｕｅｓｓｕｃｈａｓｒｏｏｔ，ｓｔｅｍａｎｄｌｅａｆｉｎｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄｓｈｏｏｔｓ，ｗｈｉｌｅｔｈｅ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｗａｓｈｉｇｈｅｒｉｎｒｏｏｔｔｈａｎｉｎｓｔｅｍａｎｄｌｅａｆ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：ＩｔｗａｓｔｈｅｆｉｒｓｔｔｉｍｅｔｏｏｂｔａｉｎＥＲＦｇｅｎｅｉｎＳ．ｍｉｌｔｉｏｒｈｉｚａａｎｄ
ｓｅｔａｇｏｏｄｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｆｏｒｉｔｓｆｕｒｔｈｅｒｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｓｔｕｄｙ．
［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］ Ｓａｌｖｉａｍｉｌｉｔｉｏｒｈｉｚａ；ｅｔｈｙｌｅｎｅｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｅｌｅｍｅｎｔｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ；ｓｅｑｕｅｎｃｅ
［责任编辑 吕冬梅］
·６６５２·
第３４卷第２０期
２００９年１０月
Ｖｏｌ．３４，Ｉｓｓｕｅ ２０
Ｏｃｔｏｂｅｒ，２００９