全 文 ：黄芪遗传转化受体系统的建立及
ａＦＧＦ转化黄芪的研究
李大超，王义，蒋世翠，韩秀文，张美萍
（吉林农业大学 生命科学学院，吉林 长春 １３０１１８）
［摘要］　目的：建立黄芪的高频再生体系，并在其基础上建立ａＦＧＦ转化黄芪的体系。方法：以黄芪的子叶节为外植体通
过器官发生途径建立高频再生体系，采用农杆菌ＧＶ３１０１转化黄芪子叶节，将ａＦＧＦ基因导入黄芪，再生株系经过ＰＣＲ初步检
测。结果：以全部子叶节为外植体，在培养基为ＭＳ＋２０ｍｇ·Ｌ－１ＢＡ＋０５ｍｇ·Ｌ－１ＩＢＡ诱导不定芽；在培养基为１／２ＭＳ＋５０
ｍｇ·Ｌ－１ＮＡＡ生根，获得高频再生体系；全部子叶节在培养基上预培养３ｄ，农杆菌浓度为 Ａ６０００３时侵染１０ｍｉｎ后共培养２
ｄ，转移至筛选培养基培养，检测证实ａＦＧＦ基因整合到黄芪基因组中。结论：在黄芪子叶节高效再生体系基础上，建立黄芪遗
传转化受体体系，为黄芪作为植物生物反应器的研究奠定了基础。
［关键词］　黄芪；再生；ａＦＧＦ；遗传转化
［收稿日期］　２００９０２１５
［通信作者］　张美萍，教授，博士生导师。Ｔｅｌ：１３３９４４８９３９８，Ｅｍａｉｌ：
ｗｚｈａｏｙｕｎ＠ｔｏｍ．ｃｏｍ
［作者简介］　李大超，硕士，研究方向为植物生物反应器。Ｔｅｌ：
１３６９４３０７８８３
　　中国药典规定黄芪ＲａｄｉｘＡｓｔｒａｇａｌｉ为豆科Ｌｅｇｕ
ｍｉｎｏｓａｅ黄芪属Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ膜荚黄芪Ａ．ｍｅｍｂｒａｎａｃｅｕｓ
（Ｆｉｓｃｈ．）Ｂｇｅ．及蒙古黄芪Ａ．ｍｅｍｂｒａｎａｃｅｕｓＢｇｅ．ｖａｒ．
ｍｏｎｇｈｏｌｉｃｕｓ（Ｂｇｅ．）Ｈｓｉａｏ的干燥根［１］，为常用中药之
一，原名黄耆，始载于《神农本草经》，列为上品。黄芪
具有补气固表、利尿托毒、排脓、敛疮生肌之功效［２］。
目前血浆蛋白、酶、生长因子、疫苗和重组抗体
等［３５］外源蛋白在植物中得到了表达。αＦＧＦ具有
对多种细胞分裂、增殖，有丝分裂活性，诱导内皮细
胞分化和促血管生成等作用［６］。但利用植物作为
生物反应器生产 αＦＧＦ的研究较少，尤其在黄芪中
表达的研究尚未见报道。利用黄芪表达αＦＧＦ可以
使αＦＧＦ组织创伤修复的活性和黄芪的排脓、敛疮
生肌功效累加，直接用于外伤修复。本研究以黄芪
子叶节为外植体，研究不同激素对黄芪再生体系的
影响，建立高效再生体系。并在黄芪子叶节高效再
生体系基础上，建立黄芪遗传转化受体体系，为黄芪
作为植物生物反应器的研究奠定了基础。
１　材料
黄芪种子（供试材料黄芪采自吉林农业大学生
命科学学院实验田）。含 ａＦＧＦ基因的根癌农杆菌
ＧＶ３１０１（生物反应器与药物开发教育部工程中心提
供）。植物培养基：ＭＳ液体培养基，ＭＳ培养基和添
加不同激素及抗生素的 ＭＳ培养基，ｐＨ５８。农杆
菌培养基：ＬＢ液体培养基和ＬＢ固体培养基添加５０
ｍｇ·Ｌ－１Ｓｔｒ（链霉素）和５０ｍｇ·Ｌ－１Ｋａｎ（卡那霉
素），ｐＨ７０。
２　方法
２．１　无菌苗的获得
用０１％ＨｇＣｌ２消毒１０ｍｉｎ，放在无菌水中浸泡２４
ｈ，接种于无激素ＭＳ固体培养基上，置光强２０００～
２５００ｌｘ，１２ｈ·ｄ－１，２５℃温箱中萌发５～１０ｄ。
２．２　子叶节高效再生体系的建立
分别选取出苗５，１０，２０，３０，４０ｄ的无菌苗的子
叶节，接在附加不同浓度 ６ＢＡ，ＩＢＡ的 ＭＳ培养基
上，在交替光照条件下培养，３０ｄ后观察。
２．３　不同激素组合对生根的影响
将健壮的３～４ｃｍ的再生苗分割成单株，接种
到附加含有不同基质的培养基里诱导生根。
２．４　影响黄芪遗传转化的主要因素试验
２．４．１　预培养时间对黄芪遗传转化影响试验　无
菌条件下切割子叶节分别进行０，１，３，５，７ｄ的预培
养后投入Ａ６００为０３的菌液中。
２．４．２　农杆菌浓度对黄芪遗传转化影响试验　菌
液用ＭＳ液稀释至 Ａ６００为 ０，０１，０３，０４，０５，０６
（Ａ６００约为８×１０
８ｃｅｌ·ｍＬ－１），浸染子叶节５ｍｉｎ，
在共培养基上培养２ｄ后，再转接到芽诱导培养基
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上分化，每隔２周换１次培养基。
２．４．３　侵染时间对黄芪遗传转化影响试验　切取
子叶节放入制备好的农杆菌菌液中侵染，侵染时间
分别为１，５，１０，１５，２０，２５，３０ｍｉｎ，在共培养基上培
养２ｄ后，再转接到芽诱导培养基上分化，每隔２周
换１次培养基。
２．４．４　共培养时间对黄芪遗传转化影响试验　切
取子叶节投入Ａ６００为０３的菌液中侵染５ｍｉｎ后，共
培养分别为０，１，２，３，４，５，６，７ｄ，然后再转接到芽诱
导培养基上分化，每隔２周换１次培养基。
２．５　再生植株的ＰＣＲ检测
以黄芪总 ＤＮＡ为模板，扩增 ａＦＧＦ基因。ＰＣＲ
反应体系（５０μＬ）：Ｂｕｆｅｒ（１０×）５μＬ，ｄＮＴＰ４μＬ引
物１（ＳＡ）和引物２（ＡＡ）各２μＬ，模板０５μＬ，酶１
μＬ，ｄｄＨ２Ｏ３４５μＬ；９４℃预变性２ｍｉｎ，９４℃变性
５０ｓ，５５℃退火５０ｓ，７２℃延伸５０ｓ。３０个循环后
７２℃延伸５ｍｉｎ，进行琼脂糖凝胶电泳分析。
３　结果与分析
３．１　高效再生体系的建立
３．１．１　不同激素配比对子叶节再生的影响　子叶节
不定芽诱导率的分析见表１，２，根据极差的大小顺序
ＲＢ＞ＲＣ＞ＲＡ，得出影响诱导愈伤组织诱导率的因
素主次顺序为ＩＢＡ＞ＮＡＡ＞ＢＡ，各因素的最优水平
为Ａ３Ｂ１Ｃ３，即ＢＡ２０ｍｇ·Ｌ
－１，ＩＢＡ０５ｍｇ·Ｌ－１。
表１　正交试验方案与不定芽诱导率
实验列 ＢＡ ＩＢＡ ＮＡＡ 不定芽诱导率／％
１ １（０５ｍｇ·Ｌ－１） １（０５ｍｇ·Ｌ－１） １（０５ｍｇ·Ｌ－１） ６３
２ １ ２（０２ｍｇ·Ｌ－１） ２（０２ｍｇ·Ｌ－１） ５５
３ １ ３（０ｍｇ·Ｌ－１） ３（０ｍｇ·Ｌ－１） ４３
４ ２（１ｍｇ·Ｌ－１） １ ２ ８９
５ ２ ２ ３ ７５
６ ２ ３ １ ８６
７ ３（２ｍｇ·Ｌ－１） １ ３ ９０３
８ ３ ２ １ ８９
９ ３ ３ ２ ８５
表２　方差分析
变异来源 平方和 均方 Ｆ值 显著性
第１列 ２３９３５５６ １１９６７７８ ５４１２５６３ 显著　
第２列 ２２０２２２２ １１０１１１１ ４９７９８９９ 不显著
第３列 ４９７９８９９ ６０７７７７８ ２７４８７４４ 显著　
　　注：自由度为２。
３．１．２　不同苗龄子叶节对再生的影响　研究了种
子不同萌发天数对不定芽芽分化的影响，子叶节不
定芽诱导率以萌发１０ｄ的外植体最高，达９０３％。
当种子萌发超过２０ｄ时，不定芽诱导率随着萌发天
数的增加而下降，萌发３０ｄ的外植体诱导率只有
７０％，见图１。其原因可能是随着萌发天数的增加，子
叶节分生组织的分生能力变弱，使诱导不定芽困难。
图１　不同苗龄子叶节对不定芽诱导的影响
３．１．３　不同激素组合对生根的影响　激素的种类
与组合对芽苗的生根有一定影响，待芽苗长到２～３
ｃｍ高时，每处理选取一些生长健壮的单芽苗接种到
培养基中进行生根培养。这些处理中，在１／４ＭＳ培
养基生根率均较低，而且苗木的生根速度较慢，根不
发达。在１／２ＭＳ培养基上生根速度较快，根系发
达，而且高浓度的生长素有利于生根，见表３。
表３　不同基质对生根的影响
培养基编号 基质组成 生根情况 长势
１ １／２ＭＳ＋２０ｍｇ·Ｌ－１ＮＡＡ  生根速度较快，根系较发达
２ １／２ＭＳ＋５０ｍｇ·Ｌ－１ＮＡＡ  生根速度快，根系发达，根较粗壮
３ １／４ＭＳ＋２０ｍｇ·Ｌ－１ＮＡＡ  生根速度慢，根较细，不发达
４ １／４ＭＳ＋５０ｍｇ·Ｌ－１ＮＡＡ  生根速度较慢，根不发达
　　注：为长势弱，为一般，为良好。
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３．２　预培养时间对黄芪子叶节遗传转化的影响
预培养２～６ｄ分化再生芽较多。预培养３～６
ｄ有１个抗性芽形成。但是再生芽数量多，嵌合体
增加了Ｋａｎ抗性筛选的难度。在综合比较了０～６
ｄ预培养的再生芽数和抗性芽数后，发现采用３ｄ的
预培养时间为最佳，见图２。
图２　预培养时间对黄芪子叶节遗传转化的影响
３．３　农杆菌浓度对黄芪遗传转化的影响
在Ａ６００为０１～０７时子叶节都能够正常分化
不定芽，Ａ６００高于０７时伤口褐化，软腐增多。Ａ６００为
０３时既可使农杆菌对外植体毒害程度最小又使外
植体不污染，故选最适的Ａ６００为０３，见图３。
图３　农杆菌浓度对黄芪子叶节遗传转化的影响
３．４　感染时间对黄芪子叶节遗传转化的影响
农杆菌尚未接种到伤口面，在共培养时无农杆
菌生长，不能转化。浸染时间太长，常因农杆菌毒害
缺氧而软腐。在无污染情况下浸染时间０～１５ｍｉｎ
不仅再生芽多而且有抗性芽生成，尤以１０ｍｉｎ的浸
染效果最佳，见图４。
图４　感染时间对黄芪子叶节遗传转化的影响
３．５　共培养时间对黄芪子叶节遗传转化的影响
农杆菌附着在外植体表面后不能立即转化，它
有一段“细胞调节期”，只有在创伤部位生存１６ｈ之
后才能诱发肿瘤。共培养１～３ｄ可获得较多的再
生芽和１～２抗性芽，但在无污染的情况下共培养时
间为２ｄ再生芽和抗性芽最多，见图５。故共培养的
最佳时间为２ｄ。
图５　共培养时间对黄芪子叶节遗传转化的影响
３．６　ＰＣＲ检测
经ＰＣＲ检测，由子叶节器官再生途径得到的６９
株抗性植株，检测其中５棵抗性植株其中有２株呈
阳性，阳性率为４０％，占该再生系统总转化外植体
１００块的２７６％。以抗性植株ＤＮＡ为模板，ＰＣＲ扩
增出与预测相同大小的片段，约为５４０ｂｐ，以非转基
因同一基因型黄芪植株 ＤＮＡ为模板所做的阴性对
照未见条带，表明外源 ａＦＧＦ基因己经整合到黄芪
基因组中，见图６。
Ｍ．ＤＬ２０００Ｍａｒｋｅｒ；Ａ．阳性对照；Ｂ．阴性对照；２，４．ＰＣＲ阳性植株。
图６　抗性植株ＰＣＲ检测
４　讨论
据已有的报道，黄芪的再生效率不够稳定，可重
复性差，最高再生率 ４０％以上，低的只有百分之
几［７］，再生周期比较长，大部分再生过程需要２～３
个月左右［８］。而本研究采用萌发１０ｄ的实生苗子
叶节在ＭＳ＋２０ｍｇ·Ｌ－１ＢＡ＋０５ｍｇ·Ｌ－１ＩＢＡ培
养基上诱导不定芽，再生时间２５～３０ｄ，再生率可达
９０３％，极大的提高了黄芪的再生率。本实验通过
诱导子叶节建立黄芪的再生体系，再生周期短，频率
高，变异率低，为遗传转化建立了良好的受体系统。
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研究表明植物激素的浓度影响芽的再生率和再生苗
的生根，以及再生率的稳定性［８］。
农杆菌介导的遗传转化受多因素影响，研究表
明，菌液的浓度、侵染的时间和共培养的条件等都会
影响转化效率［９］。本研究较系统的探讨了影响黄
芪遗传转化的各因素，确立了农杆菌介导的 ａＦＧＦ
转化黄芪的条件：黄芪子叶节在培养基上预培养３
ｄ，农杆菌浓度为Ａ６０００３时侵染１０ｍｉｎ后共培养２
ｄ，转移至筛选培养基中培养，获得再生植株，阳性转
化率为３５６％。本研究的遗传转化体系，与农杆菌
介导的外源基因转化大豆相比转化率高，不添加乙
酰丁香酮等外源物质［１０］。通过 ＰＣＲ检测，在转基
因植株中检测到ａＦＧＦ目的基因。但是在遗传稳定
性、外源蛋白表达量等方面还需要进一步深入研究。
利用农杆菌介导法将 ａＦＧＦ基因导入药用植物
中的报道较少，将 ａＦＧＦ基因导入黄芪中的研究尚
未见报道。黄芪具排脓、敛疮生肌等功效，用于治疗
创伤；ａＦＧＦ具有对多种细胞分裂、增殖，有丝分裂活
性，诱导内皮细胞分化和促血管生成等作用。利用
黄芪表达 ａＦＧＦ可以使 ａＦＧＦ组织创伤修复的活性
和黄芪的排脓、敛疮生肌的累加，不用提取 ａＦＧＦ蛋
白，直接用于外伤修复。本研究在黄芪高效再生体
系及遗传转化方面进行了细致的研究，为黄芪作为
植物生物反应器生产外源蛋白提供依据。
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ＥｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔｏｆｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｒｅｃｅｐｔｏｒｓｙｓｔｅｍａｎｄａＦＧＦｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｅｉｎ
ＲａｄｉｘＡｓｔｒａｇａｌｉ
ＬＩＤａｃｈａｏ，ＷＡＮＧＹｉ，ＪＩＡＮＧＳｈｉｃｕｉ，ＨＡＮＸｉｕｗｅｎ，ＺＨＡＮＧＭｅｉｐｉｎｇ
（ＣｏｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ，ＪｉｌｉｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ１３０１１８，Ｃｈｉｎａ）
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＴｈｅｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔｏｆｈｉｇｈｆｒｅｑｕｅｎｃｙｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｏｆＡｓｔｒａｇａｌｕｓ，ａｎｄｂａｓｉｓｏｆｉｔｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ
ａｓｔｒａｇａｌｏｓｉｄｅａＦＧＦｓｙｓｔｅｍ．Ｍｅｔｈｏｄ：ＣｏｔｙｌｅｄｏｎｎｏｄｅｏｆｔｈｅＡｓｔｒａｇａｌｕｓｅｘｐｌａｎｔｓｆｏｒｏｒｇａｎｏｇｅｎｅｓｉｓｗａｙｔｈｒｏｕｇｈｔｈｅｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔｏｆ
ｈｉｇｈｆｒｅｑｕｅｎｃｙｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍ，ｕｓｉｎｇＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎａｓｔｒａｇａｌｏｓｉｄｅＧＶ３１０１ｃｏｔｙｌｅｄｏｎｎｏｄｅｗｉｌａＦＧＦｇｅｎｅｉｎｔｏａｓ
ｔｒａｇａｌｏｓｉｄｅ，ｒｅｎｅｗａｂｌｅｓｔｒａｉｎａｆｔｅｒｔｈｅｉｎｉｔｉａｌｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＰＣＲ．Ｒｅｓｕｌｔ：Ａｌｃｏｔｙｌｅｄｏｎｎｏｄｅｉｓｅｘｐｌａｎｔｓ，ｉｎｄｕｃｅｄａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓｂｕｄｓｉｎ
ｔｈｅｍｅｄｉｕｍｏｆＭＳ＋２０ｍｇ·Ｌ－１ＢＡ＋０５ｍｇ·Ｌ－１ＩＢＡ；ｔａｋｅｎｒｏｏｔｉｎｔｈｅｍｅｄｉｕｍｏｆ１／２ＭＳ＋５０ｍｇ·Ｌ－１ＮＡＡ，ｇｉｖｅｎａｈｉｇｈｆｒｅ
ｑｕｅｎｃｙｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍ；ａｌｃｏｔｙｌｅｄｏｎｎｏｄｅｉｎｐｒｅｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉｕｍ３ｄａｙｓ，ＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆＡ６０００３ａｔ１０ｍｉｎａｆｔｅｒ
ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｃｏｃｕｌｔｕｒｅ２ｄａｙｓ，ｔｏｃｏｎｔａｉｎｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎｓｃｒｅｅｎｉｎｇｂａｓｅｄｉｎｄｕｃｔｉｏｎｔｒａｉｎｉｎｇ，ｔｅｓｔｉｎｇｃｏｎｆｉｒｍｅｄａｓｔｒａｇａｌｏｓｉｄｅａＦＧＦｇｅｎｅｉｎｔｏｇｅ
ｎｏｍｅ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：ＥｓｔａｂｌｉｓｈＡｓｔｒａｇａｌｕｓｅｆｉｃｉｅｎｔｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｏｆｃｏｔｙｌｅｄｏｎｎｏｄｅ．ＢａｓｉｓｏｆｇｅｎｅｔｉｃｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎＡｓｔｒａｇａｌｕｓｒｅ
ｃｅｐｔｏｒｓｙｓｔｅｍ，Ａｓｔｒａｇａｌｕｓａｓａｐｌａｎｔｆｏｒｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｒｅｓｅａｒｃｈｌａｉｄｔｈｅｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ．
［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］　ＲａｄｉｘＡｓｔｒａｇａｌｉ；ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ；ａＦＧＦｇｅｎｅｔｉｃｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ
［责任编辑　吕冬梅］
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