全 文 :胶艾汤及参芪胶艾汤的雌激素样作用及可能机制
赵丕文,牛建昭,王继峰,于杰,郝庆秀,李亚东
(北京中医药大学 基础医学院,北京 100029)
[摘要] 目的:观察胶艾汤及其加味方参芪胶艾汤的植物雌激素样作用,并利用雌激素受体(ER)(+)MCF7细胞探讨其
发挥雌激素样作用的可能靶点和机制。方法:正常昆明种性未成熟雌性小鼠60只,体重9~12g,按体重均衡和随机的原则分
为6组:正常组给予等体积蒸馏水,阳性药己烯雌酚组按035mg·kg-1·d-1给予己烯雌酚,胶艾汤和参芪胶艾汤低,高剂量
组分别按25g·kg-1·d-1和50g·kg-1·d-1给予中药方剂,给药持续4d。第5天眼眶取血,分离血清,称取子宫并计算子
宫系数。通过MTT细胞增殖实验观察2个方剂含药血清对MCF7细胞增殖的影响;运用实时荧光定量RTPCR技术检测含药
血清对雌激素效应基因pS2及ERα,ERβ表达的调控作用;并以雌激素受体拮抗剂ICI182,780干预,探讨其发挥雌激素样作用
的可能机制。结果:高剂量胶艾汤及参芪胶艾汤能够明显提高性未成熟小鼠的子宫系数(P<005);其含药血清能够显著促
进MCF7细胞增殖(P<005或001),加入ER拮抗剂ICI182,780可抑制其促增殖作用(P<005或001)。与己烯雌酚组一
致,2个方剂含药血清也可提高靶细胞pS2表达水平(P<001),加入ICI182,780可抑制pS2表达水平的提高(P<001);2个
方剂含药血清还可明显提高ERα(P<005)和ERβ(P<001)的表达水平。结论:胶艾汤及参芪胶艾汤均具有一定的通过ER
介导的雌激素样作用,并可提高靶细胞ER亚型(特别是ERβ)mRNA的表达水平。
[关键词] 胶艾汤;参芪胶艾汤;雌激素样作用;子宫系数;MCF7细胞;细胞增殖;雌激素受体亚型
[收稿日期] 20081125
[基金项目] 国家自然科学基金项目(30772849);高等学校创新引
智计划(B07007);教育部博士点科研基金(20060026019);国家理科
基础科学人才培养基金科研训练项目(20070111)
[通信作者] 牛建昭,教授,博士生导师。Tel:(010)64287538,E
mail:niujzz@263.net
长期以来,许多中草药及其复方被广泛应用于
妇科病的治疗和保健。胶艾汤出自《金匮要略》,在
妇科疾病治疗中应用已久,有补血、止血、调经安胎
之功;参芪胶艾汤(圣愈汤)则加用参、芪以补气摄
血,二者均为妇科要方。作为中医药学的经典方剂,
胶艾汤及其加味方在现代妇科临床应用中有着广阔
的前景,但其发挥药理作用的途径和机制尚待揭示。
作者在前期研究中已经发现,多味妇科常用中药或
其有效成分均可表现类雌激素样作用,并影响靶细
胞雌激素受体亚型的表达[12]。为了了解妇科常用
中药复方是否也具有相似的作用,本研究对胶艾汤
及其加味方参芪胶艾汤进行探索,并分析其发挥类
雌激素样作用的可能靶点和途径。
1 材料
1.1 动物 昆明种小鼠60只,雌性,出生后21d
(刚断乳),体重9~12g,购自北京维通利华实验
动物技术有限公司(动物合格证号 SCXK京2002
2003)。实验期间饲养在二级动物室,温度(25±
1)℃。
1.2 药物与试剂 实验用药材:熟地黄、当归、白
芍、川芎、艾叶、阿胶、甘草、黄芪、人参均购自北京同
仁堂中药店(经北京中医药大学基础医学院刘启福
教授鉴定依次为:R.glutinisa,A.sinensis,P.lacti
flora,L.chuanqiong,A.argyi,E.asinus,G.ura
lensis,A.membranaceus,P.ginseng)。胶艾汤不同
药味之间的剂量比例:熟地黄12g、白芍9g、当归9
g、川芎6g、艾叶9g、阿胶6g、甘草6g;以此方为基
础,参芪胶艾汤加入黄芪10g,人参6g。药材经浸
泡、煎煮、过滤、浓缩等步骤,药物终质量浓度含生药
量1g·mL-1;所得药液置4℃冰箱保存备用。阳
性药物为己烯雌酚,北京益民药业有限公司生产,批
号200504100,实验时配制成 20mg·L-1的溶液。
DMEM(高糖)(批号 NRF0014)、无酚红 DMEM(高
糖)(批号 ARE26283)、胎牛血清及活性炭葡聚糖
苷处理的胎牛血清(CDTFBS)(Hyclone公司);
MTT,DMSO(Sigma公司);Trizol试剂盒,PCR引物
合成(北京赛百胜基因技术有限公司);雌激素受体
拮抗剂 ICI182,780(Tocris公司);OneStepSYBR
PrimeScriptTMRTPCRKit(Takara公司)。
1.3 细胞株 人乳腺癌 MCF7细胞购自北京协和
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医科大学细胞中心。
1.4 仪器 CB150CO2培养箱(德国Binder公司);
LX800酶联免疫检测仪(日本EPSON公司);CKX41
倒置显微镜(日本 Olympus公司);LightCycler20
全自动荧光定量PCR仪(德国Roche公司)。
2 方法
2.1 分组 将动物按体重均衡和随机的原则分为
6组:正常组、阳性药己烯雌酚组以及胶艾汤低、高
剂量组和参芪胶艾汤低、高剂量组。
2.2 给药方法 动物适应性饲养6d。正常组给
予等体积蒸馏水;己烯雌酚组按035mg·kg-1·
d-1给予阳性药物己烯雌酚;2个中药低剂量组按
25g·kg-1·d-1给药,2个中药高剂量组按50g
·kg-1·d-1给药。灌胃分早、晚2次进行,给药均
持续4d。
2.3 取材、称重 各组动物于最后1次给药后第2
天称重,之后进行下述取材和处理:①眼眶取血,4
℃存放过夜;2000r·min-1离心10min,小心分离
血清,56℃ 30min灭活补体,022μm微孔滤膜过
滤,-20℃贮存备用。②断颈处死后迅速抛开腹
腔,分离、剪下子宫称重;计算子宫系数(子宫系数
=子宫湿重/体重×100%)。
2.4 细胞培养 人乳腺癌细胞 MCF7,常规培养
在含10%胎牛血清的 DMEM高糖溶液中,培养条
件为37℃,5%CO2,相对饱和湿度。实验开始前4
天将细胞用 PBS洗涤 2次后,改为在无酚红
DMEM(含5% CDTFBS)中培养,以耗尽细胞内储
存的雌激素。
2.5 MTT细胞增殖试验 MCF7细胞传代3次,经
无酚红DMEM(含5% CDTFBS)培养4d后,选取
对数生长期细胞,用 025%胰蛋白酶消化,PBS洗
涤2次,加入无血清 DMEM,以2×103个/孔的细胞
密度接种于 96孔板内,每孔培养液总体积为 200
μL。培养24h待细胞贴壁后,换为含10%含药血
清的DMEM培养液中继续培养;拮抗组同时加入1
×10-8mol·L-1ICI182,780;每种受试物均设6个
复孔。分别于加入受试物24,48h后加入MTT(5g
·L-1,15μL/孔),继续孵育4h,吸去培养液,每孔
加入DMSO150μL。以DMSO调零,用酶联免疫检
测仪在570nm下测定各孔吸光度(A),计算平均 A
值和增殖率(proliferationrate,PR)。
PR=(A实验组/A溶剂对照组)×100%
2.6 实时荧光定量PCR法检测pS2,ERα,ERβmR
NA表达 取经无酚红 DMEM(含5%CDTFBS)培
养4d的MCF7细胞,以5×105个/瓶的细胞密度接
种于25cm2的培养瓶中,以无血清DMEM接种24h
待细胞贴壁后,换为含10%含药血清的 DMEM培
养液;拮抗组同时加入 1×10-8mol·L1ICI182,
780。继续培养48h后,终止培养并收获细胞,利用
Trizol试剂提取总 RNA,并进行 RNA纯度和浓度测
定;利用OneStepSYBRPrimeScriptTM RTPCR试剂
盒进行实时荧光定量 RTPCR反应,严格按照试剂
盒说明书进行;利用 RocheLightCycler20全自动
荧光定量 PCR仪软件进行结果分析。引物序列如
下:内参 GADPH正引物序列为:5′ACGCATTTG
GTCGTATTGGG3′;负引物序列为:5′TGATTTTG
GAGGGATCTCGC3′,扩增片段为242bp;pS2正引物
序列为:5′CACCATGGAGAACAAGGTGA3′;负引物
序列为:5′GCAGATCCCTGCAGAAGTGT3′,扩增片
段为 149bp;ERα正引物序列为:5′AGATA
ATCGACGCCAGGGTG3′;负引物序列为:5′AG
CATAGTCATTGCACACTGCAC3′,扩增片段为 149
bp;ERβ正引物序列为:5′TCCTATGTAGACAGC
CACCATG3′;负引物序列为:5′GCCCACCTTC
CAAGTTAGTGAC3′,扩增片段为186bp。
2.7 数据统计 实验结果均用 珋x±s表示,用
SPSS110软件进行数据处理,OnewayANOVA单
因素方差分析,组间比较采用t检验,P<005为有统
计学意义。
3 结果
3.1 对性未成熟小鼠子宫系数的影响 己烯雌酚
组小鼠子宫系数为(0482±0057),与正常组
(0087±0013)相比有明显增高(P<001)。胶艾
汤及参芪胶艾汤低、高剂量组子宫系数均有上升的
趋势,依次为(0096±0021),(0119±0016),
(0091±0010)和(0159±0040);其中,2个高剂
量组与正常组相比有显著性差异(P<005);参芪
胶艾汤高剂量诱导小鼠子宫增重的效应最为显著,
但仍明显不及己烯雌酚组(图1)。
3.2 含药血清对ER(+)MCF7细胞增殖的影响
己烯雌酚组可见细胞增殖明显加快(P<001),并
具有时间依赖性。高剂量胶艾汤及参芪胶艾汤组含
药血清也具有明显的促进 MCF7细胞增殖的效应,
24h和48h时与正常组相比均具有显著性差异
12
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1.正常组;2.己烯雌酚组;3.胶艾汤25g·kg-1·d-1组;
4.胶艾汤50g·kg-1·d-1组;5.参芪胶艾汤
25g·kg-1·d-1组;6.参芪胶艾汤50g·kg-1·d-1组)量。
注:与正常组相比,1)P<001,2)P<005。
图1 胶艾汤及参芪胶艾汤对性未成熟小鼠子宫
系数的影响(珋x±s,n=10)
(P<001或005)。其中尤以参芪胶艾汤含药血
清的促增殖效应更为显著。当在体系中加入雌激素
受体拮抗剂ICI182,780时,与未加入拮抗剂的相应
组别相比,胶艾汤及参芪胶艾汤的促细胞增殖效应
明显受到了抑制(P<001或005),与正常组相比
已无显著性差异(表1)。
3.3 含药血清对 ER(+)MCF7细胞 pS2mRNA表
达的影响 己烯雌酚组含药血清对pS2mRNA表达
具有明显的促进作用(P<001)。而胶艾汤及参芪
胶艾汤也可使pS2表达明显升高(P<001);而且该
作用可被 ICI182,780所拮抗,即同时加入 ICI182,
780后可见MCF7细胞 pS2表达明显低于相应的未
加入拮抗剂的中药方剂组(P<001)(图2)。
表1 胶艾汤及参芪胶艾汤含药血清对MCF7细胞增殖的影响(珋x±s,n=6)
组别 剂量/kg·d-1 24h 48h
正常 - 0214±0029 0313±0057
己烯雌酚 035mg 0464±00231) 0572±00341)
胶艾汤 50g 0372±00371) 0477±00612)
参芪胶艾汤 50g 0326±00281) 0399±00242)
胶艾汤+ICI182,780 50g 0225±00143) 0293±00243)
参芪胶艾汤+ICI182,780 50g 0240±00393) 0337±00364)
注:与正常组相比1)P<001,2)P<005;与加入相同中药方剂含药血清但未加ICI182,780的相应组别相比3)P<001,4)P<005。
1.正常组;2.己烯雌酚组;3.胶艾汤50g·kg-1·d-1组;
4.参芪胶艾汤50g·kg-1·d-1组;
5.胶艾汤50g·kg-1·d-1组+ICI182,780;
6.参芪胶艾汤50g·kg-1·d-1组+ICI182,780;
注:与正常组相比1)表示P<001,2)表示P<005;与加入
相同剂量含药血清但未加ICI182,780的相应组别相比,
3)表示P<001。
图2 胶艾汤及参芪胶艾汤含药血清对MCF7细胞
pS2mRNA表达的影响(珋x±s,n=3)
3.4 含药血清对 ER(+)MCF7细胞 ERα,ERβ
mRNA表达的影响 己烯雌酚组含药血清可明显提
高MCF7细胞ERα和ERβmRNA的表达水平(P<
001)。胶艾汤及参芪胶艾汤高剂量组也可见
MCF7细胞ERα和ERβ表达水平的提高(P<001
或P<005)。其中,参芪胶艾汤含药血清对 MCF7
细胞ER亚型表达,特别是对 ERβ亚型的升高作用
非常显著(图3,4)。
1.正常组;2.己烯雌酚组;3.胶艾汤50g·kg-1·d-1组;
4.参芪胶艾汤50g·kg-1·d-1组;
注:与正常组相比,1)表示P<001,2)表示P<005。
图3 胶艾汤及参芪胶艾汤含药血清对MCF7细胞
ERαmRNA表达的影响(珋x±s,n=3)
4 讨论
中草药植物及其复方在妇女保健和妇科疾病的
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1.正常组;2.己烯雌酚组;3.胶艾汤50g·kg-1·d-1组;
4.参芪胶艾汤50g·kg-1·d-1组;
注:与正常组相比,1)表示P<001,2)表示P<005。
图4 胶艾汤及参芪胶艾汤含药血清对MCF7细胞
ERβmRNA表达的影响(珋x±s,n=3)
治疗中有着广泛的应用。作者在以前的实验中曾经
发现:多味妇科常用中药及其有效成分具有类雌激
素样作用或活性;但目前对于在临床上常用的妇科
中药方剂的作用靶点及其机制的研究尚显不足。本
实验所选取的中药方剂:胶艾汤及其加味方参芪胶
艾汤就是在临床上应用已久的妇科要方。
应用动物实验———小鼠子宫增重法检测药物的
雌激素活性是一种最常用的评价待测物雌激素样作
用的方法[3]。作者在以往的研究中曾发现:多种妇
科常用单味中药具有促进小鼠子宫增重的效应[4]。
本研究中的整体动物实验结果进一步显示:胶艾汤
与参芪胶艾汤也具有子宫增重效应;尽管与己烯雌
酚组尚有明显差异,但2种中药方剂的高剂量组较
正常对照组具有非常显著的促子宫增重效应,即雌
激素样作用。该实验结果同时也提示:在临床妇科
应用中应注意到这2种方剂在一定条件、剂量下的
“子宫增重”效应,特别是应用于年轻女性患者时更
应全面考虑。
雌激素依赖性肿瘤细胞———ER(+)MCF7增
殖实验是检测受试物雌激素活性的重要方法[5]。
本实验结果提示:胶艾汤及其加味方参芪胶艾汤
的含药血清具有促进 MCF7细胞增殖的效应,且其
效应可以被 ER拮抗剂 ICI182,780所拮抗;说明
其促ER(+)细胞增殖的效应是通过ER途径实现
的。另外,据文献报道:在 MCF7细胞内,pS2是重
要的雌激素靶蛋白,雌二醇可明显诱导其表达增
加[67]。胶艾汤及参芪胶艾汤的含药血清也可以
促进 MCF7细胞内 pS2mRNA的表达,说明2种中
药方剂具有类雌激素样作用;ICI182,780拮抗实
验的结果证明:其发挥类雌激素样作用也是通过
雌激素受体途径实现的。
MCF7虽然为雌激素受体阳性细胞,但在雌激
素耗竭的情况下,因雌激素水平过低将导致部分雌
激素受体降解,ER表达水平将下降。加入受试物
后,己烯雌酚组可见ERα和ERβ表达水平显著提
高;而胶艾汤及参芪胶艾汤组ERα和ERβ表达水
平也可见明显升高。同时,结果还显示:中药方剂组
ERα水平虽然较正常对照组有了显著提高,但增高
程度明显不及己烯雌酚组;而相对于阳性药物,中
药方剂含药血清对 ERβ表达的升高作用更为显
著,其改变幅度与己烯雌酚组基本相等。因此,比
较而言,中药方剂组使 MCF7细胞内 ERβ/ERα
比值有所升高。据文献报道,ERα亚型在介导ER
(+)肿瘤细胞增殖中起着重要的作用。在癌变细
胞中,ERβ与 ERα比值趋于下降[8]。而实验中
中药方剂组可以使MCF7细胞内ERβ相对含量升
高,这将在一定程度上缓解或降低肿瘤细胞增殖
的趋势;这可能也是前述 MTT实验中中药方剂组
MCF7细胞增殖率上升幅度明显低于己烯雌酚组
的原因之一。也就是说,中药方剂在妇科疾病治
疗过程中对肿瘤细胞的刺激作用比采用雌激素替
代治疗明显有所降低。
此外,胶艾汤在临床上还常用于治疗妇女更年
期崩漏等症,具有缩宫、调经、止血作用[910]。而女
性伴随着其衰老过程,各组织 ERs水平逐渐有所下
降。本实验证明胶艾汤具有提高 ER(+)靶细胞
ERs表达水平的作用,这将从另一方面使内源性雌
激素更有效地与靶器官结合并发挥效应,从而在一
定程度上纠正了机体的内分泌失衡状态。
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Researchonphytoestrogeniceffectsandtheirmechanismsof
JiaoaitangandShenqijiaoaitang
ZHAOPiwen,NIUJianzhao,WANGJifeng,YUJie,HAOQingxiu,LIYadong
(BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China)
[Abstract] Objective:TostudythephytoestrogenicefectsandtheirpossiblemechanismsofJiaoaitangandshenqijiaoaitang
throughthetestsinmiceandER(+)MCF7cels.Method:Sixtykunmingmiceweighing912gwererandomlydividedinto6
groups:solventcontrolgroup(administratedequaldoseofdiswater),diethylstilbestrolcontrolgroup(administrateddiethylstilbestrolat
adoseof035mg·kg-1·d-1)and4Chinesemedicinetreatedgroups(administratedloworhighdosesofJiaoaitangandShenqi
jiaoaitangat25g·kg-1·d-1or50g·kg-1·d-1respectively).Afteradministrationfor4days,themiceweresacrificed;uterus
wasremovedandweighed,uterusratewascalculcated.Thebloodserumwasalsoseparated.TheproliferationrateofMCF7celsinflu
encedbyJiaoaitangandShenqijiaoaitangwasdeterminedbyMTTassay.PS2,ERαandERβmRNAexpressionwasquantifiedbyRe
altimePCRassay.EstrogenreceptorantagonistICI182,780wasemployedasatool.Result:AdministrationofJiaoaitangandShenqi
jiaoaitangathighdosesignificantlyincreaseduterusrateinmice(P<005).Thepharmacologicalserumfromtwohighdosagegroups
ofChineseherbalmedicinedecoctionsignificantlyenhancedproliferationrateofMCF7cels(P<005or001),whiletheirefects
wereblockedbyICI182,780(P<005or001).ThepharmacologicalserumcouldcauseelevationofpS2level(P<001)which
wouldbeobviouslyinhibitedbyICI182,780(P<001).ERαandERβmRNAlevelswerealsoelevatedsignificantly(P<005and
P<001respectively).Conclusion:JiaoaitangandShenqijiaoaitanghavephytoestrogenicefects,andtheirefectswereatainedvia
ERpathway.TheycanalsoincreasethemRNAlevelsofestrogenreceptorsubtypes,especialyERβ.
[Keywords] Jiaoaitang;Shenqijiaoaitang;photoestrogenicefects;uterusrate;MCF7cels;celproliferation;estrogenre
ceptorsubtypes
[责任编辑 古云侠]
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