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Vol.34，Issue 3
February，2009
第 34 卷第 3 期
2009 年 2 月
牛磺酸对舒张性心力衰竭大鼠心肌细胞
钙超载的拮抗作用
张晓丹，渠永清*，张婷姗，张 琪
（哈尔滨商业大学 药学院，黑龙江 哈尔滨 150076）
[摘要] 目的：观察牛磺酸（Tau）对舒张性心力衰竭（DHF）大鼠心肌细胞内钙离子浓度[Ca2+]i 和心肌细胞膜上 ATP 酶
活性的影响。方法：采用腹主动脉缩窄法建立 DHF 模型，术后 4 周随机分为模型组，Tau 高、中、低剂量组（400，200，100
mg·kg-1·d-1）4 组（n=10），另有假手术组 10 只。连续给药 4 周，酶解法分离 DHF 大鼠心肌细胞，以 Fluo-3AM 荧光指示剂负
载，应用激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）技术检测心肌细胞内[Ca2+]i变化，[Ca2+]i用荧光强度（FI）表示；通过 ATP 酶试剂
盒，采用酶促反应定磷比色法测定心肌细胞膜上 ATP 酶活性。结果：与假手术组相比，模型组大鼠心肌细胞内 Ca2+浓度明显
上升，心肌细胞膜上 ATP 酶活性明显下降。与模型组比较，Tau 高剂量组显著降低心肌细胞内荧光值，明显升高 ATP 酶活性；
Tau 中剂量组明显降低心肌细胞内荧光值和 ATP 酶活性；Tau 低剂量组明显升高心肌细胞内荧光值，显著降低 ATP 酶活性。
结论：大剂量的 Tau 可以明显提高 DHF 大鼠心肌细胞膜 ATP 酶活性，改善 DHF 大鼠心肌细胞内 [Ca2+]i，拮抗钙超载。
[关键词] 牛磺酸；心力衰竭；ATP 酶；[Ca2+]i

舒张性心力衰竭（diastolic heart failure，DHF）
是一组以具有心力衰竭症状和体征、射血分数正常
而舒张功能异常为特征的临床综合征。DHF 的发病
机制中心肌内因素主要是心肌细胞内钙浓度改变
或钙转运异常[1-2]。心室舒张功能与收缩功能密切相
关，在收缩性心力衰竭（systolic heart failure，SHF）
的患者中，心脏舒张功能的异常与患者心衰的症状
和预后密切相关[3]。单纯心室舒张功能障碍导致的
心力衰竭的防治已成为基础和临床研究 的热点。研
究证明 DHF 时心肌细胞内存在 Ca2+超负荷，钙通
道拮抗剂是治疗 DHF 的主要药物 [4-6]。牛磺酸
（taurine，Tau）是具有广泛生理药理作用的中药有
效成分，它也是存在于心肌的 β型的含硫氨基酸，
通过剂量换算其在成年大鼠心肌中的含量约为
17～25 mg。大量研究证实，Tau 具有细胞保护作用，
其保护心肌细胞的重要机制是抑制钙超载[7]。本实
验旨在探讨 Tau 对 DHF 大鼠心肌细胞内的钙超载
是否有拮抗作用，为寻找抗舒张性心衰药物提供实

[收稿日期] 2008-07-23
[基金项目] 黑龙江省 2008 年研究生创新科研资金项目（YJSCX2008-
184HLJ）
[作者简介] 张晓丹，教授，博士，研究方向：心血管药理。Tel：
(0451)84605022
[通信作者] ﹡渠永清，Tel:13101610490，E-mail：quyongiqngle@126.com
验基础。
1 材料
1.1 动物
Wistar 大鼠，(180±20) g，雌雄各半，北京维通
利华实验动物技术有限公司提供。动物合格证号
SCXK（京）2007-0001。
1.2 药品与试剂
Tau（上海楷洋生物技术有限公司，纯度≥
99%）；Fluo-3AM（美国 Bio-Microscience Ltd 公司）；
胶原酶Ⅱ（德国 Invitrogen 公司）；ATP 酶试剂盒（南
京建成生物工程研究所，批号 20080317）；蛋白
定量(考马斯亮蓝法)测试盒（南京建成生物工程研
究所，批号 20080424）。
1.3 仪器
BIOPAC 十六导生理记录仪（美国 BIOPAC 公
司）；Langendorf 离体心脏灌流装置（美国 BIOPAC
公司）；TCS SP2 激光扫描共聚焦显微镜 Insight Plus
（德国莱卡公司）；LDZ5-2 型低速自动平衡离心机
（北京医用离心机厂）；UV-210 紫外-可见分光光度
计（上海尤尼柯仪器有限公司）。
2 方法
2.1 DHF 大鼠模型的制备及分组和给药
采用腹主动脉缩窄法制作 DHF 大鼠模型。大


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鼠用 3%戊巴比妥钠以 0.003 mL·g-1 腹腔注射麻醉，
使之仰卧并固定于大鼠手术台上，腹部去毛消毒，
剑突下腹正中切口，分层打开腹腔，在肾动脉分支
以下钝性游离腹主动脉，将 9 号注射器针头平行置
于腹主动脉上，用 4 号手术丝线将腹主动脉和 9 号
针头一同结扎，然后缓慢将针头撤出，使大鼠腹主
动脉直径减少 35%~40%，关腹，逐层缝合。术后 4
周，将模型大鼠随机分为 4 组，每组 10 只，分别
为模型组（0.9%生理盐水 2 mL·d-1）、Tau 高剂量组
（400 mg·kg-1·d-1）、Tau 中剂量组（200 mg·kg-1·d-1）、
Tau 低剂量组（100 mg·kg-1·d-1），均灌胃给药，连续
给药 4 周；造模时另取同源 Wistar 大鼠作为假手术
组 10 只，该组仅游离腹主动脉，但不缩窄，其他
操作与手术组相同[8-12]。
2.2 心肌细胞内[Ca2+]i 的测定
参考文献 [13-14]报道方法加以改良。通过
Langendorf 离体心脏灌流装置无钙灌流液灌流，使
心脏停搏，换加有胶原酶（300 mg·L-1）和胰酶（100
mg·L-1）的有钙 K-H 液 30 mL 循环灌流 20 min，K-H
液灌流冲去残留酶液。从灌流装置上取下心脏，将
左心室剪碎、吹打、离心（800 r·min-1 离心 5 min），
弃上清液。K-H 液洗涤细胞 3 次，用 200 目尼龙网
过滤细胞。取稳定好的细胞悬液加Fluo-3AM 染色，
37 ℃孵育 45 min，用 PBS 洗细胞 2 次，离心去除
负载液后，洗去细胞外液残余染料，将细胞稀释，
放入 200～300 μL 的浴槽。将负载好的细胞在激光
扫描共聚焦显微镜下扫描细胞内荧光强度，激发波
长为 488 nm，放射波长 526 nm，取荧光强度平均
值为每份标本的测定值，以荧光强度（FI）代表细
胞内钙含量。
2.3 心肌细胞膜 ATP 酶活性的测定
2.3.1 心肌细胞膜的制备 动物脱臼处死，取出心
脏，置预冷的 50 mol·L-1 Tris-HCI 缓冲液（500 mL
溶液中含 Tris 3.087 5 g，pH 7.7），冲洗干净并去除
大血管、脂肪及结蒂组织等，并称重。将动物心房
肌与心室肌分别置于不同烧杯，剪碎并加入 5 倍
Tris-HCl 缓冲液制备匀浆，4 层纱布过滤，所制匀
浆 800 r·min-1 离心 10 min，上清液 2 万 r·min-1 离心
30 min，弃上清，沉淀用缓冲液复溶后再次离心同
前，所得沉淀用缓冲液调整蛋白含量 0.8 g·L-1，考
马斯亮蓝法测定膜悬液蛋白含量，新鲜即用。以上
操作均在冰浴下（0~4 ℃）进行[15]。
2.3.2 ATP 酶活性分析 ATP 酶可使 ATP 分解成
二磷酸腺苷(ADP)和无机磷，通过反应终止时产生
无机磷的多少反映 ATP 酶的活性。考马斯亮蓝法测
定膜蛋白含量。具体操作按试剂盒说明书进行。酶
活性单位以 1 mg·h-1 蛋白质分解 ATP 产生无机磷的
浓度（μmol·mg-1·h-1）表示，计算 ATP 酶恢复率。
2.4 统计分析
数据以 x ±s 表示，均数比较用单因素方差分析
（one-way ANOVA）。方差齐时应用 LSD 法，不齐
时用 Tamhane’s T2 法；校正采用协方差，计数资料
比较采用卡方检验。显著性差异水平 P<0.05。所有
统计学处理均由 SPSS 13.0 统计完成。
3 结果
3.1 对 DHF 大鼠心肌细胞内[Ca2+]i 的影响
与假手术组相比，模型组的大鼠心肌细胞内
Ca2+浓度明显上升（P<0.05）。与模型组比较，Tau
高剂量组心肌细胞内荧光值显著下降（P<0.01）；
Tau 中剂量组心肌 细胞内荧 光值明显 降低
（P<0.05）；Tau 低剂量组心肌细胞内荧光值明显升
高（P<0.05）。表明 Tau 高剂量组可以降低 DHF 大
鼠心肌细胞内 Ca2+荧光值，即降低心肌细胞内的
[Ca2+]i，缓解钙超载（表 1）。
表 1 Tau 对 DHF 大鼠心肌细胞内 Ca2+浓度
的影响( x ±s，n=10)
组别 剂量/mg·kg-1 FI
假手术 - 21.32±3
模 型 - 29.56±31)
牛磺酸 400 18.58±42)
200 24.46±11)
100 34.69±31)
注：与模型组相比 1)P<0.05 ，2)P<0.05; 每组计算的细胞数为 20。

3.2 对 DHF 大鼠心肌细胞膜 ATP 酶活性的影响
与假手术组相比，模型组的心肌细胞膜
Na+-K+-ATP 酶、Ca2+-ATP 酶、Mg2+-ATP 酶活性明
显下降(P<0.05)。与模型组比较，Taur 高剂量组心
肌细胞膜 Na+-K+-ATP 酶、Ca2+-ATP 酶、Mg2+-ATP
酶活性都显著上升(P<0.05)；Tau 中剂量组心肌细胞
膜 Na+-K+-ATP 酶和 Ca2+-ATP 酶活性明显下降
(P<0.05)，Mg2+-ATP 酶活性无显著性变化；Tau 低
剂量组心肌细胞膜 Na+-K+-ATP 酶和 Ca2+-ATP 酶活


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性显著下降(P<0.01)，Mg2+-ATP 酶活性明显下降
(P<0.05)。表明 Tau 高剂量组可以显著提高 DHF 大
鼠心肌细胞膜 Na+-K+-ATP 酶、Ca2+-ATP 酶和
Mg2+-ATP 酶活性，且较其他各组效果明显（表 2）。
表 2 Tau 对 DHF 大鼠心肌细胞膜 ATP 酶活性的影响
( x ±s，n=10) μmol·mg-1·h-1
组别 剂量
/mg·kg- 1
Ca2+-ATP 酶 Mg2+-ATP 酶 Na+-K+-ATP 酶
假手术 – 16.35±0.21 14.36±0.45 18.65±0.25
模型 – 12.34±0.421) 9.35±0.261) 15.85±0.111)
牛磺酸 400 17.36±0.141) 13.24±0.431) 20.15±0.311)
200 6.96±0.551) 8.65±0.63 10.36±0.521)
100 4.35±0.43 2) 5.22±0.511) 8.32±0.54 2)
注：与模型组相比 1)P<0.05，2)P<0.05。

4 讨论
Na+/Ca2+交换体广泛分布在心、脑、肾、肺、
大肠、胰和脾，以心脏含量最高，是双向转运系统，
按 3 1∶ 的比例进行 Na+/Ca2+交换。生理状态下，主
要转运方向是舒张期钙外排，但当 Na+/Ca2+交换泵
偏于 “反向”模式转运时，就会导致了舒张期的钙负
荷过量，从而影响了心肌的舒张功能，导致 DHF。
DHF 时心肌细胞内存在 Ca2+超负荷。引起钙超载的
原因有很多，其中 Na+/Ca2+交换是导致 Ca2+超载的
主要途径[16]。Na+-K+-ATP 酶广泛分布于细胞膜上，
维持细胞内外的 Na+，K+的浓度梯度，保持细胞的
膜电位。抑制 Na+-K+-ATP 酶的泵活性，会使胞内
K+减少、Na+积聚，引起膜去极化、细胞膜电压门
控Ca2+通道激活和Na+/Ca2+交换器启动，导致[Ca2+]i
升高[17]。Na+-K+-ATP 酶活性降低是引起胞内钙超
载的一个重要因素[18]。细胞膜上 Ca2+-ATP 酶主要
是将胞内 Ca2+泵出胞外，与内质网中 Ca2+-ATP 酶
共同直接调节胞内 Ca2+浓度[19]。Tau 对细胞 Ca2+稳
态调节的作用近年来得到高度重视。并且在一定剂
量时具有正性肌力作用，而且对心肌收缩力的影响
具有小剂量增强，大剂量抑制的双相特征[20]。Tau
本身并不与 Ca2+直接发生反应，但它作用于膜的磷
脂双分子层，通过调节膜与 Ca2+的结合控制细胞内
Ca2+含量的稳定[21]。Tau 能刺激细胞膜上钙激活的
ATP 酶转运效率，间接提高膜对钙的摄取[22]。Tau
显著抑制心肌细胞内钙离子浓度，增加 ATP 含量，
拮抗钙超载。
本实验结果表明，和假手术组相比，DHF 模型
大鼠的心肌细胞内游离钙离子浓度升高和心肌细
胞膜上 ATP 酶活性下降，说明 DHF 很有可能是细
胞膜 Na+/Ca2+交换减少引起的。与模型组相比，Tau
高剂量组明显降低细胞内钙浓度和升高 ATP 酶活
性，说明 Tau 有可能使心肌细胞内 Na+浓度降低，
减少反向模式 Na+/Ca2+交换量，或者促进正向工作
模式增加 Na+/Ca2+交换使心肌内 Ca2+浓度降低，从
而改善了左室的舒张功能。Tau 中剂量组降低细胞
内钙浓度，但作用不如高剂量。Tau 低剂量组心肌
细胞内钙离子浓度明显升高及 ATP 酶活性明显下
降，说明 Tau 小剂量使用时可能是通过抑制心肌细
胞膜 ATP 酶活性，心肌细胞内 Na+浓度升高，从而
促进 Na+/Ca2+的反向工作模式，而起到促进 Ca2+内
流的作用。
由实验结果可知，大剂量 Tau 对 DHF 心肌细
胞膜 Ca2+-ATP 酶和 Na+-K+-ATP 酶活性降低有显著
拮抗作用，其机制可能主要是减轻膜损伤和直接激
活膜上 Ca2+依赖的 ATP 酶活性，增强膜对 Ca2+的
转运能力。且 Tau 的药理剂量远大于其生理剂量，
无毒副作用。所以大剂量的 Tau 可以非常显著的改
善 DHF 大鼠的心肌舒张功能，同时降低心肌细胞
游离[Ca2+]i，拮抗钙超载。同时本实验还证明小剂
量的 Tau 促进钙超载，不能用于 DHF 的治疗。Tau
对 DHF 心肌细胞内钙超载拮抗作用的构效关系和
作用的持续时间等问题今后应深入研究，为临床
Tau 治疗 DHF 提供理论依据。
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Antagonism for different doses of taurine on calcium overload in myocardial
cells of diastole heart failure rat model

ZHANG Xiaodan，QU Yongqing*，ZHANG Tingshan，ZHANG Qi
(School of Pharmacy，Harbin University of Commerce，Harbin 150076，China)

[Abstract] Objective：To study the effects of different doses of taurine(Tau) on calcium ion concentration ([Ca2+]i) and
ATPase on cardiocyte membrane of diastole heart failure rats. Method：Diastole heart failure model was established by the
coarctation of abdominal aorta. Four weeks after operation，forty diastole heart failure rats were divided into four groups randomly as
follows，model (normal saline 2 mL)，taurine (400 mg·kg-1·d-1)，taurine (200 mg·kg-1·d-1)，taurine (100 mg·kg-1·d-1)，with 10 rats for
each group (n=10)，and 10 sham operation rats was taken as control(normal saline，2 mL). After 4 weeks administration，Isolate
single cardiocyte by enzymatic isolation method which were loaded with Ca2+-sensitive fluorescent indicator Fluo-3/AM. [Ca2+]i was
measured by laser scanning confocal microscope[LSCM]，and represented it by fluorescent intensity[FI]; ATPase activity of cell
membrane was measured by the method of enzymatic reaction chromatometry. Result：Compared with the control group，[Ca2+]i in
cardiocyte increased markedly and the ATPase activity of cardiocyte membrane decreased significantly in the model group.
Compared with the model group，fluorescent value decreased and ATPase activity increased significantly in Tau high-dose group;
fluorescence value and ATPase activity decreased significantly in Tau mid-dose group; fluorescent value decreased and ATPase
activity increased significantly in Tau low-dose group. Conclusion：Large dosage of Tau can increase ATPase activity on cardiocyte
membrane，improve [Ca2+]i in cardiocyte and antagonise calcium overload of DHF rats.
[Key words] taurine; heart failure; ATPase; calcium ion
[责任编辑 古云侠]