全 文 ：高效液相色谱法同时测定乌药中的４种生物碱
韩　铮，苏慧丽，陈　娜，栾连军，吴永江
（浙江大学 药学院 现代中药研究所，浙江 杭州 ３１００５８）
［摘要］　目的：建立同时测定乌药中４种生物碱的ＨＰＬＣ法。方法：ＡｇｉｌｅｎｔＺＯＲＢＡＸＳＢＣ１８色谱柱（４６ｍｍ×２５０ｍｍ，５
μｍ）；流动相Ａ相为水（先加入１５‰的二乙胺，再用冰醋酸调ｐＨ３０），Ｂ相为乙腈，线性梯度洗脱；ＵＶ检测波长２８９ｎｍ。结
果：波尔定碱在０４２８～８５６μｇ，降波尔定碱在２１２２～３１８３μｇ，网状香荔枝碱在０７６０～１５２０μｇ，ｌｉｎｄｅｒｅｇａｔｉｎｅ在００２０４～
０４００８μｇ与峰面积呈良好的线性关系，平均加样回收率为９９１８％，１００９４％，１００３１％，９９１７％，ＲＳＤ分别为１７％，２５％，
２１％，３０％。结论：该方法快速简便、准确，可用于乌药的质量评价。
［关键词］　乌药；生物碱；含量测定；高效液相色谱法
［收稿日期］　２００８１０２１
［通信作者］　吴永江，Ｔｅｌ：（０５７１）８８２０８４５５，Ｅｍａｉｌ：ｙｊｗｕ＠ｚｊｕ．
ｅｄｕ．ｃｎ
　　乌药为樟科山胡椒属植物乌药Ｌｉｎｄｅｒａａｇｇｒｅｇａ
ｔａ（Ｓｉｍｓ）Ｋｏｓｔｅｒｍ．的膨大块根，为传统常用中药，
是重要的温胃理气止痛药，具有温中散寒、理气止痛
的功效。临床上常与多种中药配伍，治疗胃寒气滞、
胸闷脘痛、呃逆、气厥头痛以及一切气痛等症［１］。
乌药主要含有挥发油、异喹啉生物碱及呋喃倍半萜
及内酯等化学成分，其中生物碱类成分是乌药的主
要活性成分，现代药理学研究表明其具有广泛的抗
炎和抗关节损坏等药理活性［２３］。迄今为止，关于乌
药中化学成分的质量分析，主要集中在挥发油以及
倍半萜类成分［４５］，对于其中生物碱类成分的质量评
价尚无研究报道，致使乌药的临床应用受到影响，也
制约了乌药的开发和利用。该研究首次采用高效液
相色谱法对乌药中的４种主要生物碱类成分进行定
量分析，为乌药质量评价提供了一种灵敏、可靠的分
析方法。
１　仪器与试药
Ｗａｔｅｒｓ２６９５高效液相色谱仪；对照品为由本实
验室自制，分别为波尔定碱、降波尔定碱、ｌｉｎｄｅｒｅｇａ
ｔｉｎｅ、网状香荔枝碱，其中 ｌｉｎｄｅｒｅｇａｔｉｎｅ为新化合物，
通过 ＮＭＲ，ＭＳ，ＩＲ等确定结构，通过高效液相色谱
面积归一化法分析，４种对照品的纯度均 ＞９８％，结
构如图１所示；乌药购于浙江杭州市中药饮片厂，由
浙江大学药学院余娟华副教授鉴定为Ｌａｇｇｒｅｇａｔａ；
甲醇、乙腈（色谱纯，德国 Ｍｅｒｃｋ公司），二乙胺（分
析纯，上海五联化工厂），醋酸（分析纯，中国杭州化
学试剂有限公司），ＭｉｌｉＱ超纯水。
图１　４种生物碱的结构式
２　方法与结果
２．１　色谱条件　ＡｇｉｌｅｎｔＺＯＲＢＡＸＳＢＣ１８色谱柱
（４６ｍｍ×２５０ｍｍ，５μｍ）；流动相 Ａ相为水（先加
入０１５％的二乙胺，再用冰醋酸调ｐＨ３０），Ｂ相为
乙腈，梯度洗脱条件：０～２０ｍｉｎ，Ｂ相由５％线性升
至２５％；２０～３０ｍｉｎ，保持 ６０％Ｂ。流速 １ｍＬ·
ｍｉｎ－１，检测波长２８９ｎｍ，柱温２５℃，进样量为 ２０
μＬ。对照品和样品ＨＰＬＣ图见图２。
２．２　对照品溶液的制备　分别称取４种对照品适
量，精密称定，甲醇溶解，分别配制成波尔定碱０８５６
ｇ·Ｌ－１，降波尔定碱 １０６１ｇ·Ｌ－１，ｌｉｎｄｅｒｅｇａｔｉｎｅ
１００２ｇ·Ｌ－１，网状香荔枝碱１５２０ｇ·Ｌ－１的储备
液。稀释后，配成６个浓度水平的对照品溶液。
２．３　供试品溶液的制备　取１０ｇ乌药药材粉末，
·３８５·
第３４卷第５期
２００９年３月
　　　　　　 　 　 　 　 　　　　　　 　 　 　 　
Ｖｏｌ．３４，Ｉｓｓｕｅ　５
　Ｍａｒｃｈ，２００９
　　
１．波尔定碱；２．降波尔定碱；３．网状香荔枝碱；４．ｌｉｎｄｅｒｅｇａｔｉｎｅ。
图２　生物碱对照品（Ａ）和乌药样品（Ｂ）的ＨＰＬＣ图
浸泡１ｈ，超声４０ｍｉｎ，过滤，残渣再次加入１００ｍＬ
　　
精密称定，置２５０ｍＬ锥形瓶中，加入１００ｍＬ甲醇，
５０ｍＬ１％的醋酸水溶液（ｐＨ约为３）溶解，用等体
积甲醇超声４０ｍｉｎ，过滤，合并过滤液，蒸干，加入的
乙醚萃取３次（５０，５０，５０ｍＬ），弃去乙醚层，水层用
氨水调至 ｐＨ约为 １０，用氯仿萃取 ４次（每次 ５０
ｍＬ），合并氯仿萃取液，蒸干，残渣用甲醇溶解，定容
至１０ｍＬ。
２．４　标准曲线与线性范围　在２１项下色谱条件
下，依次分析６个不同浓度的对照品溶液，平行测定３
次，测得各峰面积。以峰面积（Ｙ）对生物碱进样量
（Ｘ，μｇ）进行线性回归，各生物碱的回归方程见表１。
表１　各被测成分标准曲线、线性范围、检测限和定量限
成分 回归方程 Ｒ２ 线性范围／μｇ 检测限／ｎｇ 定量限／ｎｇ
波尔定碱 Ｙ＝１７２０８×１０６Ｘ＋１４４１６９ ０９９９８ ０４２８～８５６ ０２０９０ ０６２６
降波尔定碱 Ｙ＝１５３６８×１０６Ｘ＋８２３８４０ １００００ ２１２２～３１８３ ００４９６ ０１５０
网状香荔枝碱 Ｙ＝１４４４８×１０６Ｘ＋４６０５７ ０９９９９ ０７６０～１５２０ ０８６７０ ２６０２
ｌｉｎｄｅｒｅｇａｔｉｎｅ Ｙ＝２０２９８×１０６Ｘ－５７１２８ ０９９９８ ００２０４～０４００８ ４３１４０ １２９４４
２．５　精密度试验　仪器精密度试验：取供试品溶液
１份，连续进样６次，计算峰面积的 ＲＳＤ。结果，波
尔定碱为０１９％，降波尔定碱为０２３％，ｌｉｎｄｅｒｅｇａ
ｔｉｎｅ为０９８％，网状香荔枝碱为 １４６％，表明仪器
性能稳定。
日内和日间精密度试验，在１ｄ内，平行制备６
份供试品溶液，在２１项下色谱条件下测定各生物
碱含量（ｍｇ·ｋｇ－１），计算日内ＲＳＤ。在连续５ｄ中，
每天平行制备３份供试品溶液，测定各生物碱含量，
计算日间ＲＳＤ。日内和日间精密度结果见表２。
表２　４种成分的日内、日间精密度（ｎ＝６）
成分
日内精密度
珋ｘ±ｓ／ｍｇ·ｋｇ－１ ＲＳＤ／％
日间精密度
珋ｘ±ｓ／ｍｇ·ｋｇ－１ ＲＳＤ／％
波尔定碱 ０６８１４±０００５９ ０６７ ０６８０３±００１５３ ２３０
降波尔定碱 ４４５８０±００３１０ ０６７ ４４６３０±０００５０ ０５５
网状香荔枝碱 ０２３４５±０００６９ ２９６ ０２３５４±０００７３ ３００
ｌｉｎｄｅｒｅｇａｔｉｎｅ ００２６１±００００３ １２０ ００２６７±００００７ ２７０
２．６　稳定性试验　取供试品溶液１份，分别在０，
２，４，８，１６，２４ｈ进样分析，测定各生物碱峰面积，计
算 ＲＳＤ，分别为波尔定碱 ０７７％，降波尔定碱
１２％，ｌｉｎｄｅｒｅｇａｔｉｎｅ１８％，网状香荔枝碱１５％，表
明供试品溶液在２４ｈ内稳定。
２．７　加样回收率试验　平行取６份药材样品，每份
０５０ｇ，分别加入０５１３６ｍｇ波尔定碱、３３１８２ｍｇ
将波尔定碱、００７６０ｍｇ网状香荔枝碱、００１００ｍｇ
ｌｉｎｄｅｒｅｇａｔｉｎｅ生物碱对照品，依２．２所述方法制备供
试品溶液并测定，计算回收率，结果见表３，表明方
法回收率良好。
２．８　样品测定　采用上述方法，对市售４批乌药的
药材饮片样品进行了４种生物碱成分的含量测定，
结果见表４。各批样品中，降波尔定碱的含量最高，
波尔定碱次之。
３　讨论
３．１　流动相的选择　被检测的生物碱结构十分相
似，不易分离，本实验考察了多种流动相对分离效果
的影响。在甲醇水、乙腈水体系中，对各物质的洗
脱能力极弱，保留时间长，并且拖尾现象十分严重。
加入０１％二乙胺后，出峰加快，然而保留时间漂移
比较严重。水相加入０１％二乙胺再用冰醋酸将其
调至ｐＨ５，发现在甲醇水及乙腈水系统中，生物碱
在４０ｍｉｎ内出峰难以分开，峰拖尾，但是保留时间
·４８５·
第３４卷第５期
２００９年３月
　　　　　　 　 　 　 　 　　　　　　 　 　 　 　
Ｖｏｌ．３４，Ｉｓｓｕｅ　５
　Ｍａｒｃｈ，２００９
　　 表３　各生物碱的加样回收率
成分
样品中
量／ｍｇ
加入量
／ｍｇ
测得量
／ｍｇ
回收率
／％
平均回
收率／％
ＲＳＤ
／％
波尔定碱 ０５１２１０５１３６１０２７７ １００４ ９９１８ １７
　 ０５１１２ 　 １０３２１ １０１４ 　 　
　 ０５１８１ 　 １０２９９ ９９６４ 　 　
　 ０５０３４ 　 １０１２１ ９９０５ 　 　
　 ０５０９１ 　 １００７２ ９６９８ 　 　
　 ０５０５３ 　 １００６５ ９７５９ 　 　
降波尔定碱 ３３８７１３３１８２６７９１３ １０２６ １００９ ２５
　 ３３７２２ 　 ６７１３２ １００７ 　 　
　 ３３８１５ 　 ６６６９１ ９９０８ 　 　
　 ３３７３３ 　 ６８４３５ １０４６ 　 　
　 ３３５９２ 　 ６７２００ １０１３ 　 　
　 ３３６１３ 　 ６５９２８ ９７３９ 　 　
网状香荔枝碱 ００８１３００７６００１５７４ １００１ １００３ ２１
　 ００８０９ 　 ０１５６５ ９９４７ 　 　
　 ００８１６ 　 ０１６０１ １０３３ 　 　
　 ００８１２ 　 ０１５７４ １００３ 　 　
　 ００８１５ 　 ０１５８８ １０１７ 　 　
　 ００８１４ 　 ０１５５１ ９６９７ 　 　
ｌｉｎｄｅｒｅｇａｔｉｎｅ ００１６１００１００００２６１ １０００ ９９１７ ３０
　 ００１６０ 　 ００２５９ ９９００ 　 　
　 ００１５９ 　 ００２５８ ９９００ 　 　
　 ００１６１ 　 ００２５６ ９５００ 　 　
　 ００１６４ 　 ００２６２ ９８００ 　 　
　 ００１６３ 　 ００２６７ １０４０ 　 　
表４　不同批号的乌药饮片中４种生物碱的含量测定
（ｎ＝３） ｍｇ·ｇ－１　
批号 波尔定碱 降波尔定碱 网状香荔枝碱 ｌｉｎｄｅｒｅｇａｔｉｎｅ
１ ０９９８ ６６６７ ０１７０ ００３３
２ ０９７７ ５８５３ ０１６３ ００３２
３ ０７９５ ５５０８ ０１５５ ００３１
４ ０６８１ ４４５８ ０２２５ ００２６
比较稳定，且在乙腈中的分离效果要比甲醇中好。
通过选择比较，最后选择Ａ相为水中加入０１５％二
乙胺，再用冰醋酸调至 ｐＨ３０，Ｂ相为乙腈，进行梯
度洗脱的液相条件，在此条件下，各生物碱分离良
好，保留时间适中。
３．２　供试品制备方法的选择　为提高生物碱的提
取效率，减少杂质的干扰，比较了加热回流提取和超
声提取２种方法，结果表明超声提取法的效率要略
高于加热回流法，并且超声提取方法简单、快捷，因
此选择超声提取法。比较了超声提取次数及浸泡时
间的影响，结果表明１００ｍＬ甲醇浸泡１ｈ，超声４０
ｍｉｎ，超声２次的提取方法能够比较完全地提取出乌
药中的生物碱，但干扰杂质比较多，需要进一步净
化。用乙醚萃取３次，能够基本除去干扰的小极性
杂质。中和醋酸水溶液使生物碱游离后，比较了氯
仿、二氯甲烷、醋酸乙酯、正丁醇４种萃取溶剂，发现
氯仿的萃取效率最高，且干扰最少，故选择氯仿作为
最后的萃取溶剂。然后考察了萃取次数对萃取效果
的影响，结果表明萃取４次要明显优于萃取３次，从
而最终确定前述预处理方法。
［参考文献］
［１］　鱺桂新，王峥涛，徐珞珊，等．乌药的化学成分及药理作用［Ｊ］．
中国野生植物资源，１９９９，１８（３）：５．
［２］　ＷａｎｇＣ，ＤａｉＹ，ＹａｎｇＪ，ｅｔａｌ．Ｔｒｅａｔｍｅｎｔｗｉｔｈｔｏｔａｌａｌｋａｌｏｉｄｓ
ｆｒｏｍＲａｄｉｘＬｉｎｄｅｒａｅｒｅｄｕｃｅｓｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎａｎｄｊｏｉｎｔｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎｉｎ
ｔｙｐｅＩｃｏｌａｇｅｎｉｎｄｕｃｅｄｍｏｄｅｌｆｏｒｒｈｅｕｍａｔｏｉｄａｒｔｈｒｉｔｉｓ［Ｊ］．ＪＥｔｈ
ｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ，２００７，１１１（２）：３２２．
［３］　ＯｈｎｏＴ，ＮａｇａｔｓｕＡ，ＮａｋａｇａｗａＭ，ｅｔａｌ．Ｎｅｗｓｅｓｑｕｉｔｅｒｐｅｎｅｌａｃ
ｔｏｎｅｓｆｒｏｍｗａｔｅｒｅｘｔｒａｃｔｏｆｔｈｅｒｏｏｔｏｆＬｉｎｄｅｒａｓｔｒｙｃｈｎｉｆｏｌｉａｗｉｔｈｃｙ
ｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙａｇａｉｎｓｔｔｈｅｈｕｍａｎｓｍａｌｃｅｌｌｕｎｇｃａｎｃｅｒｃｅｌ，ＳＢＣ３
［Ｊ］．ＴｅｔｒａＬｅｔ，２００５，４６（５０）：８６５７．
［４］　程显隆，魏　锋，冯玉飞，等．ＲＰＨＰＬＣ法测定乌药中乌药醚内
酯和乌药内酯的含量［Ｊ］．药物分析杂志，２００３，２３（３）：２２５．
［５］　蔡立红，鱺桂新，王峥涛，等．高效液相色谱法测定乌药中乌药
醚内酯的含量［Ｊ］．中国中药杂志，２００４，２９（７）：６５７．
·５８５·
第３４卷第５期
２００９年３月
　　　　　　 　 　 　 　 　　　　　　 　 　 　 　
Ｖｏｌ．３４，Ｉｓｓｕｅ　５
　Ｍａｒｃｈ，２００９
ＳｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｆｏｕｒａｌｋａｌｏｉｄｓｉｎＬｉｎｄｅｒａａｇｇｒｅｇａｔｅ
ｂｙｈｉｇｈｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ
ＨＡＮＺｈｅｎｇ，ＳＵＨｕｉｌｉ，ＣＨＥＮＮａ，ＬＵＡＮＬｉａｎｊｕｎ，ＷＵＹｏｎｇｊｉａｎｇ
（ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＭｏｄｅｒｎＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，ＣｏｌｅｇｅｏｆＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＺｈｅｊｉａｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ３１００５８，Ｃｈｉｎａ）
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＴｏｄｅｖｅｌｏｐａｎＨＰＬＣｍｅｔｈｏｄｆｏｒｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｆｏｕｒｍａｊｏｒａｌｋａｌｏｉｄｓｉｎＬｉｎｄｅｒａａｇｇｒｅ
ｇａｔｅ．Ｍｅｔｈｏｄ：ＴｈｅａｎａｌｙｓｉｓｗａｓｃａｒｉｅｄｏｕｔｏｎａｎＡｇｉｌｅｎｔＺＯＲＢＡＸＳＢＣ１８ｃｏｌｕｍｎ（４６ｍｍ×２５０ｍｍ，５μｍ）ｗｉｔｈｇｒａｄｉｅｎｔｅｌｕｔｉｏｎ
ｕｓｉｎｇａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅｗａｔｅｒ（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ０１５％ ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ，ａｄｊｕｓｔｅｄｔｏｐＨ＝３０ｗｉｔｈａｃｅｔｉｃａｃｉｄ）ａｓｍｏｂｉｌｅｐｈａｓｅ．Ｆｌｏｗｒａｔｅｗａｓ１０
ｍＬ·ｍｉｎ－１ａｎｄｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｗａｖｅｌｅｎｇｔｈｗａｓａｔ２８９ｎｍ．Ｒｅｓｕｌｔ：Ｔｈｅｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎｃｕｒｖｅｓｗｅｒｅｌｉｎｅａｒｏｖｅｒｔｈｅｒａｎｇｅｏｆ０４２８８５６０μｇ
ｆｏｒｂｏｌｄｉｎｅ，２１２２３１８３μｇｆｏｒｎｏｒｂｏｌｄｉｎｅ，０７６０１５２０μｇｆｏｒｒｅｔｉｃｕｌｉｎｅａｎｄ００２０４０４００８μｇｆｏｒｌｉｎｄｅｒｅｇａｔｉｎｅ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ
Ｔｈｅａｖｅｒａｇｅｒｅｃｏｖｅｒｉｅｓｗｅｒｅ９９１８％ ｆｏｒｂｏｌｄｉｎｅ，１０１０％ ｆｏｒｎｏｒｂｏｌｄｉｎｅ，１００３％ ｆｏｒｒｅｔｉｃｕｌｉｎｅａｎｄ９９１７％ ｆｏｒｌｉｎｄｅｒｅｇａｔｉｎｅ，ｒｅ
ｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ｗｉｔｈＲＳＤｎｏｔｍｏｒｅｔｈａｎ３０％．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｔｈｅｄｅｓｃｒｉｂｅｄｍｅｔｈｏｄｉｓｒｅｌｉａｂｌｅａｎｄｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔａｎｄｃｏｕｌｄｂｅｕｓｅｄｆｏｒｔｈｅ
ｑｕａｌｉｔｙｃｏｎｔｒｏｌｏｆＬｉｎｄｅｒａａｇｇｒｅｇａｔｅ．
［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］　Ｌｉｎｄｅｒａａｇｇｒｅｇａｔｅ；ａｌｋａｌｏｉｄｓ；ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ；ｈｉｇｈｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ
［责任编辑　王亚君］
·６８５·
第３４卷第５期
２００９年３月
　　　　　　 　 　 　 　 　　　　　　 　 　 　 　
Ｖｏｌ．３４，Ｉｓｓｕｅ　５
　Ｍａｒｃｈ，２００９