全 文 ：农杆菌介导几丁质酶及 β１，３葡聚糖酶
基因转化半夏的研究
金波，蒋福升，余美荣，陈铌铍，丁志山
（浙江中医药大学 生命科学学院，浙江 杭州 ３１００５３）
［摘要］ 目的：将木霉来源的内切几丁质酶以及 β１，３葡聚糖酶基因片段转入半夏，使其获得抗真菌感染的特性。方
法：以半夏外植体为受体，潮霉素磷酸转移酶Ｈｐｔ为筛选标记，采用农杆菌介导法将内切几丁质酶基因 ｅｃｈ４２、葡聚糖酶基因
ｇｌｕｃ７８以及２种基因的组合ｐＣＡＭＢＩＡ（ｅｃｈ４２＋ｇｌｕｃ７８）进行遗传转化获得转化再生植株，通过 ＰＣＲ，ＲＴＰＣＲ检测转化结果。
结果：经ＰＣＲ，ＲＴＰＣＲ检测，表明３种外源基因已成功转化半夏，并在转录水平得到表达。连续多代的 ＰＣＲ追踪检测证实外
源基因已遗传至Ｔ５代。结论：带有ｅｃｈ４２，ｇｌｕｃ７８，ｐＣＡＭＢＩＡ（ｅｃｈ４２＋ｇｌｕｃ７８）表达载体的根癌农杆菌可以分别转化半夏，并表
达出相应的ＲＮＡ，进行稳定遗传。
［关键词］ 半夏；内切几丁质酶；β１，３葡聚糖酶；遗传转化；农杆菌介导
［收稿日期］ ２００８１２０８
［通信作者］ 金波，讲师，主要从事中药材生物技术研究，Ｔｅｌ：
（０５７１）８６６１３６６６，Ｅｍａｉｌ：ｊｉｎｂｏｎｔ＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ
半夏Ｐｉｎｅｌｉａｔｅｒｎａｔａ为天南星科多年生草本植
物，以干燥块茎入药，是重要的传统中药材。在半夏
野生变人工种植成功后，种植面积逐步扩大，但随着
半夏生长环境的改变和种植相对集中，栽培半夏的
病害问题日渐突出，真菌常导致半夏患根腐病、叶斑
病等［１］，且难以防治。近年来基因工程技术研究进
展迅速，抗虫抗病的转基因作物已陆续进入了大田
试验［２４］，但是在中药材的抗真菌转基因研究方面至
今还鲜有报道［５］。有研究表明用木霉 Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ
ｓｐｐ．的分生孢子悬浮液处理半夏块茎有较好的防治
真菌效果［６］。本研究拟采用转基因技术，以根癌农
杆菌为转化载体，将含有木霉来源的内切几丁质酶
以及β１，３葡聚糖酶基因片段转入半夏，以期获得
抗真菌感染的半夏品种。
１ 材料
半夏无菌苗及外植体均来自本实验室保存。根
癌农杆菌菌株（ＥＨＡ１０５）和表达载体 ｐＣＡＭＢＩＡ
（ｅｃｈ），ｐＣＡＭＢＩＡ（ｇｌｕｃ），ｐＣＡＭＢＩＡ（ｅｃｈ＋ｇｌｕｃ）均由
浙江大学生命科学院姜维梅博士馈赠。
１萘乙酸（ＮＡＡ）；６苄基腺嘌呤（ＢＡ）；特美汀
（Ｔｉｍｅｎｔｉｎ）；硫酸链霉素（ｓｔｒ）；卡那霉素（ｋａｎ）；潮霉
素（ｈｙｇ）等主要试剂均购自生工生物工程（上海）有
限公司；ＰＣＲ及ＲＴＰＣＲ试剂为宝生物工程（大连）
有限公司产品；引物由生工生物工程（上海）有限公
司合成。主要仪器有美国 Ｂｉｏｒａｄ基因扩增 ＰＣＲ
仪，德国Ｈｅｒａｅｕｓ超速冷冻离心机。
２ 方法
２．１ 半夏无菌苗的获得 从实验室自留地采来的
半夏在自来水下冲洗１～２ｈ，７５％乙醇浸泡３０ｓ，
用无菌水冲洗２次；再用０２％升汞处理６～８ｍｉｎ，
无菌水冲洗５～６次。剪去叶片边缘后，接种于半夏
增殖培养基。采用含２０ｍｇ·Ｌ－１６ＢＡ＋０２ｍｇ·
Ｌ－１ＮＡＡ的ＭＳ１培养基获得半夏无菌苗。
２．２ 潮霉素浓度的筛选 将半夏无菌苗接种到含
有不同浓度潮霉素的半夏增殖培养基中培养，观察
其生长情况，确定潮霉素对半夏的致死浓度。
２．３ 农杆菌介导法转化半夏 挑选单菌落在含 ｓｔｒ
５０ｍｇ·Ｌ－１和ｋａｎ５０ｍｇ·Ｌ－１的ＹＥＰ液体培养基中
于２８℃１８０～２００ｒ·ｍｉｎ－１培养过夜。将菌液收集
到离心管中，于４℃，４０００ｒ·ｍｉｎ－１离心１０ｍｉｎ，弃
上清，沉淀用 ＭＳ液体培养基悬浮（需加乙酰丁香
酮），定容至Ａ６００４～０６，将悬浮好的菌液２８℃２４０
ｒ·ｍｉｎ－１摇０５～１ｄ。侵染：将培养４０ｄ的无菌苗幼
嫩叶片剪成１～２ｃｍ的小块，与农杆菌菌液共培养３０
ｍｉｎ。转至铺有滤纸的含有 ＭＳ１培养基中，暗处２６
℃共培养２～３ｄ。脱菌后转移到含Ｔｉｍｅｎｔｉｎ３００ｍｇ
·Ｌ－１和ｈｙｇ的ＭＳ１选择培养基上进行筛选，２６℃
光照下培养，２周继代１次。４周后，将外植体及再生
小芽切下，移至含Ｔｉｍｅｎｔｉｎ１５０ｍｇ·Ｌ－１和ｈｙｇ的ＭＳ
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培养基上诱导生根，待根系发达，开瓶炼苗２ｄ后移
入蛭石和营养土，置温室培养。
２．４ 转化子的检测 取约０５ｇ转基因半夏苗的
幼叶，剪碎后置于研钵中，加液氮将其研磨成粉末；
用ＣＴＡＢ法抽提基因组 ＤＮＡ，紫外分光光度法及凝
胶电泳检查 ＤＮＡ质量。分别用 ｅｃｈ４２和 ｇｌｕｃ７８特
异性引物作ＰＣＲ扩增检测。根据文献报道［７］，合成
扩增引物序列为引物 １，ｅｃｈＦ（ＧＣＧＣＴＧＣＡＧＧＣ
ＣＡＣＴＣＴＣＡＴＴ），ｅｃｈＲ（ＡＧＴＴＧＧＧＴＴＧＧＡＣＧＧＧＴＴ
ＧＧ）；引物 ２，ｇｌｕｃＦ（ＣＣＡＧＣＣＣＧＧＴＧＣＣＡＴＣＡＴＴ
ＧＴ），ｇｌｕｃＲ（ＡＡＡＧＴＧＴＴＧＣＧＧＴＴＧＴＣＣＣＴＧＴＣＧ）。
引物１和引物２分别扩增ｅｃｈ４２和ｇｌｕｃ７８产生７５４，
７５９ｂｐ的特异条带。
ＰＣＲ反应条件为９４℃预变性５ｍｉｎ；９４℃变性
３０ｓ，５７℃退火３０ｓ，７２℃延伸４５ｓ，３０个循环；７２
℃最后延伸１０ｍｉｎ。扩增产物用１％的琼脂糖凝胶
电泳检测。
２．５ 转化基因的表达检测 取未转化植株和 ＰＣＲ
检测为阳性植株的幼叶，用Ｔｒｉｚｏｌ法提取其总ＲＮＡ，
用ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１８为引物合成第１条 ｃＤＮＡ链，分别用
ｅｃｈ４２和 ｇｌｕｃ７８的特异引物作 ＰＣＲ扩增，条件同
２４；检测结果用琼脂糖凝胶电泳检测。
３ 结果与分析
３．１ 潮霉素浓度的筛选 将半夏叶片接种于含
１０，２０，２５，３０ｍｇ·Ｌ－１潮霉素的半夏增殖培养基上
培养，１５ｄ后，３０ｍｇ·Ｌ－１潮霉素的培养基上的半夏
叶片明显变黄呈枯死状。２０ｄ后，２０ｍｇ·Ｌ－１潮霉
素的培养基上的叶片也有大部分枯死。为达到较好
的区分度，在本实验中，采用的潮霉素质量浓度是
２０ｍｇ·Ｌ－１。
３．２ 抗潮霉素半夏再生Ｔ１代植株的获得 半夏外
植体经过预培养、农杆菌感染、共培养后，经过１０ｄ
的选择培养，约４０％外植体可形成明显的愈伤，随
后在有的愈伤上逐渐形成芽点并分化出芽，在一选
培养基上培养２星期的发芽愈伤转入二选培养基上
培养，进行生根培养，而后移植入土，获得潮霉素抗
性的半夏再生植株Ｔ１代。
３．３ 抗性植株的 ＰＣＲ鉴定 从未转化植株和抗性
植株叶片分别提取基因组 ＤＮＡ作为模板进行 ＰＣＲ
扩增，以质粒为阳性对照，以未转化植株为阴性对照。
取１０μＬ扩增产物经过１０％琼脂糖电泳，在转ｅｃｈ４２
基因、转ｇｌｕｃ７８基因和转 ｅｃｈ４２＋ｇｌｕｃ７８双基因的抗
潮霉素植株上均扩增出与质粒对应的特异性片段，而
未转化植株没有（图１），初步证明３种表达载体均转
化成功，已整合到半夏基因组上，但是否转录表达还
需要进一步检测。
Ｍ．１００ｂｐＤＮＡＭａｒｋｅｒ；１．ｅｃｈ４２质粒对照；２．转ｅｃｈ４２半夏植株；３．
未转化半夏植株；４．ｇｌｕｃ７８质粒对照；５．转ｇｌｕｃ７８半夏植株；６．未
转化植株；７．ｅｃｈ４２＋ｇｌｕｃ７８双基因质粒的ｅｃｈ４２扩增；８．转化双基
因的半夏植株ｅｃｈ４２扩增；９．未转化半夏；１０．双基因质粒的ｇｌｕｃ７８
扩增；１１．转化双基因的半夏植株ｇｌｕｃ７８扩增；１２．未转化半夏。
图１ 转基因植株的ＰＣＲ扩增电泳
３．４ 转基因植株的ＲＴＰＣＲ分析 利用Ｔｒｉｚｏｌ法提
取ＰＣＲ检测阳性的转基因植株总 ＲＮＡ，用于 ＲＴ
ＰＣＲ检测，分别利用几丁质酶 ｅｃｈ特异引物（图２）
和葡聚糖酶ｇｌｕｃ特异引物（图３）对转基因植株进行
扩增，琼脂糖凝胶电泳检测显示，得到与预期７５０～
７６０ｂｐ大小相应的片段，表明转化半夏的 ｅｃｈ４２，
ｇｌｕｃ７８基因已经正常转录，而且转化双基因的植株
中几丁质酶和葡聚糖酶基因均可以正常转录。
Ｍ．１００ｂｐＤＮＡＭａｒｋｅｒ；１．未转化植株；２，３．转化ｇｌｕｃ７８的
半夏植株；４～７．转化ｅｃｈ４２的半夏植株；８～１１．转化双基
因的半夏植株。
图２ 转基因植株ｅｃｈ引物的ＲＴＰＣＲ电泳
３．５ 继代试验 随机选取 ＰＣＲ和 ＲＴＰＣＲ检测阳
性的转基因Ｔ１代植株的叶片进行再生培养获得再
生植株Ｔ２代，用ＰＣＲ追踪检测，选择阳性植株继续
选育，直至 Ｔ５代；利用 ＲＴＰＣＲ分析显示，在所检
测的单株中，几丁质酶基因、葡聚糖酶基因均检测为
阳性，而且转化双基因的植株中两基因连锁遗传，未
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Ｍ．１００ｂｐＤＮＡＭａｒｋｅｒ；１，２．转化ｅｃｈ４２的半夏植株；
３～６．转化ｇｌｕｃ７８的半夏植株；７～１０转化双基因的半夏植株；
１１．未转化植株。
图３ 转基因植株ｇｌｕｃ引物的ＲＴＰＣＲ电泳结果
发现二者分离的现象。证明外源基因在转基因半夏
内稳定遗传，并在转录水平进行表达。
４ 讨论
本实验中采用的来自木霉的内切几丁质酶基因
ｅｃｈ４２，葡聚糖酶基因 ｇｌｕｃ７８以及它们的组合
（ｅｃｈ４２＋ｇｌｕｃ７８）均已在水稻中转化成功。研究表
明，那些转基因植株中有部分植株表现对稻瘟病完
全免疫，同时获得部分转基因植株对纹枯病也具有
高度抗性［７］。半夏与水稻同属单子叶植物，本实验
首次将这些成功转化水稻的基因转化半夏是一种尝
试，经过一系列分子鉴定认为，获得了转基因植株，
且几丁质酶基因和葡聚糖酶基因在转基因植株中已
经得到转录表达，这对于半夏抗病和其他性状的基
因改造具有重要意义。
本实验采用传代的方式，以ＰＣＲ追踪的方式进
行鉴定，可避免Ｓｏｕｔｈｅｒｎ的繁琐步骤，且获得稳定遗
传的转基因植物，同时结合 ＲＴＰＣＲ检测外源基因
的表达情况，可确保去除转基因鉴定中的假阳性
现象。
几丁质酶基因和葡聚糖基因的转化在已有的报
道中，可使转基因植株获得抗性，但是其在半夏中的
抗真菌能力还需进一步的检测证实，本研究仅用
ＲＴＰＣＲ检测２种酶的 ｍＲＮＡ，其酶活性尚待 Ｗｅｓｔ
ｅｒｎｂｌｏｔ、真菌侵染试验等进一步证实；而且半夏是
药用植物，外源基因的转化是否会引起药效物质的
改变，是否可能产生对人体有害的物质，还有待进一
步深入研究。
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ＪＩＮＢｏ，ＪＩＡＮＧＦｕｓｈｅｎｇ，ＹＵＭｅｉｒｏｎｇ，ＣＨＥＮＮｉｐｉ，ＤＩＮＧＺｈｉｓｈａｎ
（ＬｉｆｅａｎｄｓｃｉｅｎｃｅｃｏｌｅｇｅｏｆＺｈｅｊｉａｎｇＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ３１００５３，Ｃｈｉｎａ）
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＴｏｏｂｔａｉｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃＰｉｎｅｌｉａｔｅｒｎａｔａｐｌａｎｔｓｒｅｓｉｓｔａｎｔｔｏｆｕｎｇｕｓｂｙｔｒａｎｓｆｅｒＣｈｉｔｉｎａｓｅａｎｄβ１，３Ｇｌｕ
ｃａｎａｓｅｇｅｎｅｆｒｏｍＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｈａｒｚｉａｎｕｍ．Ｍｅｔｈｏｄ：Ｕｓｉｎｇｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅａｓｔｈｅｓｅｌｅｃｔｉｏｎｍａｒｋｅｒ，ｔｈｅＣｈｉｔｉｎａｓｅｇｅｎｅ
（ｅｃｈ４２），β１，３Ｇｌｕｃａｎａｓｅｇｅｎｅ（ｇｌｕｃ７８）ａｎｄｂｏｔｈｇｅｎｅｐＣＡＭＢＩＡ（ｅｃｈ４２＋ｇｌｕｃ７８）ｄｒｉｖｅｎｂｙＣａＭＶ３５Ｓｐｒｏｍｏｔｅｒｗｅｒｅｔｒａｎｓｆｅｒｅｄ
ｉｎｔｏＰ．ｔｅｒｎａｔａｃａｌｕｓｖｉａＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｍｅｄｉａｔｅｄｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｒｅｓｕｌｔ：ＰＣＲｒｅｓｕｌｔｓｃｏｎｆｉｒｍｅｄｔｈａｔｔｈｅｒｅｇｅｎｅｒａｎｔｓｗｅｒｅｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｔｏ
ｂｅｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｌｉｎｅｓａｎｄｔｈｅＲＴＰＣＲｒｅｓｕｌｔｓｃｏｎｆｉｒｍｅｄｔｈａｔｆｏｒｅｉｇｎｇｅｎｅｓｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｗｅｒｅｔｒａｎｓｆｅｒｔｏｍＲＮＡ．Ｔｗｏｆｏｒｅｉｇｎｇｅｎｅｓｗｅｒｅ
ｉｎｈｅｒｉｔｅｄｓｔａｂｌｙｔｏＴ５ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏＰＣＲｒｅｓｕｌｔｓｏｆｔｈｅｌｉｎｅｓ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｃｈｉｔｉｎａｓｅｇｅｎｅｅｃｈ４２ａｎｄ
β１，３ｇｌｕｃａｎａｓｅｇｅｎｅｇｌｕｃ７８ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙｏｒｔｏｇｅｔｈｅｒｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇａｎｄｃｏｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇｉｎｔｏＰ．ｔｅｒｎａｔａ
［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］ Ｐｉｎｅｌｉａｔｅｒｎａｔａ；Ｃｈｉｔｉｎａｓｅ；ｇｌｕｃａｎａｓｅ；ｇｅｎｅｔｉｃｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ；Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ
［责任编辑 吕冬梅］
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