全 文 :肾康丸对糖尿病大鼠肾脏保护作用的实验研究
肖 炜t 3 o魏连波t o马 云u o龙海波t o陈国宝t
kt1 南方医科大学 珠江医院 o广东 广州 xtsu{u ~u1 南方医科大学 南方医院 o广东 广州 xtsxtxl
≈摘要 目的 }观察肾康丸对糖尿病k⁄l大鼠模型的肾功能及基质分泌的影响 ∀方法 }用链脲佐菌素k≥×l腹
腔注射法诱导建立大鼠 ⁄ 模型 o模型成功后随机分为 v组 }模型对照组 !开搏通组 !肾康丸组 o另设正常对照组 ∀
治疗 {周 o观察治疗期间及治疗后大鼠一般状况 !血糖 !尿糖 !uw «尿蛋白 !uw «尿白蛋白 !肌酐 !尿素氮 !肾重 !相对
肾重 o并用 ×2°≤ 法测定肾脏纤连蛋白kƒl° 的表达情况 ∀结果 }造模 v组均出现 ⁄ 及肾脏损害 o同时肾脏
ƒ° 的表达也明显增加 ∀肾康丸可以改善大鼠基本状况 !肾功能 !降低血糖 !尿总蛋白及白蛋白排泄 o降低肾
脏组织 ƒ° 的表达 ∀结论 }肾康丸具有保护 ⁄ 大鼠肾脏的作用 ∀
≈关键词 肾康丸 ~糖尿病肾病 ~纤连蛋白
≈中图分类号 u{x1x ≈文献标识码 ≈文章编号 tsst2xvsukussyltu2tssy2sw
≈收稿日期 ussx2tu2s|
≈通讯作者 3肖炜 oר¯ }ksuslytywvt{x o∞2°¤¬¯}°¼¬ºt|zz ©¬°2
°∏q¦²°
糖尿病肾病k§¬¤¥¨·¬¦±¨ ³«µ²³¤·«¼o⁄l是糖尿病
k§¬¤¥¨·¨¶°¨ ¯¯¬·∏¶o⁄l患者临床常见而难治的微血
管并发症 o是导致终末期肾病k∞≥ ⁄l和 ⁄ 患者死
亡的主要原因≈t ∀有效预防 ⁄发生 o或阻断病情
发展 o延缓慢性肾衰进程 o成为医学界研究的重要课
题 ∀肾康丸是本院研制的纯中药制剂 o临床观察表
明≈u o该药在一定程度上可阻止肾小动脉硬化 o延缓
⁄的进展 ∀本实验通过动物模型进一步探讨肾康
丸对 ⁄ 肾损伤大鼠的肾保护作用 ∀
1 材料与方法
111 动物
•¬¶·¤µ雄性大鼠 o体重 t|s ∗ uvs ª o购于南方医
科大学动物实验中心 ∀实验前置动物于室内适应环
境 t周 o室温 t{ ∗ uu ε ∀自由饮水 !进食 ∀
112 受试药品
肾康丸 o由黄芪 !芡实 !金樱子 !玉米须 !水蛭等
组成 o南方医科大学珠江医院药剂科生产 o批号
ussvtutw ~开搏通片 o上海中美施贵宝药业有限公司
生产 o批号 swsusvu ∀
113 主要试剂
链脲佐菌素k≥× o≥¬ª°¤公司l ~大鼠尿白蛋白
k¤¯¥l放免试剂盒k北京福瑞生物工程公司l ~考马
斯亮蓝蛋白测定试剂盒 !肌酐k
l !尿素氮k≤µl !
糖化血红蛋白k¥l试剂盒k南京建成生物工程有
限公司l ~安健尿糖试纸k珠江生化试剂公司l ~×µ¬½²¯
提取试剂k北京鼎国生物科技有限公司l ~逆转
录酶k ∂ o°µ²°¨ ª¤公司l ~¯¬ª²§×t{ oפ´ 酶 o§×°
kפ®¤¤公司l ∀
114 主要仪器
±¨ ·²∏¦«∏¯·µ¤血糖仪及其配套试纸k美国强生
公司l ~zszt 型全自动生化分析仪k日本日立公
司l ~≥p y{u型放射免疫 Χ计数器k上海核福光电
仪器有限公司l ~zxw型紫外2可见光分光光度计k上
海第三分析仪器厂l ~
¬²°¨ ·µ¤ °≤ 扩增仪k2
׫¨µ°²¥¯²¦®×公司l ~∂ p vsss型紫外分析仪k珠海
黑马医学仪器有限公司l ~⁄≠≠ p ¶型电泳仪k北京
六一仪器厂l ~
¬²2¤§≥°¤µ·≥³¨¦× vsss型核酸蛋白
定量分析仪k美国
¬²2¤§公司l ∀
115 模型与分组给药
大鼠适应性喂养 t周后 o禁食 tu «o按 yx °ª#
®ªpt左下腹腔内一次性注射 ≥× 制作 ⁄ 大鼠模
型 ∀≥×临用前用枸橼酸钠缓冲液ks1t °²¯#pt o³
w1xl配制 ots °¬±内用完 ∀另设正常对照组k ν {l o
注射等量枸橼酸钠溶液 ∀全部大鼠标准饮食 o不使
用胰岛素及其他降糖药物 ∀连续喂养 u周 o测血糖 !
尿糖 !尿量 o若血糖值高于 ty1z °°²¯#pt !尿糖k 7 l
以上 !尿量增加 t倍以上 o则造模成功 o计算成模率 ∀
大鼠造模成功后 o称重 o随机分为 v组 }模型对照组 o
开搏通组和肾康丸组 ∀开搏通 o肾康丸组大鼠分别
按 x °ª#®ªpt ot1u ª#®ªptk按照人与大鼠体表面积换
#ysst#
第 vt卷第 tu期
ussy年 y月
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Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
∂²¯1vt o¶¶∏¨ tu
∏±¨ oussy
算 o分别相当于 zs ®ª成人 vz1x °ª#§pt otu ª#§ptl
体重灌服相应药物混悬液 o连续 {周 ∀对照组灌服
等容积生理盐水 ∀
116 标本收集
实验结束前 t §o用代谢笼收集 uw «尿 o计 uw «
尿量及饮水量 ∀用 ts h水合氯醛腹腔麻醉 o称重 o
腹主动脉取血 o分离血清 op us ε 保存 ~取肾脏 o称
重后液氮冻藏 ∀
117 观察指标和测定方法
11711 一般情况及体重 !相对肾重
观察大鼠一般情况包括精神状态 !活动情况 !饮
食 !毛色 !饮水量 !尿量等 ∀称量各组大鼠给药前后
体重 o计算体重变化 ∀大鼠处死后 o取出左肾 o精确
称重后 o按下式计算相对肾重k ΚΩ/ ΒΩl ∀
ΚΩ/ ΒΩ 肾重k°ªlr体重kªl
11712 血糖 !尿糖及 ¥
大鼠每 u周尾静脉取血 t次 o采用美国强生公
司 ±¨ ·²∏¦«∏¯·µ¤血糖仪及其配套试纸测血糖 ∀大
鼠每 u周留尿 o采用珠江生化试剂公司安健尿糖试
纸行半定量测量尿糖 ∀用紫外分光光度法测定大鼠
血清 ¥o按试剂盒说明书进行 ∀
11713 肾功能指标及 uw «尿蛋白 !白蛋白量
采用考马斯亮兰法定量 uw «尿蛋白k³µ²l总
量 o放射免疫法测定 ¤¯¥o按各试剂盒说明书进行 ∀
用全自动生化分析仪测定 ≥¦µo
和尿肌酐k¦µl
浓度 ∀并按下式计算内生肌酐清除率k≤¦µl ∀
≤¦µ ¦µkΛ°²¯#ptl ≅尿量k°#°¬±ptlr ≥≤µkΛ°²¯#ptl
11714 肾脏组织纤连蛋白kƒl° 的表达
1171411 总 的提取 取 tss °ª左右肾组织剪
碎 o冰浴中匀浆后溶解于 t °×µ¬½²¯ 中 o按试剂盒说
明书提取总 ∀取 x Λ 进行 u h琼脂糖凝
胶电泳鉴定 完整性 ~同时取 x Λo用核酸蛋白
定量分析仪测 Αuys oΑu{s o重复测定 v次 o根据 Αuysr
Αu{s值 o判断 纯度 ~根据 Αuys值计算 浓度 ∀
1171412 ×2°≤ 反应 反应体系kux Λl }ª≤¯ u
w Λox ≅
∏©©¨µx Λo ±¤¶¨2©µ¨¨ u |1x Λo§×°kts
°°²¯#ptl t Λo ±¤¶¨ ±«¬¥¬·²µs1x Λo反转录酶
k ∂lu Λo¯¬ª§×t{ t Λo u Λ∀反应条件 }zs
ε ox °¬±~wu ε oys °¬±~|x ε ox °¬±~w ε ots °¬±~t
个循环 ∀
1171413 °≤ 反应 引物 }ƒok n lxχ2≤≤ ≤
≤× ≤ ×≤× ≤× ≤≤× ≤≤ 2vχ ok2lxχ2×××
×× × ≤× × ≤ ×× ≤2vχ oyv| ¥³~Β2¤¦·¬±o
k n lxχ2×≤ × ××× ≤≤ ××≤ ≤ ≤≤ ≤≤
≤≤2vχ ok2lxχ2 ≤≤ ×≤ ≤× ≤
≤ ≤≤ ×≤2vχ ovwu ¥³∀引物由北京赛百盛公司
合成 ∀反应体系kxs Λl }三蒸 u vz Λots ≅
∏©©¨µ
x Λo§×°kts °°²¯#ptlt Λo¦⁄ u Λoƒ上 !下
游引物各 t ΛoΒ2¤¦·¬±上 !下游引物各 t Λoפ´ 酶 t
Λ∀反应条件 }|w ε ox °¬±ot个循环 ~|w ε ovs ¶oys
ε ot °¬±ozu ε ovs ¶ovx个循环 ~zu ε 延伸 ts °¬±ow
ε o©²µ¨√¨ µ∀ts Λ反应产物于 t1x h 琼脂糖凝胶电
泳 o紫外灯下检测 !拍照 o并用捷达 {st专业数码凝
胶成像与分析系统分析各条带吸收度值 o结果以 ƒ
与 Β2¤¦·¬±的吸收度比值表示 ∀
118 统计方法
实验资料用 cξ ? σ表示 o采用方差分析 o结果用
≥°≥≥tu1s统计软件包处理 ∀
2 结果
211 对大鼠一般情况的影响
vu只大鼠用于造模 o成模率 {w1ws h kuzrvul ∀
成模后病死率 z1w h kuruzl ∀与正常组比较 o模型组
大鼠 {周体重明显降低k Π s1stl o前后体重增长
量减少k Π s1stl ouw «尿量及饮水量明显增加
k Π s1stl o同时大鼠一般情况较差 o精神萎靡 o反
应迟钝 o毛竖无光泽 o动作迟缓 o弓背蜷体 o部分动物
尾部皮肤角化或有溃烂 o分别于第 v周 oy周死亡 t
只大鼠 ∀各治疗组的大鼠一般情况较模型对照有所
改善 o{ 周体重及前后体重增长明显增加 k Π
s1stl o造模后增加的 uw «尿量及饮水量明显减少
k Π s1stl ∀尤以肾康丸组作用明显k表 tl ∀
212 对大鼠血糖 !尿糖的影响
造模后大鼠血糖明显升高 o且模型组血糖浓度
呈进行性增高 o均显著高于正常组k Π s1stl ∀给
药组在 w周内血糖浓度逐渐升高 ow周后血糖浓度
开始下降 ∀至 {周时 o与模型组比较 o肾康丸组血糖
浓度显著降低k Π s1sxl o开搏通组血糖浓度有降
低趋势 o但无统计学意义 ∀实验过程中 o正常组尿糖
均为阴性 o造模 v组尿糖均为 7 ∗ 8 k表 ul ∀
213 对大鼠肾功能及 ¥的影响
与正常组比较 o模型组大鼠 ≥≤µo
o≤¦µ及
¥均显著升高k Π s1stl ∀各治疗组对上述指标
均有显著降低作用k Π s1st或 Π s1sxlk表 vl ∀
214 对大鼠尿蛋白及肾重的影响
#zsst#
第 vt卷第 tu期
ussy年 y月
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Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
∂²¯1vt o¶¶∏¨ tu
∏±¨ oussy
表 t 大鼠一般情况的比较kcξ ? σl
组别 ν s周体重rª {周体重rª 体重增加量rª uw «尿量r° uw «饮水量r°
正常 { uvs qtv ? { qz| vwt qxs ? tx quv ttt qv{ ? tz qut t{ qzx ? v qsy uz qxs ? w qss
模型 z utt qyz ? ts qvs ut{ qx{ ? tv qvxul z qwv ? y qwvul {z qwt ? tx qyzul ts{ q{y ? tv q|xul
开搏通 | utu qvv ? | quz uwy qyz ? tw qyzwl vw qvv ? tu q{|wl yt q{| ? tx qs{wl y| qz{ ? tt qvzwl
肾康丸 | utt q{| ? ts q|| uyv quu ? tz qxvwl xt qvv ? tz qyuwl x| qss ? tx q{xwl yy qyz ? tt qutwl
注 }与正常组比较tl Π s1sx ,u) Π s1st ;与模型组比较v) Π s .sx ,w) Π s1stk表 u ∗ x同l
表 u 大鼠血糖的变化kcξ ? σl °°²¯#pt
组别 ν s • u • w • y • { •
正常 { w q|u ? s qy| w q{{ ? s qyz w q|s ? s qxv w q|z ? s qxy w q|v ? s qxy
模型 z us qz{ ? v qt{ul uu qzw ? v quuul uv quz ? v qt|ul uw qy| ? w quzul ux qy{ ? x qwuul
开搏通 | us q{s ? v qwx ut qzv ? v q|w uu qvy ? v qsy uu qtt ? v quv ut q{z ? v q{s
肾康丸 | us qxy ? v qu| ut qyv ? v qwx uu qtz ? v qv| ut q|t ? u qzz ut qvu ? v qysvl
表 v 大鼠肾功能及 ¥的比较kcξ ? σl
组别 ν ≥¦µrΛ°²¯#pt
r°°²¯#pt ¦µrΛ°²¯#pt ≤¦µ ¥r h
正常 { xz qxu ? tu qwt y qys ? t qss | zut qtt ? u s{t qxw u qux ? s qyt tx qzv ? t qxy
模型 z zz q{y ? tt qvvul tu qwz ? t qyzul y tty qs| ? t zyz qxuul w qz| ? t qwsul vt q{u ? v qyxul
开搏通 | yw qsu ? ts q|tvl ts q{w ? t qwzwl x xsw qz| ? t uzv q|t v qyy ? s q|tvl uz quw ? w q{tvl
肾康丸 | yt q{t ? | qz{wl ts qs| ? t qxuwl x www qyy ? t stz qyy v qsu ? t qsvvl uy q|v ? w q|zvl
与正常对照组比较 o模型组大鼠 uw «尿蛋白总
量k³µ²l ouw «尿白蛋白量k¤¯¥l !肾重及肾重比体
重k ΚΩ/ ΒΩl均显著升高k Π s1stl ∀各治疗组对
上述指标均有显著降低作用k Π s1stlk表 wl ∀
表 w 大鼠蛋白尿及肾重的比较kcξ ? σl
组别 ν ³µ²r°ª ¤¯¥r°ª 肾重rª ΚΩ/ ΒΩ
正常 { zq|v ? tq|u sqv| ? sqty sq{| ? sqtw uqyu ? sqwz
模型 z t|q{t ? vqvvul t qtt ? squwul t qt| ? sqtuul x qwy ? sqzxul
开搏通 | tvq|s ? vqwtwl s qzs ? squxwl s q|{ ? sqtuwl w qss ? sqyuwl
肾康丸 | tuq{z ? vqtzwl s qyu ? squwwl s q|x ? sqtswl v qyv ? sqwvwl
215 大鼠肾脏 ƒ° 的表达
本实验中所提取 经琼脂糖凝胶电泳鉴定 o
u{ ot{ ox¶清晰可见 oΑuysrΑu{s比值在 t1{ ∗ u1s o提示
所提 完整 o纯度较好 ∀与正常组比较 o模型组
大鼠肾脏 ƒ ° 的表达明显增加k Π s1stl ∀
各治疗组均能显著降低造模后提高的 ƒ° 的
表达k Π s1stl ∀肾康丸组作用优于开搏通组k Π
s1stlk表 x o图 tl ∀
表 x 大鼠肾脏 ƒ° 的表达kcξ ? σl
组别 ν ƒ°
正常 { s qxy ? s qtt
模型 z t qtu ? s qtyul
开搏通 | s q|t ? s qtswl
肾康丸 | s qzs ? s qtzwl
3 讨论
⁄ 可由多种途径损害肾脏 o并累及肾脏的所
有结构 ∀约 ws h的 t型 ⁄ 和 x h ∗ ts h的 u型 ⁄
患者可以发生 ⁄∀ ⁄的病理改变以肾小球系膜区
图 t 大鼠肾脏 ƒ° 的表达
细胞外基质k∞≤l增多为主要特征 o最终导致弥漫
型或k和l结节型肾小球硬化 ∀ ƒ是 ∞≤ 的重要组
成部分 o是促进肾脏纤维化或硬化进行发展的重要
因素 ∀ ¥是血红蛋白某些特殊分子部位和葡萄糖
经过缓慢而不可逆的非酶促反应结合而形成的 o⁄
时糖化血红蛋白增高 o造成组织细胞供氧量减少 o这
可能是导致 ⁄ 慢性并发症的一个重要原因 ∀
≥×通过对实验动物胰岛 Β细胞的选择性破坏
诱导 ⁄ 模型 o该方法具有造模简便 !用药量小 !药
物毒性低 !对胰岛 Β细胞损伤特异性高等优点 o为目
前研究 ⁄ 及其并发症较常用的动物模型 ∀本实验
按剂量 yx °ª#®ªpt体重给大鼠左下腹腔单次注射 o
在注射后 zu «模型组大鼠均出现尿量 !饮水增多 o
血糖升高 o尿糖 7 以上 o达到 ⁄ 模型标准的大鼠占
{w1w h ∀在 {周的实验过程中 o模型组大鼠血糖均
维持在 ty1z °°²¯#pt以上 o且表现出多饮 !多食 !多
#{sst#
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∏±¨ oussy
尿 !消瘦的 ⁄ 症状 o并出现 ≥≤µo
o≤¦µouw « ³2
µ²ouw « ¤¯¥o肾重及 • r
• 明显升高及 ƒ合成增
加的典型的 ⁄临床症状和病理改变 ∀因此 o这种
模型是研究 ⁄的一个成功模型 ∀
⁄与中医/消渴0中的肾消有关 o自古医家多认
为是肺 !脾 !肾三脏亏虚而致 ∀笔者认为 ⁄ 患者多
久病耗气伤阴 o累及脾肾 o导致脾肾亏虚 o气阴两伤 o
气虚血行无力 o病久入络 o易致血行瘀滞 ∀脾虚失于
健运 o水谷精微之气无以化生 o肾虚固摄无权 o精微
持续下注外泄 o则可出现蛋白尿 ∀因此 o在治疗上以
益气健脾 !滋阴补肾兼活血通络为法 ∀肾康丸中以
黄芪益气健脾 ~芡实 !金樱子滋阴补肾固涩 o滋而不
腻 ~蝉蜕 !玉米须利尿泻热 ~水蛭 !益母草 !山楂有活
血通络 o标本兼治之功 ∀现代药理研究亦证实 o黄芪
具有双向调节血糖 !降低尿蛋白等作用≈v ~玉米须 !
水蛭 !益母草 !山楂等药都能有效改善改善肾脏微循
环 o防止肾小球硬化 o保护肾功能 o减轻尿蛋白的排
出等作用≈w ox ∀临床研究表明肾康丸具有改善肾内
血流动力学 o增加肾小球滤过率及有效肾血流量的
作用 o并能减少尿蛋白的排泄 o同时具有降血脂 !血
黏度的作用 o从而延缓 ⁄的进展≈u ∀本次动物实
验也发现肾康丸治疗 { 周后 o⁄ 大鼠的一般状态
明显改善 o血糖及 ¥明显下降 o≥¦µo
o≤¦µouw «
³µ²ouw « ¤¯¥明显减少 o肾重及 ΚΩ/ ΒΩ明显降
低 oƒ° 表达显著下调 o表明肾康丸能降低 ⁄
大鼠的血糖水平 o减少尿微量白蛋白排泄率 o减轻大
鼠肾脏的高滤过 !高灌注 o改善肾组织缺氧 o减少
∞≤ 分泌和沉积 o从而有保护肾功能 o延缓肾损害
进程的作用 o其具体作用机制尚待进一步研究 ∀
≈参考文献
≈t ¨¤° o ¬¦«²¯¤¶≥
q ⁄¬¤¥¨·¨¶°¨¯ ¬¯·∏¶¤±§«¼³¨µ·¨±¶¬²±}®¨ ¼ µ¬¶®
©¤¦·²µ¶©²µ®¬§±¨ ¼ §¬¶¨¤¶¨ q ϑ Νατλ Μεδ Ασσοχ oussu o|wk{l }z q
≈u 陈国宝 o魏连波 o龙海波 q肾康丸治疗早期糖尿病肾病 ws例
临床观察 q第 ty届广东省中医 !中西医结合肾病学术交流会
议论文汇编 qussw1txx q
≈v 熊维建 o杨 敬 o钟 锦 q黄芪治疗糖尿病肾病的研究近况 q
中国中医急症 oussw otvkzl }wys q
≈w 苗明三 o孙艳红 q玉米须总皂苷降糖作用研究 q中国中药杂
志 oussw ou|kzl }ztt q
≈x 胡宝峰 o孟令双 o黄 明 o等 q水蛭胶囊对糖尿病肾病血液流
变学尿蛋白的影响 q辽宁中医杂志 oussv ovskvl }uv{ q
Ρεναλ προτεχτιϖε εφφεχτ οφ Σηενκανγ πιλλ ον διαβετιχ ρατσ
÷ • ¬¨t o • ∞¬¤±2
²t o ≠∏±u o ¤¬2
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(t . Ζηυ ϑιανγ Ηοσπιταλ, Σουτηερν Μεδιχαλ Υνιϖερσιτψ, Γυανγζηου xtsu{u , Χηινα ;
u . Νανφανγ Ηοσπιταλ, Σουτηερν Μεδιχαλ Υνιϖερσιτψ, Γυανγζηου xtsxtx , Χηινα)
[ Αβστραχτ] Οβϕεχτιϖε : ײ¬±√ ¶¨·¬ª¤·¨·«¨ ©¨©¨¦·¶²©≥«¨ ±®¤±ª³¬¯¯ ²± µ¨±¤¯ ©∏±¦·¬²± ¤±§ ¬¨·µ¤¦¨¯¯∏¯¤µ°¤·µ¬¬¶¨¦µ¨·¬²± ²±·«¨ §¬¤¥¨·¬¦
µ¤·¶q Μετηοδ : ׫¨ §¬¤¥¨·¬¦µ¤·°²§¨ ¶¯º µ¨¨ ¬±§∏¦¨§¥¼ ¬±·µ¤³¨µ¬·²±¨ ¤¯ ¬±¨¦·¬²± ²©¶·µ¨³·²½²·²¦¬±k≥×l¤±§µ¤±§²°¯ ¼ §¬√¬§¨§¬±·² v ªµ²∏³¶χ
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·«¨ ¬¨¦µ¨·¬²±µ¤·¨ ²©·«¨ uw «²∏µ∏µ¬±¨ ³µ²·¨¬± ¤±§¤¯¥∏°¬±oµ¨§∏¦¨ ·«¨ ¬¨³µ¨¶¶¬²± ²©ƒ° ¬± ®¬§±¨ ¼ q Χονχλυσιον : ≥«¨ ±®¤±ª³¬¯¯ «¤¶¤
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≈责任编辑 刘
#|sst#
第 vt卷第 tu期
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