全 文 ： 表３ 不同除鞣质方法比较（ｎ＝３）
除鞣质方法
除鞣质
检查
处理前样品
异荭草素量／ｍｇ荭草素量／ｍｇ
处理后样品
异荭草素量／ｍｇ 转移率／％ 荭草素量／ｍｇ 转移率／％
异常毒性检查
／致死浓度的倍数
明胶法 ± ７８１８ ４４７６ ６４６２ ８２６６ ３７２５ ８３２２ ３０
碱性醇沉法 － ８１８５ ４６８６ ５１０９ ６２４２ ２９１１ ６２１２ ６０
聚酰胺法 － ７９０４ ４５２５ ７４８８ ９４７４ ４３２１ ９５４９ １２０
注：“±”表示无明显浑浊
还进行了径高比、吸附流速、聚酰胺的重复使用次数
等工艺条件研究，结合实际生产过程，确定径高比
１∶６、吸附流速１ｍＬ·ｍｉｎ－１（０５ＢＶ·ｈ－１）、聚酰胺
重复使用次数为１０次。
本品使用聚酰胺法能使有效成分充分转移、异
常毒性明显降低，小鼠的致死浓度大于１２０倍，明显
高于其他除鞣质方法，为除鞣技术在中药注射剂中
的工业化应用提供了可鉴之据。
传统方法多以指标成分转移率来比较不同工艺
对注射液的除鞣质效果，未与除鞣质的目的———提
高制剂安全性联系，笔者选用小鼠异常毒性试验为
安全性评价指标，结合化学指标，可从有效性和安全
性角度来确定最佳除鞣质工艺。此法为中药注射剂
除鞣质工艺的筛选和评价提供了一种新的思路。
［参考文献］
［１］ 廖学品，马贺伟，陆忠兵，等．中草药提取物中单宁（鞣质）的
选择性脱除［Ｊ］．天然产物研究与开发，２００４，１６（１）：１０．
［２］ 兰燕宇，王爱民，何 迅，等．ＲＰＨＰＬＣ测定注射用复方荭草
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２００５，４０（１４）：１１００．
［３］ 郑尚珍，王定勇，刘武霞，等．荭草中的黄酮类化合物［Ｊ］．西
北师范大学学报，１９９９，３５（４）：３７．
［４］ 付晓春，王敏伟，李少鹏，等．荭草苷对缺氧复氧心肌细胞的
保护作用［Ｊ］．沈阳药科大学学报，２００５，２２（１）：４５．
［５］ 中国药典［Ｓ］．一部．２００５：附录５５，１１６．
［６］ 赵新先．中药注射剂学［Ｍ］．广州：广东科技出版社，２０００：
２２６．
［７］ 王 凌，贺英菊，罗巍伟．丹参注射液的除鞣质工艺探讨［Ｊ］．
华西药学杂志，２００３，１８（４）：２７５．
［８］ 王 健，徐自升，毛宏亮．中药注射液中鞣质去除方法的探讨
［Ｊ］．基层中药杂志，２００１，１５（５）：５１．
［９］ 杨基森．中药制剂设计学［Ｍ］．贵阳：贵州科技出版社，１９９２：
４７４．
［１０］ 庄 越，曹宝成，萧瑞祥．实用药物制剂技术［Ｍ］．北京：人民
卫生出版社，１９９９：４４３．
［责任编辑 鲍 雷］
固相萃取高效液相色谱法测定人血浆中灯盏乙素
及３，５二咖啡酰基奎宁酸
袁加才，张 军，居文政，廖善伟
（南京中医药大学 附属医院，江苏 南京 ２１００２９）
［收稿日期］ ２００６１２２６
［通讯作者］ 袁加才，Ｔｅｌ：１３７７６６０８１６７
灯盏细辛酚注射液具活血通络、祛风通脉功效，
临床用于缺血性中风、脑络痹阻等。其有效成分灯
盏乙素和总咖啡酸酯的含量大于８０％。主要活性
单体为灯盏乙素（ｓｃｕｔｅｌａｒｉｎ），具有扩张微血管、降
低血液黏稠度和脑血管阻力、增加脑血流量、改善微
循环的作用，可用于缺血性脑血管病的治疗。３，５
二咖啡酰基奎宁酸也有一定的活性作用。作者采用
固相萃取小柱提取血浆中的灯盏乙素及３，５二咖
啡酰基奎宁酸，用高效液相色谱法检测，以期为灯盏
细辛酚注射液的药代动力学研究提供实验方法。
１ 仪器与试剂
Ａｇｉｌｅｎｔ１１００液相色谱仪；ＡｇｉｌｅｎｔＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎ
色谱工作站；梅特勒托利多 ＡＥ２４０电子天平；梅特
勒托利多 Ｄｅｌｔａ３２０Ａ／ＣＰＨ计；ＢｉｏｆｕｇｅＰｒｉｍｏＲ冷冻
高速离心机；ＤｒｉｃｔＱ５超纯水机；ＷＨ２涡轮混合器
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（上海沪西分析仪器厂）。
灯盏乙素（野黄芩苷）对照品（中国药品生物制
品检定所，批号８４２２００１０２）；３，５二咖啡酰基奎宁
酸对照品（昆明植物所提供）；咖啡酸（内标，中国药
品生物制品检定所，批号１１０８８５２００１０２）；乙腈（色
谱纯，ＭｅｒｃｋＣｏｍｐａｎｙ）；其他试剂为ＡＲ试剂。
２ 试验方法与结果
２．１ 色谱条件 色谱柱 ＫＲ１００－５Ｃ１８（４６ｍｍ×
２５０ｍｍ，５μｍ）；保护柱ＺＯＲＢＡＸＳＢＣ１８（４６ｍｍ×
１２５ｍｍ，５μｍ）；流动相乙腈醋酸铵缓冲液（２０
ｍｍｏｌ·Ｌ－１醋酸铵，０４％甲酸）（１８∶８２）；流速０８
ｍＬ·ｍｉｎ－１；检测波长３３０ｎｍ；柱温３０℃；进样量２０
μＬ。
２．２ 标准溶液的配制 精密称取灯盏乙素对照品
５４８０ｍｇ，置２５ｍＬ量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻
度，摇匀，即得０２１９２ｍｇ·ｍＬ－１灯盏乙素甲醇溶
液，再以甲醇依次稀释，制成５４８０，２７４０，１３７０，
６８５，３４２，１７１，０８６，０４３μｇ·ｍＬ－１的灯盏乙素
对照品溶液。
精密称取３，５二咖啡酰基奎宁酸对照品２２６０
ｍｇ，置１０ｍＬ量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇
匀，即得０２２６０ｍｇ·ｍＬ－１３，５二咖啡酰基奎宁酸
甲醇溶液，再以甲醇依次稀释，制成５６５０，２８２５，
１４１３，７０６，３５３，１７７，０８８，０４４μｇ·ｍＬ－１的３，
５二咖啡酰基奎宁酸对照品溶液。
精密称取咖啡酸对照品４１００ｍｇ，置１０ｍＬ量
瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得浓度为
０４１０ｍｇ·ｍＬ－１的内标储备液；取该储备液以甲醇
稀释成４１００μｇ·ｍＬ－１的内标溶液。
２．３ 血浆样品的处理 将 ＢＯＮＤＯＤＳＣ１８预先用
２ｍＬ甲醇活化，再用２ｍＬ５％甲醇洗涤备用；取血
浆样品 ０６ｍＬ，精密加入内标溶液（４１００μｇ·
ｍＬ－１）２０μＬ，３％亚硫酸氢钠溶液０１ｍＬ、醋酸铵缓
冲液（２０ｍｍｏｌ·Ｌ－１醋酸铵，２％甲酸）０５ｍＬ，旋涡
３０ｓ，于３０００ｒ·ｍｉｎ－１离心５ｍｉｎ，吸取上清液移入
已活化的固相萃取小柱，恒速过柱；然后分别用 ２
ｍＬ５％甲醇清洗小柱；０６ｍＬ甲醇（含０１％氨水、
１０％乙醚）洗脱。收集洗脱液，４０℃水浴氮气中吹
干。残留物用流动相１００μＬ复溶，旋涡 １ｍｉｎ，于
１２０００ｒ·ｍｉｎ－１离心５ｍｉｎ，取上清液２０μＬ进样，
进行ＨＰＬＣ分析。
２．４ 色谱行为（特异性） 在本实验所采用的色谱
条件下，灯盏乙素保留时间在１０ｍｉｎ左右，３，５二
咖啡酰基奎宁酸保留时间在１６ｍｉｎ左右，内标咖啡
酸保留时间在６６ｍｉｎ左右。灯盏乙素、３，５二咖啡
酰基奎宁酸和内标咖啡酸峰形良好，无杂峰干扰，基
线平稳（图１）。本方法具有较高的特异性，能准确
测定血浆中的灯盏乙素、３，５二咖啡酰基奎宁酸的
浓度，灵敏度较高。
图１ 血浆中灯盏乙素、３，５二咖啡酰基奎宁酸ＨＰＬＣ图
Ａ．灯盏乙素；Ｂ．３，５二咖啡酰基奎宁酸；Ｃ．内标咖啡酸；Ｄ．空白
血浆；Ｅ．空白血浆加灯盏乙素、３，５二咖啡酰基奎宁酸对照品和内标
对照品；Ｆ．灯盏细辛酚注射液加内标对照品；１．灯盏乙素；２．３，５二
咖啡酰基奎宁酸；３．内标咖啡酸
２．５ 标准曲线的制备 取离心管数支，分别精密加
入适量的灯盏乙素、３，５二咖啡酰基奎宁酸标准溶
液，以氮气吹干后加入空白血浆０６ｍＬ，旋涡２０ｓ
混匀，配成含灯盏乙素分别为 １８２７，０９１３３，
０４５６６，０２２８３，０１１４２，００５７１，００２８５，００１４３
μｇ·ｍＬ－１的含药血浆、含３，５二咖啡酰基奎宁酸的
质量浓度分别为１４１３，０７０６３，０３５３１，０１７６６，
００８８３，００４４１，００２２１，００１１０μｇ·ｍＬ－１的含药
血浆。按“血浆样品的处理”项下操作。计算灯盏
乙素峰面积 Ａｓ１和内标峰面积 Ａｉ的比值 ｆ１（ｆ１＝
Ａｓ１／Ａｉ）；３，５二咖啡酰基奎宁酸峰面积 Ａｓ２和内标
峰面积Ａｉ的比值 ｆ２（ｆ２＝Ａｓ２／Ａｉ）。以峰面积比值 ｆ
对血药浓度 Ｃ作线性回归，得回归方程 ｆ１＝０００４
０３Ｃ＋００１６２，ｒ＝０９９９７４权重系数ｗ＝１／Ｃ２；ｆ２＝
０００３７５Ｃ＋０００３０５，ｒ＝０９９９８５权重系数ｗ＝１／
Ｃ２。
２．６ 回收率及精密度试验 按标准曲线配制方法
制备含灯盏乙素浓度分别为 ０９１３３，０１１４２，
００２８５μｇ·ｍＬ－１的血浆样品，含３，５二咖啡酰基
奎宁酸分别为０７０６３，００８８３，００２２１μｇ·ｍＬ－１
的血浆样品，按“血浆样品的处理”项下操作，在日
内对每种浓度各做５份样品，记录色谱图；在不同天
（３ｄ）连续对每种浓度各做５份样品，求得灯盏乙
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素、３，５二咖啡酰基奎宁酸日内、日间 ＲＳＤ；再将该
比值代入当天随行标准曲线方程，计算灯盏乙素、３，
５二咖啡酰基奎宁酸所得浓度与加入浓度的比值即
为相对回收率，结果见表１，２。
表１ 灯盏乙素精密度和回收率试验结果（珋ｘ±ｓ）
加入质量浓度
／ｎｇ·ｍＬ－１
测得质量浓度／ｎｇ·ｍＬ－１
日内 日间
精密度ＲＳＤ／％
日内（ｎ＝５） 日间（ｎ＝１５）
相对回收率／％
日内（ｎ＝５） 日间（ｎ＝１５）
２８５ ２８４６±２２６ ２８１５±３２５ ５３ ５６４ ９９８５±７９ ９９０２±５４
１１４２ １１５９±５３３ １１３９±６２１ ４６ ４７３ １０３８８±１４２ ９９２１±４４９
９１３３ ９１６６２±４８６１ ９１４２±４５３ ２３ ４６９ １００３２±５３２ １００１６±４５
表２ ３，５二咖啡酰基奎宁酸精密度和回收率试验结果（珋ｘ±ｓ）
加入质量浓度
／ｎｇ·ｍＬ－１
测得质量浓度／ｎｇ·ｍＬ－１
日内 日间
精密度ＲＳＤ／％
日内（ｎ＝５） 日间（ｎ＝１５）
相对回收率／％
日内（ｎ＝５） 日间（ｎ＝１５）
２２１ ２２２５±１６４ ２２５４±１９２ ５５１ ６４２ １００６７±７４ １０００±６４２
８８３ ８２５７±３１５ ８５４５±２８９ ２２０ ３８７ ９５５６±４２２ ９８２１±３８７
７０６３ ７０５４３±１７９２ ７０４３２±１６３７ ４７７ ３２１ ９９８８±２５７４ ９９１６±３２４
２．７ 稳定性试验 按标准曲线配制方法制备含灯
盏乙素分别为０９１３３，０１１４２，００２８５μｇ·ｍＬ－１
的血浆样品，含 ３，５二咖啡酰基奎宁酸分别为
０７０６３，００８８３，００２２１μｇ·ｍＬ－１的血浆样品，分
别立即分析；室温放置４ｈ后分析；放入－７５℃冰箱
中冷冻保存１５ｄ后分析和冷冻保存３０ｄ后取出融
化分析。
另取干净离心管３支，按标准曲线配制方法制
备含灯盏乙素分别为０９１３３，０１１４２，００２８５μｇ
·ｍＬ－１的血浆样品，含３，５二咖啡酰基奎宁酸浓度
分别为０７０６３，００８８３，００２２１μｇ·ｍＬ－１的血浆
样品，放入 －２０℃冰箱中冷冻，取出室温化冻，按
“血浆样品的处理”项提取分析；其余立即放入 －２０
℃冰箱中冷冻，如此重复２次。
结果表明，灯盏乙素、３，５二咖啡酰基奎宁酸血
浆样品在室温下放置４ｈ、冻融３次及冰冻放置３０ｄ
条件下均稳定性良好。
２．８ 提取回收率实验 取离心管数支，分别精密加
入２７４０，３４２，０８６μｇ·ｍＬ－１的灯盏乙素标准溶
液２０μＬ；２８２５，３５３，０８８μｇ·ｍＬ－１的３，５二咖
啡酰基奎宁酸标准溶液１５μＬ；内标溶液（４１００μｇ
·ｍＬ－１）２０μＬ以氮气吹干后加入１００μＬ流动相，
旋涡２０ｓ混匀，每种浓度各做５份，进行 ＨＰＬＣ分
析，记录灯盏乙素峰面积 Ａｓ１，３，５二咖啡酰基奎宁
酸峰面积Ａｓ２。
另取离心管数支，按标准曲线配制方法制备含
灯盏乙素分别为 ０９１３３，０１１４２，００２８５μｇ·
ｍＬ－１的血浆样品，含３，５二咖啡酰基奎宁酸分别为
０７０６３，００８８３，００２２１μｇ·ｍＬ－１的血浆样品，按
“血浆样品的处理”项下操作，每种浓度各做５份，
进行ＨＰＬＣ分析，记录灯盏乙素峰面积 Ａｘ１，３，５二
咖啡酰基奎宁酸峰面积Ａｘ２。
将上述Ａｘ和Ａｓ的比值代入下式即可求得灯盏
乙素和 ３，５二咖啡酰基奎宁酸的绝对回收率 Ｒ
（％）。
Ｒ（％）＝Ａｘ／Ａｓ×１００％
结果高、中、低３种含药血浆质控样品的提取回
收率分别为８２５％，７８９％，７５８％。
３ 讨论
采用固相萃取小柱提取血清中的灯盏乙素及
３，５二咖啡酰基奎宁酸，用高效液相色谱法检测，灯
盏乙素浓度在１８２７～００１４３μｇ·ｍＬ－１线性关系
良好，最小检测质量浓度为１４３ｎｇ·ｍＬ－１。３，５二
咖啡酰基奎宁酸在１４１３～００１１０μｇ·ｍＬ－１线性
关系良好，最小检测浓度为１１ｎｇ·ｍＬ－１。２种化合
物日内日间ＲＳＤ，平均回收率均符合药代动力学研
究要求。该方法快速准确，提取方法简便易行，适用
于灯盏乙素及３，５二咖啡酰基奎宁酸血药浓度检
测。
血浆样品的处理过程中用含 ０１％氨水、１０％
乙醚的甲醇洗脱，可提高灯盏乙素、３，５二咖啡酰基
奎宁酸的提取回收率，减少样品氮气吹干的时间。
本实验方法能同时检测血浆中灯盏乙素及３，
５二咖啡酰基奎宁酸，且灯盏乙素的检测限较文献
报道为低，为灯盏细辛酚注射液的药代动力学研究
提供了一定的帮助。３，５二咖啡酰基奎宁酸的血药
浓度检测未见文献报道，本实验方法是否能够用于
药代动力学研究还有待进一步研究。
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［参考文献］
［１］ 国家食品药品监督管理局化学药物制剂药代动力学研究技
术指导原则２００５０３．
［２］ 刘奕明，林爱华，陈 汇，等．灯盏花素在小鼠体内药物动力学
研究［Ｊ］．中国临床药理学与治疗学，２００５，１０（３）：３１０．
［３］ 蒋学华，李素华，兰 轲，等．灯盏花素在家犬体内的药代动力
学［Ｊ］．药学学报，２００３，３８（５）：３７１．
［４］ 张卫东，ＨＡＴｈｉＢａｎｇＴａｍ，陈万生，等．灯盏花中新的酚酸类化
合物的结构及活性研究［Ｊ］．药学学报，２００１，３６（５）：３６０．
［责任编辑 鲍 雷］
ＨＰＬＣ测定肠易通栓中芍药苷的含量
李 萍，程世琼，周 佳，杜李春
（四川省药品检验所，四川 成都 ６１００３６）
［收稿日期］ ２００７０２１０
［通讯作者］ 李萍，Ｔｅｌ：１３６７８１８４８８１，Ｅｍａｉｌ：ｓｙｊｓｌｉｐｉｎｇ＠１６３．
ｃｏｍ
肠易通栓由赤芍、枳实、延胡索、柴胡、苦参、益
母草和甘草等组成，主药赤芍具有清热凉血，散瘀止
痛之功效。赤芍主要含芍药苷、芍药内酯苷、羟基芍
药苷等成分［１，３］，故以芍药苷对照品为对照，进行含
量测定。目前芍药苷的含量测定多采用 ＨＰＬＣ测
定［１，２］，本品为中药栓剂，能够控制其质量的方法很
少，本方法根据处方组成选用 ＨＰＬＣ对方中的赤芍
进行含量测定，以控制本品的质量。
１ 仪器与试药
岛津ＬＣ－６Ａ高效液相色谱仪；ＳＰＤ－６Ａ检测
器；Ｗａｔｅｒｓ－５１０高效液相色谱仪；Ｗａｔｅｒｓ－４８６检测
器；Ｃｈｒｏｍｔｅｋ色谱数据工作站；ＨＳ色谱数据工作站。
甲醇为色谱纯；水为超纯水；其余试剂均为分析
纯；芍药苷对照品为中检所提供（批号为 ０７３６
２００２１９）；肠易通栓由成都制药一厂提供（批号为
２００２０１０１，２００２０１０２，２００２０１０３）。
２ 方法和结果
２．１ 测定波长的选择
取芍药苷对照品适量加流动相制成溶液，在
２００～４００ｎｍ波长进行扫描测定，在２３０ｎｍ波长处
有最大吸收，故测定波长选定为２３０ｎｍ。
２．２ 流动相及色谱条件
色谱柱为 ＫｒｏｍａｓｉｌＣ１８柱（４６ｍｍ×２００ｍｍ，５
μｍ）；流动相甲醇异丙醇醋酸水（２５∶２∶２∶７１）；流
速１０ｍＬ·ｍｉｎ－１；柱温３５℃；检测波长为２３０ｎｍ；
理论板数为２０００。
２．３ 溶液的制备及测定
２．３．１ 供试品溶液的制备 取本品重量差异项下的
栓适量，研碎，取０５ｇ，精密称定，精密加入稀乙醇５０
ｍＬ，称重，超声处理３０ｍｉｎ，放冷，再称重，用稀乙醇
补足失重，摇匀，离心，取上清液作为供试品溶液。
２．３．２ 对照品溶液的制备 精密称取芍药苷对照品
适量，加稀乙醇制成每１ｍＬ含６０μｇ的溶液，即得。
２．３．３ 阴性溶液的制备 取不含赤芍的阴性样品
按供试品溶液的制备方法制成阴性溶液。
２．３．４ 测定法 分别精密吸取对照品溶液、供试品
溶液、阴性溶液各１０μＬ，注入液相色谱仪，测定。
２．４ 线性关系的考察
取００２４８，００３７２，００４９６，００６２０，００７４４，
００８６８，００９９２ｍｇ·ｍＬ－１的芍药苷对照品溶液，
１０μＬ注入液相色谱仪，记录色谱图，测定其峰面
积，以峰面积（Ａ）为纵坐标，芍药苷的量（Ｃ）为横坐
标，得回归方程为 Ａ＝３６７０８４８Ｃ＋４７９１０８，ｒ＝
０９９９９（ｎ＝７）。在所拟定的色谱条件下，芍药苷在
２４８～９９２μｇ·ｍＬ－１质量浓度与峰面积线性关系
良好。
２．５ 精密度试验
精密吸取芍药苷对照品（００６２ｍｇ·ｍＬ－１）１０
μＬ，５份，注入液相色谱仪，ＲＳＤ为０３６％，以上结
果表明，仪器精密度良好。
２．６ 稳定性试验
取样品（批号２００２０１０１）制成的供试品溶液于
０，２，４，６，１２ｈ分别测定，另取芍药苷对照品溶液
（００６２ｍｇ·ｍＬ－１）１０ｕｌ，于０，２，４，６，１２ｈ，同法操
作，ＲＳＤ分别为０７５％和０４６％。试验结果表明，
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