全 文 :双参通冠方药物血清抗缺氧复氧损伤心肌细胞 ≤¤u n
超载的机制研究
刘建勋 3 o韩 笑 o许勇刚 o麻 柔
k中国中医科学院 西苑医院 o北京 tsss|tl
≈摘要 目的 }探讨双参通冠方药物血清对培养心肌细胞缺氧复氧损伤 ≤¤un超载的影响及其机制 ∀方法 }培
养心肌细胞 o建立缺氧复氧损伤模型 ∀运用血清药理学方法研究双参通冠方药物血清对缺氧复氧损伤心肌 ≤¤un超
载的影响 ∀荧光分光光度法测定心肌细胞胞浆≈≤¤un ¬o激光扫描共聚焦显微法观察高 n及 ׫¤³¶¬ª¤µª¬±诱导的细
胞内 ≤¤un变化 ∀结果 }正常心肌细胞≈≤¤u n ¬值较低 o缺氧复氧后显著增高 o高 n及 ׫¤³¶¬ª¤µª¬±可诱导细胞内
≤¤un的快速增多 o双参通冠方药物血清能降低缺氧复氧心肌细胞 ≤¤un升高 o并能抑制高 n及 ׫¤³¶¬ª¤µª¬±所致的细
胞内 ≤¤un荧光升高 ∀结论 }缺氧复氧损伤 !高 n及 ׫¤³¶¬ª¤µª¬±均可导致心肌细胞 ≤¤u n增高 o双参通冠方药物血清
可抗心肌细胞 ≤¤un超载 o其机制可能与其抑制细胞外 ≤¤un内流和促进内 ≤¤un吸收有关 ∀
≈关键词 中药血清药理学 ~≤¤un ~激光扫描共聚焦显微法
≈中图分类号 u{x1x ≈文献标识码 ≈文章编号 tsst2xvsukussyltu2s||x2sw
≈收稿日期 ussx2sz2uy
≈基金项目 国家自然科学基金资助项目kvsxzut{yl
≈通讯作者 3 刘建勋 oר¯ }kstslyu{zwsw| o∞2°¤¬¯}¬¤±¬∏±
«·1µ²¯1¦±1±¨ ·
心肌缺血再灌注损伤的发生主要与 ≤¤u n超载 !
氧代谢异常 !中性粒细胞浸润 !能量代谢障碍有关 o
目前大多研究基础及新药开发集中在 ≤¤u n超载环
节 ∀通过测定细胞内游离 ≤¤u n的含量及药物治疗
前后 ≤¤u n的流动情况 o可以提供它与疾病间关联的
直接证据和阐明药物作用的机制和环节 ∀
双参通冠方k≥≥×l由人参 !丹参 !元胡 v药的有
效组分提取物组成 o前期工作表明 o该方是治疗心肌
缺血再灌注损伤的有效中药制剂≈t ∀为进一步明确
其抗心肌缺血再灌注损伤的作用机制 o作者运用血
清药理学的实验方法 o观察双参通冠方药物血清对
≤¤u n及 ≤¤u n流动的影响 o阐明其作用机制和作用环
节 ∀
1 材料与方法
111 材料
11111 动物 健康 ≥⁄大鼠kuss ∗ uus ªl o雌雄各
半 ~新生 uw « ≥⁄大鼠 o雌雄不分 o均由北京维通利
华实验动物技术有限公司提供 o动物许可证编号
≥≤÷k京l ussu2sssv ∀
11112 药物 双参通冠方以人参 !丹参 !元胡提取
物按比例配伍而成 o以多种有效成分控制其质量 o由
本实验室提供 ∀
11113 试剂 胰酶k ∞≥≤产品l oµ型胶原酶 !
⁄∞ 培养基 !×µ¬½²¯ k¬¥¦²产品l o类标准胎牛血清
k美国 «¼¦¯²±¨ 2兰州民海生物工程公司l o׫¤³¶¬ª¤µª¬±
k≥¬ª°¤产品l oƒ¯ ∏²2vr oƒ2tuzk
¬²·¬∏°产品l o其余
试剂均为国产分析纯 ∀
11114 仪器 ≠ °≥ ≥ «t倒置显微镜 ~≥≠ p u
恒温水浴锅k江苏金坛市金城国胜实验仪器厂l ~苏
州净化设备厂超净工作台 ~≥¤±¼² ≤tzx ≤u培养
箱 ~≥«¬°¤§½∏ ƒ p xts荧光分光光度计 ~∞≥≥ ≥
xts ∞×激光扫描共聚焦显微镜 ∀
112 方法
11211 空白及 ≥≥×药物血清的制备 取 ≥⁄大鼠 o
分别灌服生理盐水 !≥≥× uu1x owx o|s °ª#®ªptk各 x
只l o连续 x §o末次给药前禁食 tu «o药后 |s °¬±腹
主动脉取血 o自然分离血清 oxy ε 灭活 vs °¬±os1u
Λ°一次性滤器过滤除菌 o所得血清分别称空白 !
≥≥×低 !≥≥×中 !≥≥×高 op us ε 短期保存备用 ∀
11212 心肌细胞的培养 无菌取出生 uw «内的 ≥⁄
大鼠心室 o剪成 s1x ∗ t °°v碎块 os1tux h胰蛋白酶
及 s1sx h µ型胶原酶消化 ovz ε 恒温水浴振荡器中
消化 t «ks1x «时取出吹打 t次l o胎牛血清终止消
#x||#
第 vt卷第 tu期
ussy年 y月
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Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
∂²¯1vt o¶¶∏¨ tu
∏±¨ oussy
化 ouss目筛子过滤 o细胞悬液 t xss µ#°¬±p t离心去
除消化液 o⁄∞ 培养基k含 tx h胎牛血清l将心肌
细胞沉淀混匀 o差速贴壁分离 t1x «≈u o得到纯化的
心肌细胞 o调整细胞数为 s1x ≅ tsy#°pt o接种于铺
有 t h明胶的培养板中 ∀放入 x h ≤u培养箱 ow{ «
后换液 ∀培养 v ∗ w §后细胞基本融合成片 o选择生
长良好 !搏动规律的细胞实验 ∀
11213 分组及培养心肌细胞缺氧复氧损伤模型的
建立 实验分为正常组 !缺氧复氧组 !≥≥×药物血
清组 ∀正常组 }取培养于 y孔板的心肌细胞 o洗净旧
培养基 o换成含 t h葡萄糖的 ×¼µ²§¨ 液≈×¼µ²§¨ 液kª#
ptl }≤¤≤¯ u s1u o ≤¯ s1u o ª≤¯ u #yu s1t o ¤≤¯
{1s o¤≤v t1s o¤u°w#u s1sx o每孔 t °o
x h ≤u培养箱中培养 t1x «后取出换为含 ts h ≥⁄
大鼠空白血清的 ⁄∞ 液继续培养 u «∀缺氧复氧
组 }洗净旧培养基 o换成 u饱和的无糖 ×¼µ²§¨ 液 o置
自制密闭盒中持续通以 |x h u n x h ≤u混合气 s1x
«o充分排尽盒中残余的氧气 o放入 x h ≤u培养箱中
培养 t1x «后 o取出换为含 ts h ≥⁄大鼠空白血清的
⁄∞ 液继续培养 u «∀ ≥≥×药物血清组 }复氧时
分别换成含 ts h ≥≥× 低 !中 !高的 ⁄∞ 液 ox h
≤u培养箱继续培养 u «o其余处理同模型组 ∀复氧
结束后 o取心肌细胞实验 ∀
11214 ƒ¯ ∏²2vr 负载心肌细胞悬液的制备 心肌
细胞缺氧复氧结束后 o°
≥冲洗细胞 u次 os1ux h胰
酶消化 o收集心肌细胞 o调整心肌细胞数为 u ≅ tsy#
°pt o加入钙荧光探针 ƒ¯ ∏²2vr z Λ°²¯ # pt o
°¯ ∏µ²±¬¦ƒ2tuz u Λ°²¯#pt o充分混匀 ovz ε 恒温水浴
振荡器中避光孵育 ws °¬±ot xss µ# °¬±p t离心 ts
°¬±o弃上清 o°
≥洗心肌细胞沉淀 u次 ot °°
≥重
悬心肌细胞 o测定前 vz ε 预温心肌细胞 v °¬±o荧光
分光光度计测定心肌细胞胞浆≈≤¤u n ¬∀
11215 荧光分光光度法测定 ≈≤¤u n ¬ 岛津 ƒ p
xts型荧光分光光度计 o激发波长 ∞¬ w{{ ±° o狭缝
ts ±° o发射波长 ∞° xux ±° o狭缝 ts ±°∀将 ƒ¯ ∏²2vr
荷载心肌细胞悬液移至石英比色杯中 o打开光
路所得测定值为 Φ~加 ≤¤≤¯ ukt °°²¯#ptl及 ×µ¬·²±÷2
tssks1t h l o溢出的 ƒ¯ ∏²2v被 ≤¤u n饱和 o产生最大荧
光值 o所测值为 Φ°¤¬ ~加入 ∞×kx °°²¯#ptl≤¤un
被 ∞×螯合 oƒ¯ ∏²2v为游离形式 o得到最小荧光值
Φ°¬± ∀心肌细胞胞浆 ≈ ≤¤u n ¬ Κδ k Φ p Φ°¬±lr
k Φ°¤¬ p Φl ~Κδ wxs ±°²¯ #pt o为 ƒ¯ ∏²2v的解离常
数 ∀
11216 心肌细胞 ƒ¯ ∏²2v的负载及激光共聚焦扫描
k≥≤l 取生长于盖玻片上的心肌细胞 o含糖 °
≥
漂洗 u ∗ v次 o洗掉细胞表面的残渣及杂质 o放入含
有 z∏ ƒ¯ ∏²2vr 和 t Λ°²¯#pt的 °¯ ∏µ²±¬¦ƒ2tuz的
°
≥ t °中 ovz ε 避光负载 ws °¬±∀ws °¬±后 °
≥
漂洗 u ∗ v次 o将盖玻片放入自制测量小池中 o上机
检测 ∀
将负载好的细胞放在激光扫描共聚焦显微镜载
物台上 o先用光学显微系统 o初步调节焦平面 o选择
状态良好的心肌细胞 o用氪氩离子激光预扫描kw{{
±°rxvs ±°l o调节扫描范围 !扫描参数k扫描方式 !光
栅大小 !扫描速度 !采样点数 !°× 增益l !焦平面使
荧光图像清晰 !层次明显 !固定仪器参数后检测
≤¤u n信号 o用激光共聚焦图像分析软件 o定量分析对
细胞的整体 !胞浆 !细胞核 ≤¤u n变化 ∀细胞内 ≤¤u n
浓度改变 o用 ƒ¯ ∏²2v相对荧光强度的变化表示 ∀
11217 统计处理 数值采用 cξ ? σ表示 o≥°≥≥tt1x
软件作 ±¨ 2 • ¤¼ ∂ 统计分析 ∀
2 结果
211 药物血清对缺氧复氧心肌细胞胞浆≈≤¤u n ¬的
影响
心肌细胞在正常生理状态下能保持细胞内外正
常 ≤¤u n浓度差及细胞内低 ≤¤u n水平 ∀缺氧 t1x «复
氧 u «后的心肌细胞胞浆游离 ≤¤u n浓度显著性增
加 o约为正常对照组的 t倍 o其差异具统计学意义
kΠ s1stl ∀在复氧时给予 ≥≥×药物血清处理后
的心肌细胞≈≤¤u n ¬明显降低k Π s1sxlk见表 tl ∀
表 t ≥≥×药物血清对缺氧复氧心肌细胞
≈≤¤un ¬的影响kcξ ? σl
组别 ν ≈≤¤u n ¬r±°²¯#pt
正常 { uwu q|zw ? t| qtvt
模型 z wzx qs{{ ? uw qy|t
≥≥×低 { www qsyv ? uw qsy{tl
中 z v{x q{|z ? vx q|u{vl
高 { wvs qwxs ? vy qytwul
注 }与模型组相比tl Π s1sx oul Π s1st ovl Π s1sst
212 药物血清对高 n及钙泵抑制剂 ׫¤³¶¬ª¤µª¬±
致心肌细胞内 ≤¤u n升高影响
/ ≥≥×中0为受试药 o空白血清为对照 o用激光
扫描共聚焦显微技术k≥≤l观察 ≥≥×对高 n及
׫¤³¶¬ª¤µª¬±引起心肌细胞内 ≤¤u n升高的影响 ∀
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∂²¯1vt o¶¶∏¨ tu
∏±¨ oussy
21211 ≥≥× 药物血清对高 n 引起心肌细胞外
≤¤u n内流的影响 在细胞外液为含 ≤¤u n台氏液k含
≤¤u n t1{ °°²¯#ptl的情况下 o激光扫描共聚焦显微
镜记录基础 ≤¤u n 荧光值 o之后加入 n kys °°²¯ #
ptl o记录 ≤¤u n荧光值变化 o之后加入空白血清或
≥≥×药物血清 o观察空白或 ≥≥×药物血清处理后
tss ouss ¶内细胞内 ≤¤u n的变化 ∀
结果表明 o≠ 心肌细胞外液为含 ≤¤u n液时 o给
予 n刺激 o细胞外 ≤¤u n内流 o心肌细胞 ≤¤u n基础荧
光值快速升高 ~空白血清处理后 tss ouss ¶内细胞
≤¤u n荧光大多仍在上升 ~≥≥×血清处理后 tss ¶内
对细胞 ≤¤u n荧光的抑制率达 ys1w h o处理后 uss ¶
时 ≤¤u n荧光基本回落到静息状态 o与空白血清相
比 o差异具统计学意义k Π s1stlk表 u o图 t oul ∀
表 u 空白及 ≥≥×药物血清对 n去极化引起 ≤¤un
升高抑制率的影响k ν yl h
血清 加入后 tss ¶内 加入后 uss ¶内
空白 tv qvx uz qu{
≥≥× ys qwtl |z qxtl
注 }与空白血清相比tl Π s1sstk表 v同l
图 t 空白血清对细胞 ≤¤un荧光的影响
图 u ≥≥×血清对细胞 ≤¤un荧光的影响
21212 ≥≥×药物血清对细胞内钙泵抑制剂 ׫¤¶³¬2
ª¤µª¬±引起细胞内 ≤¤u n升高的影响 在细胞外无
≤¤u n的情况下 o激光扫描共聚焦显微镜记录基础
≤¤u n荧光值 o之后加入 ׫¤¶³¬ª¤µª¬±ks1st °°²¯ #
ptl o记录 ≤¤u n荧光值变化 o之后加入空白血清或
≥≥×药物血清 o观察空白或 ≥≥×药物血清处理后
xs otss ¶内 ≤¤u n的变化 ∀
结果表明 o心肌细胞外液为无 ≤¤u n液时 o给予
׫¤³¶¬ª¤µª¬±刺激 o细胞内 ≤¤u n荧光值快速升高 ~空
白血清处理后 xs otss ¶胞浆 ≤¤u n荧光仍在上升 o
≥≥×血清处理后 xs otss ¶后对细胞 ≤¤u n升高的抑
制率分别为 {1uz h oz|1|t h o与空白血清相比 o差异
具统计学意义k Π s1sxlk表 v o图 v owl ∀
表 v 空白及 ≥≥×药物血清对 ׫¤¶³¬ª¤µª¬±所致
≤¤nu 升高的抑制率的影响k ν z o{l h
血清 加入后 xs ¶内 加入后 tss ¶内
空白 p xu1t| p vt1sw
≥≥× {1uztl z|1|ttl
图 v 空白血清对细胞 ≤¤un升高的影响
图 w ≥≥×血清对细胞 ≤¤un升高的影响
3 讨论
细胞内 ≤¤u n超载是心肌缺血再灌注k心肌细胞
缺氧复氧l损伤的重要病理环节 ∀细胞内 ≤¤u n稳态
失控是众多因素引起细胞坏死的共同机制 ∀对心肌
缺氧复氧状态下 ≤¤u n超载及其机制进行研究将有
助于临床诊断和治疗 ∀
311 缺氧复氧心肌细胞 ≤¤u n含量及内 !外 ≤¤u n的
流动
内 ≤¤u n信号的发生是基于细胞溶质中 ≤¤u n浓
度时空依赖性的变化 o因此测定静态和激活态细胞
溶质中的 ≤¤u n浓度十分重要 ∀
实验结果表明 o≥≥×低 !中 !高药物血清均能
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降低缺氧复氧损伤心肌细胞内 ≤¤u n浓度 o抑制细胞
≤¤u n超载 o为明确其机制 o选用抗 ≤¤u n超载作用最
强的/ ≥≥×中0药物血清作为受试药物 o以激光共聚
焦显微镜动态监测心肌细胞内 ≤¤u n信号 o观察 ≥≥×
药物血清对细胞内 !外 ≤¤u n流动的影响 ∀
高 n可引起心肌细胞去极化 o细胞外 ≤¤u n内
流 o导致细胞内 ≤¤u n升高 ∀在细胞外液为含钙台氏
液的情况下 o利用激光共聚焦显微镜记录静息态
≤¤u n荧光值 o加入 n后 o记录激活态 ≤¤u n荧光值 o
加入空白或药物血清 o可动态观察到 ≤¤u n的变化 o
提供药物血清 ≤¤u n影响的机制是否与抑制外钙内
流有关 ∀׫¤³¶¬ª¤µª¬±为细胞内钙泵抑制剂 o可抑制
细胞内钙泵摄钙 o导致细胞内钙迅速增加 ∀在细胞
无外 ≤¤u n的情况下 o激光共聚焦显微镜记录静息态
≤¤u n荧光值 o加入 ׫¤³¶¬ª¤µª¬±记录激活态 ≤¤u n荧光
值 o加入空白或药物血清 o可动态观察到 ≤¤u n的变
化 o提供药物血清 ≤¤u n影响的机制是否与加强钙泵
重摄有关 ∀
结果提示 o≥≥×药物血清抗缺氧复氧损伤细胞
内 ≤¤u n超载的作用机制与其抑制细胞外 ≤¤u n内流
和促进细胞内 ≤¤u n吸收的作用有关 ∀
312 ≥≥×药物血清对心肌细胞内 !外 ≤¤u n流动影
响的实验研究未采用缺氧复氧损伤模型的考虑
细胞内 ≤¤u n的测定是用 ≤¤u n荧光探针 ƒ¯ ∏²2vr
o负载心肌细胞 oƒ¯ ∏²2vr 进入细胞后被酶水解
为 ƒ¯ ∏²2v o与 ≤¤u n结合 o在激发波长 w{{ ±°r发射波
长 xvx ±°处发荧光 o以荧光强度表示 ≤¤u n浓度 ∀
若采用缺氧复氧模型 o待缺氧复氧结束后 o进行
ws °¬±的 ƒ¯ ∏²2v负载 o加上漂洗等实验程序 o待上机
检测时 o时间约比正常的实验晚了 t «o而在这 t «
内 ≤¤u n已发生了大量瞬息万变的变化 ∀
再者 o本实验的目的是 ≥≥×观察药物血清对
细胞内升高的 ≤¤u n的影响 o因此 o本实验在细胞外
液为含 ≤¤u n或无 ≤¤u n液的情况下 o用高 n或细胞
内钙泵抑制剂 ׫¤³¶¬ª¤µª¬±刺激心肌细胞 o引起细胞
内 ≤¤u n浓度迅速升高 o利用 ≥≤ 技术动态观察药
物血清对 ≤¤u n影响的机制是否与抑制细胞外 ≤¤u n
内流或k和l增强细胞内 ≤¤u n泵吸收有关 o阐明 ≥≥×
抗细胞内 ≤¤u n超载的作用机制 ∀
≈参考文献
≈t 韩 笑 o刘建勋 o马晓斌 o等 q双参通冠方对急性心肌缺血再灌
注 ׃2Αo≤2t的影响 q中国中药杂志 oussw ou|kttl }tszv q
≈u 李连达 o靖雨珍 q中医药研究 q北京 }科学技术文献出版社 o
usst1zy q
Μεχηανισµ οφ σερυµ χονταινινγ ΣΣΤΓ ον χαλχιυµ οϖερλοαδ ιν
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( Ξιψυαν Ηοσπιταλ, Χηινα Αχαδεµψ οφ Χηινεσε Μεδιχαλ Σχιενχεσ , Βειϕινγ tsss|t , Χηινα)
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·¬√¨©µ¤¦·¬²±¶²© ≤«¬±¨ ¶¨ ° §¨¬¦¬±¨ o²± ¦¤¯¦¬∏° ²√ µ¨¯²¤§¬± ¦∏¯·∏µ¨§¦¤µ§¬²°¼²¦¼·¨¶¬±∏µ¨§¥¼ «¼³²¬¬¤¤±§µ¨²¬¼ª¨ ±¤·¬²±q Μετηοδ : ׫¨ ¦¤µ2
§¬²°¼²¦¼·¨¶º µ¨¨ §¨³µ¬√ §¨²©²¬¼ª¨ ± ¤±§ª¯∏¦²¶¨ ·²³µ²§∏¦¯ «¼³²¬¬¤µ¨²¬¼ª¨ ±¤·¬²±¬±∏µ¬¨§°²§¨ ¶¯q׫¨ ¦«¤±ª¨¶²©¬±·µ¤¦¨¯¯∏¯¤µ¦¤¯¦¬∏° ©¯∏²2
µ¨¶¦¨±¦¨ ¬±·¨±¶¬·¼¬±§∏¦¨§¥¼ n ¤±§×«¤³¶¬ª¤µª¬± º µ¨¨ ° ¤¨¶∏µ¨§¥¼ ©¯∏²µ²¶³¨¦·µ²³«²·²° ·¨µ¼ ¤±§ ¤¯¶·¨µ¶¦¤±±¬±ª¦²±©²¦¤¯ °¬¦µ²¶¦²³¨ µ¨¶³¨¦2
·¬√¨¯¼q Ρεσυλτ : ±·µ¤¦¨¯¯∏¯¤µ¦¤¯¦¬∏° ¦²±¦¨±·µ¤·¬²± º¤¶ ²¯º ¬± ±²µ°¤¯ ¦¤µ§¬²°¼²¦¼·¨¶¤±§ º¤¶ ±¨«¤±¦¨§¤©·¨µ«¼³²¬¬¤rµ¨²¬¼ª¨ ±¤·¬²± k Π
s1sxl ~≥≥× §µ∏ª¶¨µ∏° µ¨§∏¦¨§·«¨ ¬±·µ¤¦¨¯¯∏¯¤µ¦¤¯¦¬∏° ¦²±¦¨±·µ¤·¬²± ¤±§§¨³µ¨¶¶¨§·«¨ ¬±¦µ¨¤¶¨ ²©¦¤¯¦¬∏° ©¯∏²µ¨¶¦¨±¦¨ ¬±·¨±¶¬·¼¬±¶¬±ª∏2
¤¯µ¦¤µ§¬²°¼²¦¼·¨ §∏¨ ·² n ¤±§×«¤³¶¬ª¤µª¬±¶·¬°∏¯¤·¬²±qΧονχλυσιον :¼³²¬¬¤rµ¨²¬¼ª¨ ±¤·¬²±¬±∏µ¼on ¤±§×«¤³¶¬ª¤µª¬±¦²∏¯§¬±§∏¦¨ ¦¤¯2
¦¬∏° ²√ µ¨¯²¤§¬± ¦¤µ§¬²°¼²¦¼·¨¶q׫¨ ©¨©¨ ¦·¶²©¦¤¯¦¬∏° ¤±·¤ª²±¬¶° ²©≥≥× §µ∏ª¶¨µ∏° º µ¨¨ ¤¦«¬¨√ §¨¥¼¬±«¬¥¬·¬±ª¦¤¯¦¬∏°¬±©¯²º o³µ²°²·¬±ª
¦¤¯¦¬∏° µ¨2¤¥¶²µ³·¬²± ²©¦¤¯¦¬∏° q
[ Κεψ ωορδσ] ¶¨µ∏° ³«¤µ°¤¦²¯²ª¼ ²© ≤«¬±¨ ¶¨ «¨µ¥¤¯ ° §¨¬¦¬±¨ ~¦¤¯¦¬∏° ~ ¤¯¶¨µ¶¦¤±±¬±ª¦²±©²¦¤¯ °¬¦µ²¶¦²³¨
≈责任编辑 刘
#{||#
第 vt卷第 tu期
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