全 文 ：现的降低 o还是金莲花种子在贮藏过程中的自身规
律性变化 o今后需做深入研究 ∀
种子发芽率是用来判断种子贮藏时间长短的主
要指标 ∀但是室内发芽率和田间成苗率往往有一定
的差距 o若能把种子贮藏时间 !室内发芽率和田间发
芽率结合起来研究种子寿命 o会有很大的应用价值 o
对于金莲花这类具有休眠特性的种子更为重要 ∀
≈参考文献  
≈t  毕辛华 o戴心维 q种子学 ≈   q北京 }中国农业出版社 ot||v}
yxq
≈u  顾增辉 o龙雅宜 q金莲花种子的休眠 !萌发与活力的研究 ≈ q
植物资源与环境 ot||uotkwl}vsq
≈v  丁万隆 o陈 君 o张丽萍 o等 q贮藏方法对打破金莲花种子休眠
的影响 ≈ q中国中药杂志 ousssouxkxl}uyyq
≈责任编辑 张宁宁  
≈收稿日期   ussy2sz2ut
≈通讯作者   3 陈放 oר¯}ksu{l{xwtzu{to∞2°¤¬¯}¦«¨ ±ª©¤±ªƒ
uyvq± ·¨
天麻 „ƒ°反应体系的建立及优化
关 萍 tou o石建明 u o陈 放 t3
ktq四川大学 生命科学学院 o四川 成都 ytssyw~
uq贵州大学 生命科学学院 o贵州 贵阳 xxssuxl
近年来 o随着分子标记技术在植物学研究方面
的广泛应用 o不少中药研究者也尝试把分子标记技
术用于中药材资源的分子鉴定和道地药材的鉴定 ∀
但有关 „ƒ°技术真正应用于中药材种质资源的鉴
定研究几乎未见报道 ∀天麻是名贵的中药材之一 o
有关天麻的分子鉴定研究目前尚未见报道 ∀本研究
以天麻为试验材料 o对天麻 „ƒ°体系的建立及体
系的优化进行研究 o以初步建立适合于天麻 „ƒ°
技术的反应体系 o为天麻的遗传多样性研究 ! 分子
指纹图谱的建立及分子鉴定奠定基础 ∀
1 材料与试剂
1q1 材料
供试材料自 ussv ∗ ussw年箭麻出芽开花期间
采自贵州 !云南 !四川 !陕西和辽宁 o样品采集地见表
t∀样品经贵州大学植物教研室鉴定为天麻 Γαστρο2
δια ελατα … ∀¯选取无病虫危害的天麻花茎或幼嫩的
初生块茎用自来水和蒸馏水冲洗干净 o吸干水分保
存于 pus ε 冰箱备用 ∀
1q2 试剂
 ¶¨ ´限制性内切酶和 ∞¦²• ´限制性内切酶
购自纽英伦生物技术 k北京 l有限公司 ∀ ×w⁄‘„连
接酶 !פ´ ⁄‘„聚合酶 !u sss ¥³ ¤µ®¨ µ购自 פŽ¤• ¤
宝生物工程 k大连 l有限公司 ∀  ¶¨´ r∞¦²• ´接头 !
 ¶¨´ r∞¦²• ´核心引物及  ¶¨´ r∞¦²• ´选择性扩
增引物由北京赛百盛基因技术有限公司合成 ∀亲和
硅烷 !剥离硅烷等购于北京鼎国生物技术有限责任
公司 ∀甲叉双丙烯酰胺为瑞士进口分装 ∀其他试剂
均为国产分析纯 ∀
2 方法
2q1 基因组 ⁄‘„的提取
用幼嫩的花茎或初生块茎的幼芽采用改进的
≤ׄ…法提取天麻基因组 ⁄‘„o提取方法见参考文
献 ≈t ∀
2q2 „ƒ°体系的建立
„ƒ°实验流程按邹喻萍等的方法进行 ≈u  o主
要包括基因组 ⁄‘„的双酶切 !„ƒ°接头的连接 !酶
切产物的预扩增和选择性扩增 !扩增产物凝胶电泳
分析和 „ƒ°银染检测及引物筛选 ∀
2q2q1 基因组 ⁄‘„的限制性酶切 于 xss ˏ的
小离心管中加入下列物质 }ts ≅ ‘∞…u ¥∏©©¨µx ˏo
样品 ⁄‘„模板设计 x个等次即 txsouxsovxsowsso
xss ±ªo∞¦²• ´ kus ˜# ˏpt ls1x ˏo ¶¨´ kts ˜
# ˏpt lt ˏotss ≅ …≥„ u1x ˏo双蒸水补足体积
到 xs ˏ∀为了获得天麻基因组 ⁄‘„双酶切的最
佳时间 o将反应液混匀后置于 vz ε 分别酶切 woxoy
«后 o用 th的琼脂糖检测 o如已无 ⁄‘„主带即可把
反应液放入 yx ε 温浴 ts °¬±钝化限制性内切酶 o
#z{tu#
第 vu卷第 us期
ussz年 ts月
中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλοφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
∂ ²¯qvuo Œ¶¶∏¨ us
’¦·²¥¨ µo ussz
表 t uz个供试材料及来源
样品号 名称 来源
t 红天麻 Γαστροδια ελατα 贵州道真 k栽培 l
u 乌天麻 Γ. ελατα ©q γλαυχα 贵州道真 k栽培 l
v 绿天麻 Γ. ελατα ©q ϖιριδισ 贵州道真 k栽培 l
w 红天麻 Γ. ©qελατα 贵州大方 k栽培 l
x 乌天麻 Γ. ελατα ©q γλαυχα 贵州大方 k栽培 l
y 绿天麻 Š ¨¯¤·¤ φ. √¬µ¬§¬¶ 贵州大方 (栽培 )
z 红天麻 Šq ¨¯¤·¤ φ. ¨¯¤·¤ 贵州雷公山 (野生 )
{ 红天麻 Šq ¨¯¤·¤ φ. ¨¯¤·¤ 贵州施秉 (栽培 )
| 红天麻 Šq ¨¯¤·¤ φ. ¨¯¤·¤ 贵州毕节 (栽培 )
ts 绿天麻 Γ ελατα ©q ϖιριδισ 贵州梵净山 k野生 l
tt 绿天麻 Š ¨¯¤·¤ φ. √¬µ¬§¬¶ 贵州桐梓 (野生 )
tu 绿天麻 Γ ελατα ©q ϖιριδισ 贵州正安 k野生 l
tv 红天麻 Γ. ελατα ©q ελατα 贵州贵定 k栽培 l
tw 红天麻 Γ. ελατα ©q ελατα 贵州绥阳 k野生 l
tx 红天麻 Γ. ελατα ©q ελατα 贵州贵阳 k栽培 l
ty 红天麻 Γ. ελατα ©q ελατα 四川青川 k野生 l
tz 红天麻 Γ. ελατα ©q ελατα 四川万源 k野生 l
t{ 红天麻 Γ. ελατα ©q ελατα 四川平武 k栽培 l
t| 乌天麻 Γ. ελατα ©q γλαυχα 四川平武 k栽培 l
us 红天麻 Γ. ελατα ©q ελατα 四川峨眉山 k栽培 l
ut 红天麻 Γ. ελατα ©q ελατα 陕西巴山 k野生 l
uu 红天麻 Γ. ελατα ©q ελατα 陕西秦岭 k野生 l
uv 乌天麻 Γ. ελατα ©q γλαυχα 云南昭通 k栽培 l
uw 黄天麻 Γ. ελατα ©q φλαϖιδα 云南昭通 k栽培 l
ux 绿天麻 Γ1 ελατα ©q ϖιριδισ 云南昭通 k栽培 l
uy 绿天麻 Γ1 ελατα ©q ϖιριδισ 辽宁宽甸 k野生 l
uz 红天麻 Γ. ελατα ©q ελατα 辽宁宽甸 k野生 l
取出后置于 w ε 冰箱备用 o若需长期保存则放入 p
us ε 冰箱 ∀
2q2q2 „ƒ°接头的连接 取 wt ˏ经过酶切的
⁄‘„样品中加入 ∞¦²• ´接头 kx Λ°²¯ # pt lt1s
ˏo ¶¨ ´ kxs Λ°²¯ # pt lt1s ˏo×w⁄‘„ ¬ª¤¶¨
kvxs ˜# ˏpt lu1s ˏots ≅ ×w ⁄‘„ ¬ª¤¶¨ ¥∏©©¨µx
ˏo使总体积达到 xs ˏo混匀后于 ty ε 连接过夜 ∀
取 ts ˏ连接产物稀释 ts倍 o稀释好的产物和剩余
产物置于 pus ε 贮存 ∀
2q2q3 预扩增反应 取 x1s ˏ连接完成的 ⁄‘„
样品中加入 wx ˏ以下混合液 }ts ≅ °≤• ¥∏©©¨µx1s
ˏo§‘×°kx °°²¯ # pt lw1s ˏo ux °°²¯ # pt
 ª¦¯ v1s ˏoפ´ 酶 kx ˜# ˏpt ls1x ˏo∞¦²• ´预
扩增引物 kts Λ°²¯ # pt lu1s ˏ! ¶¨´预扩增引
物 kts Λ°²¯ # pt lu1s ˏ!双蒸水补足体积到 xs
ˏ∀反应液混匀后进行扩增 ∀扩增程序如下 }|w ε
u °¬±~|w ε vs ¶oxy ε vs ¶ozu ε t °¬±o共 vs个循
环 ~zu ε x °¬±~w ε n ] ~反应结束后取 x ˏ°≤•
产物用 th的琼脂糖凝胶电泳检测预扩增效果 o然
后将预扩增产物稀释 ts ∗ us倍置于 p us ε 冰箱保
存备用 ∀
2q2q4 选择性扩增 选择性扩增引物的选择性碱
基采用 v nv引物组合 ∀选择性扩增反应体系如下 }
ts ≅ °≤• ¥∏©©¨µu1x ˏo§‘×°kx °°²¯ # pt lu1s
ˏo ª¦¯kux °°²¯ # pt lt1x ˏoפ´ 酶 kx ˜ #
∏pt ls1u ˏo∞¦²• ´选择性扩增引物 kts Λ°²¯ #
pt lt1s ˏo ¶¨ ´选择性扩增引物 kts Λ°²¯ #
pt lt1s ˏ!分别取稀释 x倍 !ts倍和 us倍的预扩
增产物各 u ˏ!双蒸水补足体积到 ux ˏ∀扩增程
序如下 }|w ε u °¬±~|w ε vs ¶oyx ε vs ¶ozu ε t
°¬±o梯度降温 o每个循环降低 s1z度 o共 tu个循环 ~
|w ε vs ¶oxy ε vs ¶ozu ε t °¬±o共 vs个循环 ~zu
ε x °¬±~w ε n ] ~反应结束后取 x ˏ用 th的琼
脂糖凝胶电泳检测扩增效果 o将选择性扩增产物置
于 pus ε 冰箱保存备用 ∀
2q2q5 聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染 取 w ∗ x ˏ
扩增产物加入等体积的上样缓冲液 k|{h甲酰胺 o
ts °°²¯# pt ∞⁄ׄos1zxh溴酚蓝 os1uxh二甲苯
青 l混匀 o|x ε 变性 x °¬±后立即在冰上冷却待用 ∀
在 yh的 °„Š∞胶上样孔中点 { ˏo恒功率 zs • o
电泳 t1x «左右 o直至二甲苯青带至板的 urv终止
电泳 o取下玻璃板迅速固定 !银染 ∀
3 结果与讨论
3q1 模板 ⁄‘„质量与浓度的影响
在进行 „ƒ°的分析中 o高相对分子质量基因
组 ⁄‘„的成功制备和避免部分降解是 „ƒ°成功
的关键 o模板的质量将影响酶切是否充分及以后的
连接反应 ∀天麻是无绿叶的真菌营养型寄生性植
物 ∀由于天麻的块茎主要是储藏组织 o故很难提取
高质量的 ⁄‘„≈t  ∀用幼嫩的芽和花茎可以获得适
宜 „ƒ°分析的基因组 ⁄‘„∀从图 t可见 ⁄‘„带
清晰无 ⁄‘„降解 o同时 ⁄‘„较纯 o无易使内切酶失
活的物质污染 ∀ „ƒ°对模板浓度的要求不是很
高 o浓度可在 txs ∗ xss ±ª∀
3q2 酶切时间的影响
„ƒ°分析过程中基因组 ⁄‘„是否被完全酶切
影响最终结果 ∀如果 ⁄‘„酶切不完全 o酶切片段覆
盖不了整个基因组 o反映的不是真实的多态性 ≈vow  o
难以建立真实的分子指纹图谱 ∀酶切时间的长短直
接影响酶切效果 ∀不同种类的植物由于基因组大小
不同酶切时间长短也有差异 ∀本实验为了确立合适
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图 t 不同产地的天麻 ⁄‘„凝胶电泳结果
 q⁄‘„ °¤µ®¨ µ~t1贵州道真红天麻 ~u1贵州道真乌
天麻 ~v1贵州道真绿天麻 ~w1贵州大方红天麻 ~
x1贵州大方乌天麻 k图 u同 l
天麻的酶切时间 o选用了酶切 woxoy « v个酶切时
间 ∀结果发现酶切 y «的效果最佳 o在 th的琼脂糖
电泳检测可见酶切完全的带成均匀明亮带 o见图 u∀
此外 o还需注意酶量的掌握 ∀ „ƒ°所用的限制性
内切酶 o其中一种是稀有酶 o如  ¶¨´ o°¶·´价格昂
贵 ∀用量过多造成浪费而酶量不足又会造成酶切不
充分 o影响后续操作 ∀在天麻酶切体系中酶的用量
为总体系的 trts ∗ trx最适宜 ∀
图 u 不同产地的天麻酶切凝胶电泳结果
3q3 预扩增反应的影响
预扩增引物只含 t个选择性碱基 o选择扩增性
能较差 o因此大量的扩增产物在琼脂糖凝胶中往往
形成连续的弥散带 k¶° ¤¨µlo见图 v∀预扩增反应产
物进行稀释后用作选择性扩增反应的模板 ∀结果表
明 o天麻预扩增产物的稀释在 tsotxous倍都能获得
理想的选择性扩增结果 o说明选择性扩增对预扩增
产物的浓度要求并不很严格 ∀
图 v 预扩增检测结果图
3q4 选择性扩增的影响
在 „ƒ°分析中 o如 ⁄‘„的提取 !酶切连接及
预扩增都达到操作要求 o后续的选择性扩增都能获
得理想的结果 ∀而选择性反应中引物的选择性碱基
数的多少决定选择性扩增的结果 ∀选择性碱基多扩
增条带少 o反之扩增带则多 ∀选择性碱基多于 w个
以上 o引物与模板的错配率增加 ∀通常基因组大的
物种采用 / v n v0或 / v n u0 的组合 ∀在天麻的
„ƒ°分析中采用了 / v nv0的组合也获得了条带清
晰 !稳定性好 !多态性较丰富的图谱 o见图 w∀
图 w 引物组合  2≤„≤ r∞2„„≤对 uz个样品
选扩产物在 °„Š∞胶上的电泳银染结果
4 小结
由于 „ƒ°实验流程较长 !步骤较多 o涉及的因
素也较多 o实验中容易出现一些问题 o为了使 „ƒ°
在天麻遗传多样性和分子指纹图谱研究中得到应用 o
笔者通过实验基本建立了稳定的天麻 „ƒ°实验体
系 ∀在实验中必须严格按实验流程操作 o特别注意以
下几点 }≠ ⁄‘„的提取材料最好选用幼嫩的花茎或
初生块茎中的顶芽 ∀ 掌握好酶切和连接时间 ∀ ≈
°„Š∞胶的制备中 o玻璃板必须洗干净以免产生气泡
影响点样和观察 ∀同时胶的厚薄要均匀 o否则条带易
倾斜 ∀ …掌握好染色后漂洗时间和显色时间 ∀
≈参考文献  
≈t  关 萍 o康冀川 q兰科植物天麻基因组 ⁄‘„提取方法的比较
研究 ≈ q山地农业生物学报 ousswouvkxl}wuuq
≈u  邹喻萍 o郭 颂 q系统与进化植物学中的分子标记 ≈  q北京 }
科学出版社 ousst}ts{q
≈v  易干军 o霍合强 q荔枝 „ƒ°分析体系的建立 ≈ q果树学报 o
ussuot|kyl}vytq
≈w  程丽莉 o苏叔钗 q板栗叶片 ⁄‘„的提取及 „ƒ°反应体系的建
立 ≈ q北京农学院学报 oussxouskwl}yq
≈责任编辑 张宁宁  
#|{tu#
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