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Mechanism of Shenqi compound recipe anti-earlier diabetic artherosclerosis in GK rats

参芪复方抗自发性糖尿病GK大鼠早期动脉粥样硬化的作用机制



全 文 :®ªpt#§ptl ©²µ·«µ¨¨§¤¼¶o·«¨ ¤¯¶··µ¨¤·° ±¨·º¤¶³µ¨·µ¨¤·¨§uw «¥¨©²µ¨ ·«¨ ¬±§¨¬²¦¦¯∏¶¬²±q≤¨¯¯¤³²³·²¶¬¶º¤¶° ¤¨¶∏µ¨§¥¼ ©¯²º ¦¼·²° ·¨µ¼o
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[ Κεψ ωορδσ] ≥¬±¬§¨¦²¦·¬²±~§¨ ¤¯¼¨ §³µ¨¦²±§¬·¬²±¬±ª~¤³²³·²¶¬¶~¥¦¯2¬¯ ~¦¼·²¦«µ²°¨ ≤ ~¦¤¶³¤¶¨2v
≈责任编辑 古云侠 
≈收稿日期  ussx2ts2sy
≈基金项目  四川省应用基础研究计划项目ksw≠su|2stu2tl
≈通讯作者  3 谢春光 oר¯ }ksu{l{||y{{ux o∞2°¤¬¯}¬¬¨¦ªussw ƒ
tuy q¦²°
参芪复方抗自发性糖尿病 ŠŽ大鼠早期动脉
粥样硬化的作用机制
张红敏t o陈世伟u o谢春光v 3 o谢毅强v o邓西方v
kt1 四川大学 华西医院 中西医结合科 o四川 成都 ytsswt ~
u1 四川大学 华西公共卫生学院 营养与食品卫生教研室 o四川 成都 ytsswt ~
v1 成都中医药大学 中医内科教研室 o四川 成都 ytsszxl
≈摘要  目的 }探讨参芪复方抗 u型糖尿病k×u⁄l早期动脉粥样硬化k„≥l的作用机制 ∀方法 }w月龄 ≥°ƒ级
ŠŽ大鼠按血糖水平随机分为模型对照组kx °#®ªp t#§pt无菌水l !雷米普利k阳性对照 ot °ª#®ªp t#§ptl !参芪复方
低 !高剂量组ks1zu ou1{{ ª#®ªp t#§ptl组 ~另设正常对照组kx °#®ªpt#§pt无菌水l ∀w组 ŠŽ大鼠在自由进食高脂饲
料同时 o腹腔注射kts °ª#®ªp t#§ptlΛ2Ν2硝基精氨酸甲酯(Λ2Ν„∞l诱导早期 „≥ ~正常对照组予普通饲料 o腹腔注射
生理盐水 ∀造模同时 o各组动物每天灌胃给予相应受试物 vu §∀实验结束时 o腹主动脉采血 o冰上取主动脉 ∀酶免
法检测血清单核细胞趋化蛋白2t k≤°2tl含量 o实时定量 • ×2°≤• 法检测主动脉 ≤°2t及过氧化物酶体增生物激活
受体 Χk°°„•Χl基因 °• ‘„表达 ∀结果 }参芪复方低 !高剂量组大鼠的血清 ≤°2t水平 !高剂量组主动脉 ≤°2t °• 2
‘„表达较模型组显著降低k Π s1sxl o参芪复方低 !高剂量组主动脉 °°„•Χ °• ‘„ 表达较模型组明显增加k Π
s1sx或 Π s1stl ∀结论 }抑制主动脉 ≤°2t °• ‘„及蛋白表达 o上调主动脉 °°„•Χ表达可能是参芪复方抗 ⁄ 性
„≥的部分作用机制 ∀
≈关键词  参芪复方 ~u型糖尿病 ~糖尿病性动脉粥样硬化 ~炎症 ~单核细胞趋化蛋白2t ~过氧化物酶体增生物
激活受体 Χ
≈中图分类号  • u{x1x ≈文献标识码  „ ≈文章编号  tsst2xvsukussyltx2tuzu2sx
参芪复方是成都中医药大学谢春光教授的经验
方 o主要由人参 !黄芪 !山药 !山茱萸 !生地黄 !天花
粉 !丹参 !制大黄等组成 o具有益气养阴 o清热生津 o
活血化瘀的作用 o体现了临床上糖尿病的常用治
法≈t  ∀本课题前期工作显示 o参芪复方具有减少糖
尿病k⁄l早期动脉粥样硬化k„≥l大鼠胸主动脉内
膜 „≥病变数目 o减轻内皮下细胞浸润和脂质沉积
的作用 ∀本研究对参芪复方抗自发性糖尿病 ŠŽ大
鼠早期动脉粥样硬化的作用机制进行了探讨 ∀
1 材料
111 动物
w月龄雄性 ≥°ƒ级自发性糖尿病 ŠŽ大鼠 xs只
及正常 •¬¶·¤µ大鼠 tu只k上海斯莱克 ≥„≤ 实验动
物有限责任公司l o按 u ∗ v只r笼饲养于独立通气笼
具kŒ∂ ≤l系统内 ∀
112 主要药品与试剂
参芪复方kt ª干燥粉相当于原生药 ts ªo四川
#uzut#
第 vt卷第 tx期
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Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
∂²¯1vt oŒ¶¶∏¨ tx
„∏ª∏¶·oussy
大学华西药学院药厂生产 o批号 ussvtss{l o雷米普
利片k„√¨ ±·¬¶°«¤µ°¤ ≥1°1„ 生产 o批号 wusl oΛ2Ν2
硝基精氨酸甲酯(Λ2Ν2„∞o≥¬ª°¤公司l o胆固醇及
猪胆盐k成都科龙化工试剂厂l o大鼠单核细胞趋化
蛋白2tk≤°2tl酶免试剂盒k上海森雄科技实业有限
公司进口分装l o总 • ‘„ 提取试剂k美国 Œ±√¬·µ²ª¨±
¬¯©¨ ·¨¦«±²¯²ª¬¨¶公司l o反转录试剂盒 kƒ µ¨°¨ ±·¤¶
…Œl o实时定量聚合酶链反应kµ¨¤¯ ·¬°¨ °≤• l试剂盒
k≥≠…• µ °µ¨°¬¬ ∞¬ פ´ א o宝生物工程大连有限公
司l o反转录第一条互补脱氧核糖核酸k¦⁄‘„l链合
成试剂盒k加拿大 ƒ µ¨°¨ ±·¤¶ …Œ公司l o°≤• 引物
≈宝生物工程k大连l有限公司  o琼脂糖 otss ¥³脱氧
核糖核酸k⁄‘„l¤§§¨µ¶k加拿大 ƒ µ¨°¨ ±·¤¶…Œl ∀
113 主要仪器
¬≤¼¦¯ µ¨¬±×荧光实时多波长 °≤• 仪 k…Œ’ p
• „⁄l o紫外2可见分光光度计k岛津 …¬²≥³¨¦p °¬±¬l o
普通 °≤• 仪k…¬²°¨ ·µ¤l o酶标仪k∏¯·¬¶®¤± ∞÷ °µ¬°¤µ¼
∞Œ„ ∂u1t p s型 o芬兰l ∀
2 方法
211 分组及造模
大鼠适应性饲养 t 周后 o随机选取血糖值在
tt1t °°²¯#pt以上的 ŠŽ大鼠 o分为模型对照 !雷米
普利 !参芪复方低剂量和参芪复方高剂量组各 tt
只 ∀ •¬¶·¤µ大鼠 tu只中剔除血糖值在 y1{ °°²¯#pt
者 t只 o其余 tt只作为正常对照组 o共 x组 ∀动物
造模 }ts °ª#®ªpt#§pt腹腔注射一氧化氮合成酶
k‘’≥l抑制剂 Λ2Ν„∞o同时喂饲高脂饲料k普通饲
料 {{1u h !精炼猪油 ts h !胆固醇 t1x h !猪胆盐
s1v h l ∀正常对照组喂饲普通饲料 ots °ª#®ªpt#
§pt腹腔注射生理盐水 o连续 w周 ∀造模同时开始给
药 o周期 vu §∀正常对照和模型对照组 }按 x °#
®ªpt#§pt灌服无菌水 ~雷米普利组 }按 t °ª#®ªpt#
§pt体重灌服雷米普利悬液 ~参芪复方低 !高剂量组
分别按 s1zu ou1{{ ª#®ªpt#§pt体重k相当于成人剂量
的 x ous倍 o即人的等效剂量和 w倍等效剂量 o成人
按 ys ®ª计l灌服中药混悬液 ∀vu §后处死动物 o处
死前 tu «禁食不禁水 o异戊巴比妥钠麻醉动物 o腹
主动脉取血 o迅速剥离胸腹主动脉 ∀血清于 p us ε
保存 o主动脉立即放于液氮中备检 °• ‘„ ∀
212 观察指标及检测方法
21211 血清 ≤°2t 含量 采用双抗夹心 „…≤2
∞Œ≥„法测定 o严格按照试剂盒说明书中的操作步
骤进行 ∀
21212 主动脉 ≤°2t及过氧化物酶体增生物激活
受体2Χk°°„•2Χl °• ‘„ 水平检测 采用实时定量
• ×2°≤• 法 ∀按 ×µ¬½²¯ 试剂的使用操作步骤 o从约 {s
°ª大鼠主动脉中提取总 • ‘„ ∀根据 Αuys/ Αu{s的比
值及凝胶电泳检测总 • ‘„ 的纯度 ∀以总 • ‘„ t1x
Λª为逆转录反应模板 o采用随机引物 o按照反转录
试剂盒的操作说明在普通 °≤• 仪上进行逆转录 o合
成第一条¦⁄‘„链 ∀再以 u ˏ逆转录反应产物为模
板 o按照荧光实时定量 °≤• 试剂盒 ≥≠…• µ °µ¨°¬¬∞¬
פ´ א的说明 o在冰上配置 us ˏ的 °≤• 反应体系 o
各引物终浓度为 s1u °°²¯ #pt ∀各基因引物序列
为 }Β2¤¦·¬±kŠ¨ ±¨ …¤±® „¦¦¨¶¶¬²± ‘²1 ‘ svttwwl o正
义 } xχ2׊„≤„ŠŠ„׊≤„Š„„ŠŠ„Š„2vχ o反 义 } xχ2
ׄŠ„Š≤≤„≤≤„„×≤≤„≤„≤„2vχ o产物长度 tsw ¥³~
≤°2tkŠ¨ ±¨ …¤±® „¦¦¨¶¶¬²± ‘²1 ‘ svtxvsl o正义 }
xχ2׊≤„ŠŠ×≤×≤׊×≤„≤Š≤××≤2vχ o反义 }xχ2 ≤„Š≤≤2
Š„≤×≤„×׊ŠŠ„×≤„2vχ o产物长度 twv ¥³~°°„•2Χ
kŠ¨ ±¨ …¤±® „¦¦¨¶¶¬²± ‘²1 ‘ stvtuwl正义 }xχ2„׊2
Š„Š≤≤ׄ„Š××׊„Š××׊≤׊ 2vχ o反义 }xχ2 Š„×2
Š×≤≤×≤Š„׊ŠŠ≤××≤„≤2vχ o产物长度 tv{ ¥³∀实时
定量 °≤• 扩增条件 }|x ε 预变性 |s ¶后 o进行 |x ε
变性 x ¶ox| ε 退火 ts ¶ozu ε 延伸 tx ¶k此阶段采集
荧光信号l owx个循环 ∀目的基因表达丰度的表示
方法 }各样品基因的 ≤·值与其相应内参照 Β2¤¦·¬±基
因的 ≤·值之比来表示 ∀ ≤·值是各样品基因扩增的
荧光强度达到临界阈值所需要的循环数k≤·值l ∀
21213 荧光定量 °≤• 产物融解曲线及琼脂糖凝胶
电泳情况分析 各目的基因完成 wx个 °≤• 扩增循
环后进行 °≤• 产物融解曲线收集 ∀x ˏ°≤• 产物
与 t ˏ的 y ≅上样缓冲液混合后 o在 t1z h的琼脂糖
凝胶中电泳kzs ∂ oxs °¬±l分离 o溴化乙啶染色后用
˜∂Œ凝胶成像系统观察结果 ∀
21214 统计方法 计量资料以 cξ ? σ表示 o多样本
均数的两两比较采用单因素方差分析 o方差齐采用
≥⁄o方差不齐采用 פ°«¤±¨ χ¶ ×u 统计方法 o借助
≥°≥≥ ts1s统计软件进行 ∀
3 结果
311 一般状况
造模前 o各组动物状态好 o反应灵敏 o被毛光泽 ∀
实验过程中只有模型组大鼠死亡 v只 o其余各组均
无死亡情况 ∀
#vzut#
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∂²¯1vt oŒ¶¶∏¨ tx
„∏ª∏¶·oussy
312 对大鼠 ≤°2t血清蛋白量和主动脉 °• ‘„表
达的影响
从表 t 可以看出 o模型组 ≤°2t 血清含量和
°• ‘„表达均高于正常对照组k Π s1st , Π s1sxl ~
治疗各组与正常对照组相比无统计学意义 ∀参芪复
方低 !高剂量组 ≤°2t血清含量均低于模型组k Π
s1sxl ~参芪复方高剂量组 ≤°2t °• ‘„表达量低于
模型组k Π s1sxl o低剂量组与模型组相比有降低
趋势 o但无统计学差异 ∀各治疗组之间 ≤°2t血清
含量无差异 ~参芪复方高剂量组 °• ‘„表达量显著
低于雷米普利组k Π s1sxl ∀
表 t 参芪复方对模型大鼠 ≤°2t血清蛋白量和
主动脉 °• ‘„表达的影响kcξ ? σl
组别 ν
剂量
r°ª#®ªpt
血清 ≤°2t
rΛª#pt
主动脉 °• ‘„≤·值
之比 ≤°2trΒ2¤¦·¬±
正常对照 tt 2 wtt qxz ? zz qux t qv{ ? s quu
模型对照 { 2 xu| qt| ? {{ qttul t qtz ? s qtvtl
雷米普利 tt t wxv qst ? |{ qtu t quz ? s qtz
参芪复方 tt zus wwx qw| ? {v qsuvl t qvt ? s qut
tt u {{s wvs qvu ? yx qzsvl t qww ? s qtsv owl
注 }与正常对照组比tl Π  s qsx oul Π  s qst ~与模型对照组比
vl Π s qsx o与雷米普利比wl Π s qst
313 大鼠主动脉 ≤°2t °• ‘„实时定量 °≤• 产物
融解和电泳情况
主动脉 ≤°2t °• ‘„经过实时定量 • ×2°≤• 后 o
电泳图显示条带单一 o电泳条带在 tss ∗ uss ¥³∀显
示扩增产物纯净 o产物长度符合设计要求 o实时定量
• ×2°≤• 的 ≤·值准确k见图 tl ∀
图 t 各组大鼠主动脉 ≤°2t和内参照 Β2¤¦·¬± °• ‘„
电泳图
314 对大鼠主动脉 °°„•Χ基因 °• ‘„表达的影响
结果显示 o正常对照大鼠主动脉 °°„•Χ °• ‘„
表达较少 o模型对照和各治疗组表达明显升高k Π
s1stl ∀治疗后 o各治疗组与模型对照组比较升高更
明显 }雷米普利和参芪复方低剂量组 Π s1sx o与参
芪复方高剂量组 Π s1st ~治疗组组间比较无显著
性差异k表 ul ∀
表 u 参芪复方对大鼠主动脉 °°„•Χ °• ‘„
表达的影响kcξ ? σl
组别 ν
剂量
r°ª#®ªpt#§pt
≤·值之比
°°„•ΧrΒ2¤¦·¬±
正常对照 tt p t1xx ? s1s|
模型对照 { p t1wv ? s1tvtl
雷米普利 tt t t1vv ? s1s|t oul
参芪复方 tt zus t1vs ? s1tut oul
tt u {{s t1uy ? s1s|t ovl
注 }与正常对照比较tl Π  s1st ~与模型对照比较ul Π  s1sx o
vl Π s1st
315 大鼠主动脉 °°„•Χ °• ‘„实时定量 °≤• 扩增
产物融解和电泳情况
实时定量 • ×2°≤• 扩增产物 o电泳条带单一 o片
断长度符合设计要求 o显示 ≤·值可靠 !准确k见图
ul ∀
图 u 各组大鼠主动脉 °°„•Χ和内参照 Β2¤¦·¬± °• ‘„
实时定量 °≤• 扩增产物电泳图
4 讨论
×u⁄ 的炎症发病学说是近年来心血管领域的
重大进展 o公认的在 ×u⁄ 发病机制中占主要地位
的胰岛素抵抗也属于慢性炎症状态≈u  ∀具有 ×u⁄
疾病基础和 „≥病理改变的 ⁄ 大血管并发症是一
种低度炎症性疾病无疑≈v ow  ∀在低度炎症中 o≤°2t
和 °°„•Χ是比较公认的致炎和抗炎指标 o且在 ⁄
大血管并发症中占有举足轻重的地位 ∀
ŠŽ大鼠是国际上公认的自发性 ×u⁄ 模型 o比
目前普遍使用的饮食诱导胰岛素抵抗加化学损伤胰
岛 Β细胞的动物模型更符合 ×u⁄ 的病理生理 o还
具有个体性状差异小 o血糖值稳定 o得到的统计学数
据更可靠等优点 ∀本实验慢性给予 ŠŽ大鼠 ‘’≥抑
制剂加饲高脂饮食 o成功复制出了 ⁄ 早期大血管
病变的动物模型 o与大量文献报道慢性给予 Λ2Ν
„∞ w周时间可以在大鼠体内复制出 „≥的报道基
本一致≈w2y  ∀
#wzut#
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∂²¯1vt oŒ¶¶∏¨ tx
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在 ×u⁄ 发生和发展的整个过程中 o≤°2t均
起到了重要作用 ∀早期 o≤°2t吸引外周血单核细
胞向内皮下间隙迁移 ~中期 o≤°2t诱导单核细胞清
道夫受体表达 o使单核细胞吞食过多修饰的低密度
脂蛋白 o促进单核细胞向泡沫细胞转化≈z  o而泡沫细
胞形成是 „≥形成的标志 ∀后期 o≤°2t导致动脉粥
样硬化纤维斑块逐渐增大≈{  ∀本实验表明 o主动脉
粥样硬化病变多的模型组表达 ≤°2t °• ‘„和血清
中 ≤°2t均显著增高 o与文献报道一致 ∀参芪复方
抑制 ≤°2t °• ‘„ 表达 o降低 ≤°2t 血清水平 ∀
°°„•Χ是一种配体激活型核转录因子 o除在脂肪组
织高表达外 o血管壁的组成细胞和动脉粥样硬化病
变中也有表达≈|2tt  ∀本研究也基本证实了这点 o不
论正常对照还是 Λ2Ν2„∞处理的 ŠŽ大鼠主动脉
血管壁均有 °°„•Χ表达 ∀ °°„•Χ通过对抗主要促
炎转录因子 ) ) ) 转录活化蛋白2t o‘ƒ2……及信号传
导与转录活化因子k≥ׄ×l的活性 o抑制多种促炎因
子表达≈tu  ∀°°„•Χ在动脉粥样硬化病变中的表达
增加或激活 o具有抗炎和抗动脉粥样硬化作
用≈tv otw  ∀本研究显示 o正常大鼠主动脉 °°„•Χ °•2
‘„表达量很少 o×u⁄ 大血管病变模型表达量显著
升高 o与文献报道一致≈tx  o考虑是机体自我保护机
制在起作用 ∀参芪复方具有抑制主动脉 ≤°2t °•2
‘„及蛋白表达 o上调主动脉 °°„•Χ表达的作用 o可
能是通过以上环节 o通过抗炎机制发挥其抗 ×u⁄
大血管病变作用的 ∀
≈参考文献 
≈t  谢毅强 o李军茹 o张红敏 o等 1 参芪复方治疗 u型糖尿病胰岛
素抵抗的临床研究 1 中华实用中西医杂志 oussx ot{ktzl }
{ww1
≈u  °¬¦®∏³≤ o ¤·²¦®  …q„¦·¬√¤·¬²± ²©·«¨ ¬±±¤·¨¬°°∏±¨ ¶¼¶·¨° ¤¶
¤³µ¨§¬¦·²µ²© ¦¤µ§¬²√¤¶¦∏¯¤µ°²µ·¤¯¬·¼ ¬± ×¼³¨ u §¬¤¥¨·¨¶ °¨¯ ¬¯·∏¶q
⁄¬¤¥¨· §¨oussv ousk|l }zuv q
≈v  ‘¨¶·² • • q ≤²µµ¨ ¤¯·¬²± ¥¨·º¨¨ ± ¦¤µ§¬²√¤¶¦∏¯¤µ§¬¶¨¤¶¨ ¤±§§¬¤¥¨·¨¶
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°¨ ¯¯¬·∏¶¤±§¬±¶∏¯¬±µ¨¶¬¶·¤±¦¨ }° ¦¨«¤±¬¶·¬¦¯¬±®¶¤±§·«¨µ¤³¨ ∏·¬¦·¤µ2
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³µ²·¨¬±2t ¬±§∏¦¨¶¶¦¤√¨ ±ª¨µµ¨¦¨³·²µ ¬¨³µ¨¶¶¬²± ¤±§ °²±²¦¼·¨ §¬©©¨µ2
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第 vt卷第 tx期
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中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
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(t1 ∆επαρτµεντ οφ Ιντεγρατεδ Τραδιτιοναλ Χηινεσε ανδ Ωεστερν Μεδιχινε , Ωεστ Χηινα Ηοσπιταλ, Σιχηυαν Υνιϖερσιτψ, Χηενγδυ ytsswt , Χηινα ;
u1 ∆επαρτµεντ οφ Νυτριτιον ανδ Φοοδ Ηψγιενε , Ωεστ Χηινα Σχηοολ οφ Πυβλιχ Ηεαλτη , Σιχηυαν Υνιϖερσιτψ, Χηενγδυ ytsswt , Χηινα ;
v1 Χηενγδυ Υνιϖερσιτψ οφ Τραδιτιοναλ Χηινεσε Μεδιχινε , Χηενγδυ ytsszx , Χηινα)
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≈责任编辑 古云侠 
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( Νινγβο Ινστιτυτε οφ Τεχηνολογψ, Ζηεϕιανγ Υνιϖερσιτψ, Νινγβο vtxtss , Χηινα)
[ Αβστραχτ] Οβϕεχτιϖε : ײ ¶·∏§¼ ·«¨ ©¨ ¤¶¬¥¬¯¬·¼ ²©¶∏³¨µ¦µ¬·¬¦¤¯ ©¯∏¬§ ¬¨·µ¤¦·¬²± k≥ƒ∞l ©²µ¤µ¦·¬¬± ©µ²° ·«¨ ©µ∏¬·¶²© Αρχτιυµ λαππα q
Μετηοδ : ׫¨ ¬¨·µ¤¦·¶º µ¨¨ ¤±¤¯¼½¨ §¥¼ ‹°≤ o²³·¬°∏° ¬¨·µ¤¦·¬²±¦²±§¬·¬²±¶º µ¨¨ ¶·∏§¬¨§¥¼ ²µ·«²ª²±¤¯ ·¨¶·¶qΡεσυλτ : ׫¨ ²³·¬°¤¯ ¬¨·µ¤¦·¬²±
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[ Κεψ ωορδσ] Αρχτιυµ λαππα ~¤µ¦·¬¬±~¶∏³¨µ¦µ¬·¬¦¤¯ ©¯∏¬§ ¬¨·µ¤¦·¬²±~²µ·«²ª²±¤¯ ¬¨³¨µ¬° ±¨·¤¯ §¨¶¬ª±~ ‹°≤
≈责任编辑 鲍 雷 
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第 vt卷第 tx期
ussy年 {月
中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
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