全 文 ：·研究论文·
利用等位基因特异 ＰＣＲ鉴别虎掌南星
及其部分混淆品
崔光红１，唐晓晶１，黄璐琦１，钱忠直２
（１．中国中医科学院 中药研究所，北京 １００７００；２．国家药典委员会，北京 １０００６１）
［摘要］ 目的：建立中药材虎掌南星的分子鉴定方法，为天南星药材质量控制提供依据。方法：ＧｅｎＢａｎｋ中下
载半夏属、天南星属、犁头尖属物种的叶绿体ｒｐｌ２０基因序列，利用ＤＮＡＭＡＮ进行比对分析，发现半夏属和虎掌南
星的ＳＮＰ位点，并设计鉴别引物 Ｐｔｒｐｌ９４Ｆ，Ｐｔｒｐｌ７０８Ｒ和 Ｐｐｒｐｌ１４８Ｆ，Ｐｐｒｐｌ４８４Ｒ，采用等位基因特异 ＰＣＲ方法对虎掌
南星、半夏、水半夏３个物种的１０个样品进行扩增。结果：引物Ｐｐｒｐｌ１４８Ｆ和Ｐｐｒｐｌ４８４Ｒ仅对虎掌南星扩增３３３ｂｐ
条带，半夏、水半夏均无扩增，能准确鉴别虎掌南星。引物Ｐｔｒｐｌ９４Ｆ和Ｐｔｒｐｌ７０８Ｒ对半夏、虎掌南星均扩增６１１ｂｐ条
带，水半夏无扩增。结论：本实验建立的等位基因特异ＰＣＲ方法能准确区别出虎掌南星和半夏、水半夏，为虎掌南
星及半夏的正确用药提供了保障。
［关键词］ 虎掌南星；半夏；水半夏；等位基因特异ＰＣＲ
［中图分类号］Ｒ２８２．５ ［文献标识码］Ａ ［文章编号］１００１５３０２（２００８）１０１１０９０３
［收稿日期］ ２００７０８３１
［基金项目］ 国家重点基础研究发展计划（２００６ＣＢ５０４７００）
［通讯作者］ 黄璐琦，Ｔｅｌ：（０１０）６４０１４４１１２９５５，Ｅｍａｉｌ：
ｈｕａｎｇｌｕｑｉ＠２６３．ｎｅｔ
虎掌南星是天南星科半夏属植物掌叶半夏
ＰｉｎｅｌｉａｐｅｄａｔｉｓｅｃｔａＳｃｈｏｔ的干燥块茎，又称滇半夏、虎
掌、独角莲，具有祛风定惊、化痰散结的功能［１］。在河
南、陕西、山东、江苏等地均有大量栽培，是中药天南
星的主要来源之一［２，３］。天南星药材的来源复杂，种
类繁多，除虎掌南星及药典收载的天南星属的３种植
物［４］外，还有天南星属、犁头尖属以及半夏属（滴水珠
Ｐ．ｃｏｒｄａｔａ、盾叶半夏Ｐ．ｐｅｌｔａｔａ等）多种植物的块茎
作药用，个别地区还误用魔芋属植物的块茎［２］。同
时，由于半夏Ｐ．ｔｅｒｎａｔａ（Ｔｈｕｎｂ．）Ｂｒｅｉｔ．野生资源的急
剧减少以及栽培品种的变异，使得虎掌极易冒充半夏
出售［５］。因此，从药材来源上准确地鉴别虎掌南星对
于保证天南星和半夏的临床使用都具有重要的意义。
目前，已有薄层色谱鉴别［６］、制南星ＨＰＬＣ指纹图谱
的研究［７］。随着分子标记技术在中药材鉴定中的应
用，曹晖等应用１８ＳｒＲＮＡ基因测序技术已能正确地
鉴别出虎掌和半夏［８］。为了克服基因测序技术高成
本的缺陷，本实验通过寻找半夏属、天南星属、犁头尖
属叶绿体ｒｐｌ２０基因中相关的单核苷酸多态性位点
设计了虎掌南星的特异引物，利用等位基因特异ＰＣＲ
方法（ａｌｅｌｉｃｓｐｅｃｉｆｉｃｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ，ＡＳ
ＰＣＲ）［９］得到了虎掌南星特异的分子标记，为半夏、虎
掌南星的准确入药提供保障。
１ 材料
样品包括３批虎掌南星、５批不同产地半夏药
材及２批水半夏（表１）。所有样品均经中国中医科
学院中药研究所何希荣主管技师以及中国药品生物
制品检定所张继研究员鉴定。样品存放于中国中医
科学院中药研究所标本室。
２ 方法
２．１ 药材ＤＮＡ的提取 采用改进的ＣＴＡＢ法提取
药材总ＤＮＡ［１０］。
２．２ 虎掌南星叶绿体 ｒｐｌ２０基因中 ＳＮＰ的发现和
鉴别引物的设计 ＧｅｎＢａｎｋ下载半夏属虎掌南星
（ＡＹ２７９１７０）、半 夏 （ＡＹ２４８９３１）、滴 水 珠
（ＡＹ２４８９３０）、盾叶半夏（ＡＹ２７９１７１）以及天南星属
黄苞南星Ａｒｉｓａｅｍａｆｌａｖｕｍ（ＡＹ３８８６２０）、犁头尖属独
角莲Ｔｙｐｈｏｎｉｕｍｇｉｇａｎｔｅｕｍ（ＡＹ２４８９３８）、马蹄犁头尖
Ｔ．ｔｒｉｌｏｂａｔｕｍ（ＡＹ２４８９４１）的叶绿体 ｒｐｌ２０基因序
列，经 ＤＮＡＭＡＮ软件比对分析，发现虎掌南星１６７
ｂｐ处为Ｇ，其他种均为 Ｔ；４６６ｂｐ处虎掌为 Ｔ，其他
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第３３卷第１０期
２００８年５月
中 国 中 药 杂 志
ＣｈｉｎａＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭａｔｅｒｉａＭｅｄｉｃａ
Ｖｏｌ．３３，Ｉｓｓｕｅ １０
Ｍａｙ，２００８
表１ 虎掌南星及半夏药材产地、收集人和收集时间
Ｎｏ． 药材 原植物 产地 收集人 收集时间
１ 半夏 半夏 Ｐｉｎｅｌｉａｔｅｒｎａｔａ 四川 马小军 ２００３１２
２ 半夏 半夏 Ｐ．ｔｅｒｎａｔａ 江苏 秦彩玲 ２００３１２
３ 半夏 半夏 Ｐ．ｔｅｒｎａｔａ 山东 马小军 ２００３１２
４ 半夏 半夏 Ｐ．ｔｅｒｎａｔａ 云南 秦彩玲 ２００３１２
５ 半夏 半夏 Ｐ．ｔｅｒｎａｔａ 安徽 秦彩玲 ２００３１２
６ 虎掌南星 掌叶半夏 Ｐ．ｐｅｄａｔｉｓｅｃｔａ 安徽 肖苏萍 ２００４０９
７ 虎掌南星 掌叶半夏 Ｐ．ｐｅｄａｔｉｓｅｃｔａ 河北 赫 炎 ２００２１０
８ 虎掌南星 掌叶半夏 Ｐ．ｐｅｄａｔｉｓｅｃｔａ 陕西 崔光红 ２００４１２
９ 水半夏 鞭檐犁头尖 Ｔｙｐｈｏｎｉｕｍｆｌａｇｅｌｉｆｏｒｍｅ 广西玉林 魏建和 ２００４１０
１０ 水半夏 鞭檐犁头尖 Ｔ．ｆｌａｇｅｌｉｆｏｒｍｅ 河北安国 魏建和 ２００４１０
种均为Ａ。同时，半夏属与天南星属、犁头尖属存在
９个属间ＳＮＰ位点，如半夏属１１９，１２０ｂｐ处均为Ａ，
Ｇ，而天南星属和犁头尖属的均为 Ｔ，Ａ；７０８ｂｐ半夏
属为Ｇ，犁头尖属为 Ｃ（图１）。根据上述 ＳＮＰ位点
设计虎掌南星鉴别引物 Ｐｐｒｐｌ１４８Ｆ和 Ｐｐｒｐｌ４８４Ｒ以
及半夏属鉴别引物 Ｐｔｒｐｌ９４Ｆ和 Ｐｔｒｐｌ７０８Ｒ，原则为将
ＳＮＰ位点置于引物的３′末端，其他要求与一般引物
设计一致（表２）。 图１ 叶绿体ｒｐｌ２０基因中ＳＮＰ位点及引物设计情况
表２ 引物序列、目的产物长度及ＰＣＲ循环参数
名称 序列 产物长度／ｂｐ ＰＣＲ循环参数
Ｐｐｒｐｌ１４８Ｆ ５′ＴＴＣＣＣＡＡＣＣＡＣＡＡＴＴＴＴＴＧ３′ ３３３ ９４℃３０ｓ，６５℃１ｍｉｎ
Ｐｐｒｐｌ４８４Ｒ ５′ＡＴＧＣＣＧＴＣＡＣＴＧＴＡＴＧＧＡＡ３′
Ｐｔｒｐｌ９４Ｆ ５′ＣＡＧＡＴＴＡＴＴＣＣＧＡＴＡＴＡＴＡＡＡＡＴＡＡＧ３′ ６１１ ９４℃３０ｓ，６２℃１ｍｉｎ
Ｐｔｒｐｌ７０８Ｒ ５′ＡＡＧＡＴＧＴＡＴＣＡＴＡＴＡＣＣＴＴＡＣＣＴＣ３′
ｔｒｎＬ（ＵＡＡ） ５′ＧＧＴＴＣＡＡＧＴＣＣＣＴＣＴＡＴＣＣＣ３′ ４０２ ９４℃３０ｓ，５５℃３０ｓ，７２℃１ｍｉｎ
ｔｒｎＦ（ＧＡＡ） ５′ＡＴＴＴＧＡＡＣＴＧＧＴＧＡＣＡＣＧＡＧ３′
２．３ ＰＣＲ扩增 ＰＣＲ反应体系为２５μＬ，其中１０
ｍｍｏｌ·Ｌ－１ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８３），５０ｍｍｏｌ·Ｌ－１ＫＣｌ，
Ｍｇ２＋１５ｍｍｏｌ·Ｌ－１，ｄＮＴＰ各０１５μｍｏｌ·Ｌ－１，Ｔａｑ
１Ｕ（ＴａｋａｒａＥｘＴａｑ），引物各０１５μｍｏｌ·Ｌ－１，模板
ＤＮＡ５０ｎｇ。扩增在ＡＢＩ９７００上进行，程序为９４℃
预变性５ｍｉｎ，然后不同的引物按照各自的程序进行
４０个循环后（表２），７２℃延伸５ｍｉｎ。同时，用叶绿
体ｔｒｎＬ和ｔｒｎＦ基因间隔区通用引物对所有样品进
行扩增，以扩增条带的有无检测模板ＤＮＡ质量。取
５μＬ反应产物在含 ＥＢ的 １５％琼脂糖凝胶上电
泳，在ＳＹＮＧＥＮＥ型凝胶成像系统下观察、拍照。
３ 结果
３．１ 模板ＤＮＡ质量检测结果 以提取的不同产地
虎掌南星、半夏、水半夏药材ＤＮＡ为模板，用通用引
物ｔｒｎＬ（ＵＡＡ）和 ｔｒｎＦ（ＧＡＡ）进行扩增，结果均得
到４２０ｂｐ左右的片段（图２），表明所用模板质量符
合下游实验要求。
３．２ 等位基因特异 ＰＣＲ扩增结果 引物 Ｐｐｒ
ｐｌ１４８Ｆ和Ｐｐｒｐｌ４８４Ｒ仅对虎掌南星扩增 ３３３ｂｐ条
带，半夏属半夏、犁头尖属水半夏均无扩增（图２），
表明该引物能特异性检出虎掌南星，可作为其分子
标记。
引物Ｐｔｒｐｌ９４Ｆ和Ｐｔｒｐｌ７０８Ｒ对半夏属的半夏、虎
掌南星扩增６１１ｂｐ的条带，犁头尖属水半夏无扩增
（图２），表明该引物能特异性的检出半夏属植物，但
不能鉴别半夏及虎掌南星。
４ 讨论
ＧｅｎＢａｎｋ中注册的半夏属、犁头尖属、天南星属
植物ＤＮＡ序列信息主要为叶绿体 ＮＡＤＨ基因、ｒｐｌ
２０基因、ｔｒｎＬ内含子和 ｔｒｎＬｔｒｎＦ非编码区、核糖
体５８ＳｒＲＮＡ基因及 ＩＴＳ间隔区。经过比对分析，
发现只有ｒｐｌ２０基因具有虎掌南星的单核苷酸多态
性位点，使得通过等位基因特异ＰＣＲ能迅速快捷的
鉴别其真伪。但在该序列中却未能找到半夏的特异
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图２ 虎掌南星及其混淆品ＰＣＲ扩增电泳图谱
Ａ．通用引物；Ｂ．虎掌南星鉴别引物；Ｃ．半夏属鉴别引物
Ｍ．ＤＮＡ分子质量标准；Ｎ．阴性对照
位点，使用本实验设计的半夏属鉴别引物，能区分水
半夏等半夏属以外的混淆品，无法对半夏属内虎掌
南星、滴水珠、盾叶半夏等进行区分。而ＩＴＳ序列中
则能找到半夏特异的位点，从而直接对半夏进行等
位基因特异 ＰＣＲ鉴别［１１］，表明植物基因组因其结
构和功能上的差异，进化速率也有所不同，如何选择
在种内高度保守，而种间存在差异的单核苷酸多态
性位点是中药材分子鉴定成功的关键。
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ＡｕｔｈｅｎｔｉｃａｔｉｏｎｏｆＰｉｎｅｌｉａｐｅｄａｔｉｓｅｃｔａａｎｄｔｈｅｉｒａｄｕｌｔｅｒａｎｔｓｂｙＡＳＰＣＲ
ＣＵＩＧｕａｎｇｈｏｎｇ１，ＴＡＮＧＸｉａｏｊｉｎｇ１，ＨＵＡＮＧＬｕｑｉ１，ＱＩＡＮＺｈｏｎｇｚｈｉ２
（１．ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭａｔｅｒｉａＭｅｄｉｃａ，ＡｃａｄｅｍｙｏｆＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１００７００，Ｃｈｉｎａ；
２．ＰｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａＣｏｍｍｉｓｉｏｎｏｆＰｅｏｐｌｅＲｅｐｕｂｌｉｃｏｆＣｈｉｎａ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００６１，Ｃｈｉｎａ）
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＴｏｅｓｔａｂｌｉｓｈａｍｏｌｅｃｕｌａｒｍｅｔｈｏｄｆｏｒｔｈｅａｕｔｈｅｎｔｉｃａｔｉｏｎｏｆＰｉｎｅｌｉａｐｅｄａｔｉｓｅｃｔａａｎｄｉｔｓａｄｕｌｔｅｒａｎｔｓ．Ｍｅｔｈ
ｏｄ：ＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆｓｏｍｅｓｐｅｃｉｅｓｆｒｏｍＰ．ｔｅｎｏｒｅ，ＴｙｐｈｏｎｉｕｍａｎｄＡｒｉｓａｅｍａｗｅｒｅｄｏｗｎｌｏａｄｅｄｆｒｏｍＧｅｎＢａｎｋ，ｔｈｅｓｅｑｕｅｎｃｅｓｗｅｒｅａ
ｌｉｇｎｅｄｕｓｉｎｇＤＮＡＭＡＮ．ＡｌｅｌｅｓｐｅｃｉｆｉｃｐｒｉｍｅｒｓｆｏｒＰ．ｐｅｄａｔｉｓｅｃｔａａｎｄＰ．ｔｅｎｏｒｅｗｅｒｅｄｅｓｉｇｎｅｄａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅｉｒＳＮＰｓｉｎｒｐｌ２０ｓｅ
ｑｕｅｎｃｅ．Ｔｈｅｄｅｓｉｇｎｅｄｐｒｉｍｅｒｓｗｅｒｅｕｓｅｄｔｏａｍｐｌｉｆｙ１０ｓａｍｐｌｅｓｏｆＰ．ｐｅｄａｔｉｓｅｃｔａ，Ｐ．ｔｅｒｎａｔａａｎｄＴ．ｆｌａｇｅｌｉｆｏｒｍｅ．Ｒｅｓｕｌｔ：Ａ３５１ｂｐ
ｂａｎｄｗａｓａｍｐｌｉｆｉｅｄｆｒｏｍＰ．ｐｅｄａｔｉｓｅｃｔａｂｕｔｎｏｔｆｏｒｍＰ．ｔｅｒｎａｔａａｎｄＴ．ｆｌａｇｅｌｉｆｏｒｍｅｂｙｐｒｉｍｅｒＰｐｒｐｌ１４９ＦａｎｄＰｐｒｐｌ４８４Ｒ．Ａ６３０ｂｐ
ｂａｎｄｗａｓａｍｐｌｉｆｉｅｄｆｒｏｍＰ．ｔｅｒｎａｔｅａｎｄＰ．ｐｅｄａｔｉｓｅｃｔａｂｕｔｎｏｔｆｒｏｍＴ．ｆｌａｇｅｌｉｆｏｒｍｅｂｙｐｒｉｍｅｒＰｔｒｐｌ９４ＦａｎｄＰｔｒｐｌ６９９Ｒ．Ｃｏｎｃｌｕｔｉｏｎ：
ＡＳＰＣＲｈａｓｔｈｅａｄｖａｎｔａｇｅｓｏｆｈｉｇｈｌｙｓｐｅｃｉｆｉｃａｎｄｇｏｏｄｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｉｌｉｔｙ，ｂｙｗｈｉｃｈＰ．ｐｅｄａｔｉｓｅｃｔａｃａｎｂｅｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｆｒｏｍｐａｒｔｏｆｉｔｓａｄｕｌ
ｔｅｒａｎｔｓｑｕｉｃｋｌｙ．Ｉｔｉｓａｐｏｔｅｎｔｉａｌｍｅｔｈｏｄｔｏｂｅｕｓｅｄｉｎｔｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｏｔｈｅｒｍａｔｅｒｉａｍｅｄｉｃａ．
［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］ Ｐｉｎｅｌｉａｐｅｄａｔｉｓｅｃｔａ；Ｐｉｎｅｌｉａｔｅｒｎａｔａ；Ｔｙｐｈｏｎｉｕｍｆｌａｇｅｌｉｆｏｒｍｅ；ＡＳＰＣＲ
［责任编辑 张宁宁］
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