全 文 ：#研究论文 #
丹参功能基因组学研究 ¶
) ) ) 丹参金属硫蛋白  ×2u基因的分析
崔光红 t o毛 莹 tou o黄璐琦 t3 o袁 媛 t o王学勇 t
kt1中国中医科学院 中药研究所 o北京 tsszss~
u1佳木斯大学 化学与药学院 o黑龙江 佳木斯 txwsszl
≈摘要   目的 }获得丹参金属硫蛋白基因序列 o并进行生物信息学分析和初步的表达特性研究 ∀方法 }利用
¦⁄‘„芯片技术 o从不同时期毛状根中获得目的基因 ∀利用 …„≥×进行序列比对 o’• ƒ ©¬±§¨ µ寻找开放读码框 o°µ²2
¶¬·¨分析蛋白质的基本结构域 ∀用半定量 • ×2°≤• 检测其在丹参组培苗根 !茎 !叶中的表达情况 ∀结果 }得到 u个
 ×基因全长序列 o分别编码 {s和 z|个氨基酸 o具有 ×¼³¨ u型金属硫蛋白的典型特征 o分别命名为 ≥° ×2u¤和
≥° ×2u¥o两者具有 zt1uxh的同源性 ∀半定量 • ×2°≤• 表明 o ×基因在丹参组培苗根 !茎 !叶中均有转录水平的表
达 o叶中表达量高于根和茎 ∀结论 }首次得到丹参金属硫蛋白基因 o为其功能研究提供了基础 ∀
≈关键词   丹参 ~金属硫蛋白 ~表达
≈中图分类号   ≥ xyz ≈文献标识码   „ ≈文章编号   tsst2xvsukusszltw2tv|v2sv
≈收稿日期   ussy2tu2t|
≈基金项目   国家重点基础研究发展计划 kussy≤…xswzssl~国
家高科技研究发展计划 kussv„„uuswsl
≈通讯作者   3 黄璐琦 oר¯}kstslywstwwtt2u|xx
金属硫蛋白 k° ·¨¤¯ ²¯·«¬²± ¬¨±o ×l是一类富含
半胱氨酸 !结合重金属的低相对分子质量蛋白质 o广
泛分布于生物界 ∀很多试验证明 o ×在提高植物
重金属抗性 !解除对铜 !锌 !铅 !银 !汞 !镉等重金属毒
性方面具有重要的作用 ∀近年来从植物中克隆到许
多编码金属硫蛋白的基因 o并在研究基因表达模式 !
组织表达特异性以及基因结构 o如启动子 !内含子在
染色体上的定位等方面取得了一定进展 ≈t  o但在药
用植物方面较少见到关于金属硫蛋白的报道 ∀通过
前文 ¦⁄‘„芯片杂交试验 ≈uov  o得到 u个丹参金属硫
蛋白的全长 ¦⁄‘„序列 o对其进行详细的生物信息
学和在丹参组培苗根 !茎 !叶中的表达分析 o为进一
步研究金属硫蛋白在丹参中的功能和调控机制奠定
基础 ∀
1 材料和方法
111  ×基因的克隆 参考文献 ≈uov ∀
112  ×生物信息学分析 运用 …„≥×÷与 ‘≤…Œ
的 ‘• 数据库进行同源性比对 o并对不同物种来源
的  ×基因进行多序列联配 ∀采用 ‘≤…Œ的开放读
码框寻找程序 k’• ƒ ©¬±§¨ µl确定该基因的开放读码
框 ∀ °µ²¶¬·¨软件在线分析该蛋白质的基本结构域 ∀
113  ×基因表达分析 采用半定量 • ×2°≤• 检测
 ×基因在丹参组培苗根 !茎 !叶中的表达情况 ∀取
ys §的丹参根 !茎 !叶 o按 ו ¬½²¯试剂盒 kŒ±√¬·µ²ª¨ ±
公司 l说明书操作提取总 • ‘„o取 t Λª• ‘„模板按
• ×试剂盒 kפ®¤µ¤公司 l说明书反转录得到 ¦⁄‘„∀
 × 引物 }  ×2t} xχ2׊×≤×׊≤׊≤×≤׊Š„„„2vχo
 ×2usv}xχ2Š≤„≤×׊≤„≤≤≤Š××≤×≤ 2vχo扩增  ×编
码区 uut ¥³片段 ~内参 ¤¦·¬±引物根据 ‘≤…Œ网站上
公布的丹参 ¤¦·¬±编码区 °• ‘„ 序列 k¤¦¦¨¶¶¬²±
±∏°¥¨ µ}⁄±uwvzsul设计 o„t}xχ2≤׊Š≤×ׄ≤„××2
Š≤××׊Š2vχo „u}xχ2„ŠŠ„„≤≤„≤≤Š„×≤≤„Š„≤„2
vχo扩增 ¤¦·¬±编码区 wsz ¥³的片段 ∀反应体系为 }u
ˏ¦⁄‘„产物 ou ˏts ≅ ∞¬…∏©©¨µot ˏ§‘×°os1x
ˏ引物 os1v ˏ∞¬×¤´ 酶 o终体积为 us ˏ∀反应
条件为 }|w ε 预变性 x °¬±o然后进行 uz个循环 }|w
ε vs ¶oxw ε vs ¶ozu ε t °¬±o循环结束后 zu ε 延
伸 x °¬±∀取 x ˏ反应产物在含 ∞…的 t1xh琼脂
糖凝胶上电泳 o用 ≥≠‘Š∞‘∞型凝胶成像系统照像 o
以 uut ¥³和 wsz ¥³条带扫描峰下面积之比作为  ×
基因的相对表达量 ∀试验重复 v次 ∀
2 结果
#v|vt#
第 vu卷第 tw期
ussz年 z月
中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλοφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
∂ ²¯qvuo Œ¶¶∏¨ tw
∏¯¼o ussz
211 基因全长 ¦⁄‘„的获得及序列分析 通过 ¦⁄2
‘„芯片杂交 !差异基因测序及 …„≥×比对分析 o有
u个 ∏±¬ª¨ ± k¨¦«¬³st s¨yo¦«¬³u|«szl被注释为  ×基
因 ∀ ¦«¬³st s¨y包含 z条 ∞≥×o均表现为 ysrvs §下
调基因 ~¦«¬³u|«sz包含 u条 ∞≥×o其中一条为 ysrvs
§下调基因 o另一条为 wxrvs §下调基因 ∀ u个  ×
基因 ¦⁄‘„ 序列分别为 ysv ¥³和 yxy ¥³o命名
≥° ×2u¤和 ≥° ×2u¥∀通过 ’• ƒ ƒ¬±§¨ µk«·³}rr
ººº1±¦¥¬1± °¯1±¬«1ª²√rª²µ©rª²µ©1«·° l¯寻找上述 u
个基因的开放读码框 o结果 ≥° ×2u¤在 zu ∗ vtw ¥³
有 t个 uwv ¥³的开放读码框 o推断编码 {s个氨基
酸 k图 tl∀ ≥° ×2u¥在 yw ∗ vsv ¥³有 uws ¥³的开
放读码框 o推断编码 z|个氨基酸 k图 ul∀由 ⁄‘„2
 „‘软件推算 ≥° ×2u¤编码蛋白的相对分子质量
为 {1sv ≅ tsv o等电点为 v1s||∀ ≥° ×2u¥编码蛋白
的相对分子质量为 z1{y ≅ tsv o等电点为 w1wx∀
图 t 丹参 ≥° ×2u¤¦⁄‘„及其推导的氨基酸序列
图 u 丹参 ≥° ×2u¥¦⁄‘„及其推导的氨基酸序列
通过 °µ²¶¬·¨数据库 k«·³}rr∏¶1 ¬¨³¤¶¼1²µªr³µ²¶2
¬·¨rl分析丹参  ×2u蛋白的结构位点 o发现在 ≥° ·2
u¤和 ≥° ×2u¥的 ‘端有一个高度保守的序列
 ≥≤≤ŠŠ‘≤Š≤Šo≤端结构域有 v个 ≤¼¶2÷¤¤2≤¼¶单
元 o这是 ×¼³¨ u型金属硫蛋白的典型特性 ≈t  ∀
≥° ·2u¤含有 {个 ‘端酰基化位点 k‘2°¼µ¬¶·²¼¯¤·¬²±
¶¬·¨lot个 °Ž≤磷酸化位点 k³µ²·¨¬± ®¬±¤¶¨ ≤ ³«²¶2
³«²µ¼¯¤·¬²± ¶¬·¨lou个酪蛋白激酶 µ磷酸化位点 k≤¤2
¶¨¬± ®¬±¤¶¨ ŒŒ³«²¶³«²µ¼¯¤·¬²± ¶¬·¨l和 t个 ‘端糖基
化位点 k‘2ª¯¼¦²¶¼¯¤·¬²± ¶¬·¨l∀ ≥° ×2u¥含有 |个 ‘
端酰基化位点 k‘2°¼µ¬¶·²¼¯¤·¬²± ¶¬·¨lot个酪氨酸激
酶磷酸化位点 k·¼µ²¶¬±¨®¬±¤¶¨ ³«²¶³«²µ¼¯¤·¬²± ¶¬·¨lo
u个酪蛋白激酶 µ磷酸化位点 k≤¤¶¨¬± ®¬±¤¶¨ ŒŒ
³«²¶³«²µ¼¯¤·¬²± ¶¬·¨l∀
212 同源性分析 利用 ⁄‘„ „‘将 ≥° ×2u¤o
≥° ×2u¥与 ts个物种  ×蛋白进行多序列比对分
析 ∀结果 ≥° ×2u¤o ≥° ×2u¥两者的同源性为
zt1uxh o≥° ×2u¤与海榄 Αϖιχεννια µ αρινα的  ×2u
同源性最高为 zx1|h o≥° ×2u¥与海榄雌 Αϖιχεννια
γερµ ινανσ和西瓜 Χιτρυλλυσ λανατυσ的同源性最高 o均
为 zwh ∀两者均与茶树 Χαµ ελλια σινενσισ的同源性
最低 ∀所有  ×蛋白的 ‘末端 !≤末端均为高度保
守的区域 o也是富含 ≤的区域 k图 vl∀
图 v tt种植物  ×2u基因氨基酸序列比对
丹参 ≥°kΣαλϖια µ ιλτιορρηιζαlo海榄 „°kΑϖιχεννια µ αριναlo西瓜 ≤¯
kΧιτρυλλυσ λανατυσlo花生 „«kΑραχηισ ηψπογαεαlo欧洲山毛榉 ƒ¶
kΦαγυσσψλϖατιχαlo软木橡树 ±¶kΘυερχυσ συβερlo茶树 ≤¶kΧαµ ελλια
σινενσισlo沙梨 °³kΠψρυσ πψριφολιαlo大豆 Š° kΓλψχινε µ αξlo绿豆
∂ µkςιγνα ραδιατεlo香蒲 × k¯Τψπηα λατιφολιαl海榄雌 o„ªkΑϖιχεννια
γερµ ινανσl
213 金属硫蛋白在丹参植株不同部位中的表达
以引物  ×2t和  ×2usv对丹参组培苗根 !茎 !叶的
总 • ‘„进行半定量 • ×2°≤• 分析 ∀扩增产物进行
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第 vu卷第 tw期
ussz年 z月
中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλοφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
∂ ²¯qvuo Œ¶¶∏¨ tw
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电泳分析结果表明 o ×2u在丹参组培苗根 !茎 !叶中
均有转录水平的表达 k图 wl∀  ×2u与 ¤¦·¬±面积的
比值分别为根 s1zyo茎 s1zvo叶 s1|w o可见  ×2u基
因在叶中的表达量高于根和茎中的表达量 o这与番
茄 !拟南芥中已知 µ型基因的表达情况一致 ≈w  o暗
示  ×2u基因在转录水平的表达上具有一定的组织
特异性 ∀
图 w  ×2u在丹参植株不同部位中的表达情况
t1根 ~u1茎 ~v1叶
3 讨论
 ×是一类富含半胱氨酸的低相对分子质量蛋
白 o ×蛋白氨基酸序列的 ≤残基在数量和所在位
置高度保守 o具有 ≤ 2¬2≤ !≤ 2¬2¼2≤和 ≤ 2≤的序列结
构 ∀本研究所克隆的 u个  ×蛋白氨基酸的 ‘端和
≤端都具有  ×2u型的典型特征 ≈t  o属于  ×2u类型
基因 ∀
 ×在植物中普遍存在 o除具有解除重金属毒
性外 o还可能参与许多生理过程 o如生长发育 !胚胎
发生 !小孢子发生及衰老等过程 ∀研究  ×基因的
结构 !表达调控及其功能 o对于深入了解植物生理过
程及其调控具有十分重要的意义 ∀本实验所克隆的
u个  ×基因在丹参毛状根不同时期呈现差异表
达 o主要在 ysrvs §杂交结果中表现为下调 o说明其
在 vs §时的表达量显著高于 ys §时的表达量 o暗示
其可能在丹参毛状根的生长过程中发挥着重要的作
用 ∀随后将针对  ×基因的重金属解毒功能 o深入
研究铜 !锌元素对  ×基因的表达调控机制 o为其功
能研究提供基础 ∀
≈参考文献  
≈t  全先庆 o张洪涛 o单 雷 o等 1植物金属硫蛋白及其重金属解
毒机制研究进展 ≈ 1遗传 oussyou{kvl}vzx1
≈u  崔光红 o黄璐琦 o唐晓晶 o等 1丹参 ¦⁄‘„芯片构建及表达谱
的研究 ´ 1 丹参 ¦⁄‘„芯片的构建 ≈   1中国中药杂志 o
usszovuktul}ttvz1
≈v  崔光红 o黄璐琦 o邱德有 o等 1丹参 ¦⁄‘„芯片构建及表达谱
的研究 µ }毛状根不同时期基因表达谱分析 ≈ 1中国中药杂
志 ousszovuktvl}tuyz1
≈w  常团结 o朱 祯 1植物金属硫蛋白研究进展 k二 l}植物  ×基
因的表达特征及其功能 ≈ 1生物技术通报 oussuox}t1
Φυνχτιοναλγενοµ ιχσστυδιεσ οφ Σαλϖια µ ιλτιορρηιζα ¶ 1
αναλψζε οφ µ εταλλοτηιονειν(ΜΤ 2u) γενεσ
≤˜ŒŠ∏¤±ª2«²±ªt o  „’ ≠¬±ªtou o ‹ ˜„‘Š ∏2´ ¬t o ≠ ˜„‘¼∏¤±t o • „‘Š ÷ ∏¨ 2¼²±ªt
(t1 Ινστιτυτε οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα, Αχαδεµ ψ οφ Χηινεσε ΜεδιχαλΣχιενχεσ, Βειϕινγ tsszss, Χηινα;
u1 Χολλεγε οφ Χηεµ ιστρψ ανδ Πηαρµ αχψ, ϑιαµ υσι Υνιϖερσιτψ, ϑιαµ υσι txwssz, Χηινα)
[ Αβστραχτ] Οβϕεχτιϖε} ײ ¶·∏§¼ ·«¨ ° ·¨¤¯ ²¯·«¬²± ¬¨± ª¨ ± ¶¨²©Σαλϖια µ ιλτιορρηιζα ·«µ²∏ª« ¥¬²¬±©²µ°¤·¬¦¶¤±§¦«¤µ¤¦·¨µ¬½¤·¬²± ²©
·¬¶¶∏¨ ¬¨³µ¨¶¶¬²± ¬± µ¨ª¨ ± µ¨¤·¨§¶«²²·¶1 Μετηοδ}  ·¨¤¯ ²¯·«¬²± ¬¨± ª¨ ± ¶¨º µ¨¨ ²¥·¤¬± §¨¥¼ ¦⁄‘„ °¬¦µ²¤µµ¤¼ ¤±¤¯¼½¨ 1 …„≥× º¤¶∏¶¨§
©²µ¤¯¬ª±o ’• ƒ ©¬±§¨ µ¶²©·º¤µ¨ º¤¶∏¶¨§·²©¬±§²³¨ ± µ¨¤§¬±ª©µ¤° o¨ °µ²¶¬·¨§¤·¤¥¤¶¨ º¤¶∏¶¨§·²¤±¤¯¼½¨ ·«¨ ³µ²·¨¬±1 ¶¨°¬2´ ∏¤±·¬·¤·¬√¨
• ×2 °≤• ° ·¨«²§º¤¶∏¶¨§·² §¨ ·¨¦··«¨ ª¨ ±¨ ¬¨³µ¨¶¶¬²± ¯¨ √¨¯1 Ρ εσυλτ} ׺²° ·¨¤¯ ²¯·«¬²± ¬¨± ª¨ ± ¶¨º µ¨¨ ²¥·¤¬± §¨º«¬¦«º µ¨¨ ¦²±·¤¬± §¨
¤ §¨ §∏¦¨§¤°¬±² ¤¦¬§¶¨ ∏´¨ ±¦¨ ²©{s ¤±§z| µ¨¶¬§∏¨ ¶o ±¤° §¨¤¶≥° ×2u¤¤±§≥° ×2u¥o ·«¨ ¼ «¤§¤«²°²¯²ª¼ ²©zt1uxh 1 ≥ °¨¬2
∏´¤±·¬·¤·¬√¨ • ×2 °≤• ¬±§¬¦¤·¨§·«¤·° ·¨¤¯ ²¯·«¬²± ¬¨± ª¨ ± ¶¨º µ¨¨ ¬¨³µ¨¶¶¨§ ¬± ¤¯¯·¬¶¶∏¨ ¶¶∏¦« ¤¶µ²²·o ¶·¨° ¤±§ ¯¨ ¤©¬± µ¨ª¨ ± µ¨¤·¨§
¶«²²·¶o º«¬¯¨ ·«¨ ¬¨³µ¨¶¶¬²± ¯¨ √¨¯ º¤¶«¬ª«¨ µ¬± ¯¨ ¤©·«¤± ¬± µ²²·¤±§¶·¨°1Χονχλυσιον} Œ·º¤¶·«¨ ©¬µ¶··¬°¨·«¤·° ·¨¤¯ ²¯·«¬²± ¬¨± ª¨ ± ¶¨
º µ¨¨ ²¥·¤¬± §¨©µ²° Σ1 µ ιλτιορρηιζα1Œ·³µ²√¬§¨ ¶¤ª²²§¥¤¶¬¶©²µ©∏µ·«¨ µ©∏±¦·¬²±¤¯ ¶·∏§¼ ²©Σ1 µ ιλτιορρηιζα1
[ Κεψ ωορδσ] Σαλϖια µ ιλτιορρηιζα~ ° ·¨¤¯ ²¯·«¬²± ¬¨±
≈责任编辑 张宁宁  
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中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλοφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
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