全 文 ：·研究报告·
丹参毛状根不同培养时期有效成分的积累研究
吕冬梅１，袁　媛１，黄璐琦１，梁日欣１，邱德有２
（１．中国中医科学院 中药研究所，北京 １００７００；２．中国林业科学院，北京 １０００９１）
［收稿日期］　２００７０５１１
［基金项目］　国家重点基础研究发展计划（２００６ＣＢ５０４７００）；国
家高新技术研究发展计划（２００７ＡＡ０２Ｚ１０４）
［通讯作者］　黄璐琦，Ｔｅｌ：（０１０）６４０１４４１１２９５５，Ｅｍａｉｌ：ｈｕａｎｇｌｕｑｉ
＠２６３．ｎｅｔ
　　丹参是唇形科草本植物丹参 Ｓａｌｖｉａｍｉｌｔｉｏｒｈｉｚａ
Ｂｇｅ．的根及根茎，具有活血祛瘀，凉血清心，养血安
神的功效，是临床常用的中药。毛状根是农杆菌中
Ｒｉ质粒的一段ＤＮＡ嵌入植物基因组中并表达的结
果，许多植物受发根农杆菌感染后在受伤部位能长
出大量毛状根。由于其生长速度快，不需外源植物
激素，合成次生代谢物质能力强而且稳定。毛状根
作为一种转基因的器官，一种新的药用原料，越来越
被人们所重视。因此近年来许多学者对丹参毛状根
的诱导［１］、大规模培养［２］、有效成分［３］等方面进行
了研究，但对于丹参毛状根在不同培养时期有效成
分的积累研究还未见报道，本实验在以往研究的基
础上，对丹参毛状根不同培养时期的生长量及有效
成分丹参酮ⅡＡ和丹酚酸 Ｂ进行了含量测定，研究
毛状根在不同时期有效成分的积累，有利于进一步
研究丹参毛状根的其他性状，为进一步工业化生产
提供依据。
１　材料
发根农杆菌菌株 Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ１５８３４
诱导的河北丹参叶片形成的毛状根，由中国林业科
学院邱德有教授提供。
ＷａｔｅｒｓＡｌｉａｎｃｅ高效液相色谱仪，Ｗａｔｅｒｓ２９９６二
极管阵列检测器，Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ２００４ＭＰ电子分析天平，
丹参酮ⅡＡ对照品（中国药品生物制品检定所，批号
１１０７６６２００４１６），丹酚酸Ｂ对照品（中国药品生物制
品检定所，批号 １１１５６２２００５０４），甲醇（色谱纯，天
津四友生物医学技术有限公司），乙腈（色谱纯，
Ｆｉｓｈｅｒ公司），其余试剂为分析纯，高纯水为本所自
制。
２　方法与结果
２．１　不同培养时期丹参毛状根生长量分析
精密称取 １００ｇ丹参毛状根接种于 １００ｍＬ
６，７Ｖ固体培养基［１］上，２５℃培养箱中暗培养，分别
于２，４，６，８，１０周收获，每次收获７瓶，称鲜重，计算
增长倍数平均值，通过ＳＰＳＳ１３０软件，利用单因子
方差分析结果，见表１。
表１　丹参毛状根不同培养时期增长倍数（珋ｘ±ｓ，ｎ＝７）
培养时间 增长倍数
２周 ０６７±００８ａ
４周 ８９２±１３８ｂ
６周 １３４３±０４９ｂ
８周 １３８３±０３１ｂ
１０周 １３９５±０３５ｂ
　　注：增长倍数＝（收获量－接种量）／接种量，同１列标有不同字
母表示处理间有显著差异（Ｐ＜００５）
２．２　丹参酮ⅡＡ含量测定
［４］　色谱条件：Ｗａｔｅｒｓ
ＳｙｍｍｅｔｒｙＳｈｉｅｌｄＴＭＲＰ１８（３９ｍｍ×１５０ｍｍ，５μｍ）色
谱柱，柱温２５℃，流速１０ｍＬ·ｍｉｎ－１，甲醇水（７５
∶２５）为流动相，检测波长为２７０ｎｍ。
对照品溶液的制备：精密称取丹参酮ⅡＡ对照品
适量，加甲醇溶解并稀释制成８５６μｇ·ｍＬ－１的丹
参酮ⅡＡ对照品溶液；供试品溶液的制备：取毛状根
样品粉末约 ０１５ｇ，精密称定，精密加入甲醇 ２５
ｍＬ，称定质量，加热回流１ｈ，取出，放冷，再称定质
量，用甲醇补重，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
线性关系考察：取上述的丹参酮ⅡＡ，进样２，４，
８，１２，１６，２０μＬ，按２．２项下色谱条件测定峰面积。
以进样量为横坐标 Ｘ，峰面积为纵坐标 Ｙ绘制标准
曲线，回归方程 Ｙ＝６７７９２４０Ｘ－２０８０１，ｒ＝
０９９９９；线性范围００１７～０１７μｇ。
精密度试验：精密吸取供试品溶液５μＬ，连续
进样６次，测定峰面积，ＲＳＤ１１％。
稳定性试验：精密吸取供试品溶液５μＬ，分别
测定０，１，２，４，８，１６，２４ｈ的峰面积，ＲＳＤ１４％，说
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第３３卷第９期
２００８年５月
　　　　　　　　　
　　　 中 国 中 药 杂 志
ＣｈｉｎａＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭａｔｅｒｉａＭｅｄｉｃａ
　　　　　　　
Ｖｏｌ．３３，Ｉｓｓｕｅ　９
Ｍａｙ，２００８
明样品在２４ｈ内稳定。
重复性试验：取同一批样品６份，按２．２项下制
备供试品，测定含量，ＲＳＤ２１％。
回收率试验：取已知含量为００６０ｍｇ的样品约
７５ｍｇ共５份，精密称定，精密加入丹参酮ⅡＡ，按２．
２方法操作，测定，平均加样回收率为１０１１％，ＲＳＤ
２０％（ｎ＝５）。
样品测定：取各供试品溶液，对不同培养时期的
丹参毛状根样品中丹参酮ⅡＡ进行含量测定，除第２
周（测３份）外，每批平行测定７份，用外标一点法
计算其含量，通过ＳＰＳＳ１３０软件，利用单因子方差
分析结果，见图１，表２。
图１　丹参毛状根丹参酮ⅡＡ的ＨＰＬＣ图
Ａ．对照品；Ｂ．样品；１．丹参酮ⅡＡ
表２　不同培养时期丹参毛状根质量分数（珋ｘ±ｓ，ｎ＝７）
（干重）／％
培养时间 丹参酮ⅡＡ 丹酚酸Ｂ
２周 － ２８０±００５５ａ
４周 ００３８±０００５ａ ４２５±０２５８ｂ
６周 ００４０±０００４ａ ４９９±０１９４ｃ
８周 ００５８±０００４ｂ ４３３±０１８６ｂ
１０周 ００５５±０００３ｂ ３６９±００４８ｄ
　　注：同一列标有不同字母表示处理间有显著差异（Ｐ＜００５）
２．３　丹酚酸 Ｂ含量测定［４］　色谱条件：Ｗａｔｅｒｓ
ＳｙｍｍｅｔｒｙＳｈｉｅｌｄＴＭＲＰ１８（３９ｍｍ×１５０ｍｍ，５μｍ）色
谱柱，柱温３５℃，流速１０ｍＬ·ｍｉｎ－１，流动相甲醇
乙腈甲酸水（３０∶１０∶１∶５９），检测波长为２８６ｎｍ。
溶液制备：对照品溶液的制备精密称取丹酚酸Ｂ
对照品适量，加７５％甲醇制成０１４２ｍｇ·ｍＬ－１的丹
酚酸Ｂ对照品溶液；供试品溶液的制备：取毛状根样
品粉末约０１ｇ，精密称定，精密加入 ７５％甲醇 ２５
ｍＬ，称定质量，加热回流１ｈ，取出，放冷，再称定质
量，用７５％甲醇补重，摇匀，滤过，去续滤液，即得。
线性关系考察：取上述丹酚酸 Ｂ对照品溶液，
分别进样４，８，１２，１６，２０μＬ，按２．３项下色谱条件
测定峰面积。以进样量为横坐标 Ｘ，峰面积为纵坐
标 Ｙ绘制标准曲线，回归方程 Ｙ＝１３４０８７Ｘ－
４９７５４，ｒ＝１００００，线性范围０５７～２８μｇ。
精密度试验：精密吸取供试品溶液１０μＬ，连续
进样６次，测定峰面积，ＲＳＤ０３％。
稳定性试验：精密吸取供试品溶液１０μＬ，分别
测定０，１，２，４，８，１６，２４ｈ丹酚酸 Ｂ的峰面积，在２４
ｈ内，ＲＳＤ０７％，说明样品在２４ｈ内稳定。
重复性试验：取同一批样品６份，按２．３项下制
备供试品，测定含量，ＲＳＤ１４％。
回收率试验：取已知含量为 ２３ｍｇ的样品约
５０ｍｇ共５份，精密称定，精密加入丹酚酸Ｂ对照品
适量，按 ２．３方法操作，结果平均加样回收率为
１０１９％，ＲＳＤ２１％（ｎ＝５）。
样品测定：取各供试品溶液，对不同培养时期的
丹参毛状根样品中丹酚酸 Ｂ进行含量测定，除第２
周（测３份）外，每批平行测定７份，用外标一点法
计算其含量求平均值，通过ＳＰＳＳ１３０软件，利用单
因子方差分析结果，见图２，表２。
图２　丹参毛状根丹酚酸Ｂ的ＨＰＬＣ图
Ａ．对照品图；Ｂ．样品；１．丹酚酸Ｂ
３　讨论
通过对不同培养时期丹参毛状根生长量、生长
倍数的数据分析发现，丹参毛状根在培养到第４周
时，增长倍数显著增大，但个体差异较大不稳定，到
第６周以后，增长倍数趋于稳定，到了第８周、第１０
周增长并不显著，基本不再生长。丹参酮ⅡＡ的含量
随着培养时间越长积累越多，而且从外观来看，颜色
越深，可能是由于丹参酮ⅡＡ不断积累的结果，培养
到第８周以后没有显著差异。丹酚酸Ｂ第６周时达
到最高峰，与第８周、第１０周相比有显著性差异。
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第３３卷第９期
２００８年５月
　　　　　　　　　
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Ｖｏｌ．３３，Ｉｓｓｕｅ　９
Ｍａｙ，２００８
《中国药典》２００５年版第一部对丹参药材中丹参酮
ⅡＡ和丹酚酸Ｂ的含量要求是按干燥品计算不少于
０２％和３０％。而有文献报道［５］，河北安国地产丹
参药材和河北行唐的丹参药材丹参酮ⅡＡ质量分数
分别为００４％和００５％，而丹酚酸 Ｂ为２８９％和
３７４％。本实验的材料，无论是毛状根还是原药材，
其丹参酮ⅡＡ的含量都达不到药典要求。而水溶性
的丹酚酸Ｂ的含量相对较高，而且，毛状根中比药
材的含量还要高，可作为丹参水溶性制剂的原料，以
扩大药用资源。
为保证实验的可控性，本实验对培养基的量和接
种毛状根的量都有控制，尽量将误差减少到最低。在
实际生产中，有报道可以用一些气升试反应器［２］，增
长倍数远远高于实验室培养。根据本实验的结果，在
固体培养基中培养的毛状根，收获时应选择６周比较
合适，此时毛状根的增长倍数大，而有效成分相对来
说也比较高。这些结果对进一步研究丹参毛状根的
生产、药理、药效等提供了科学的参考依据。从而为
系统的研究丹参毛状根的性状打下了基础。
［参考文献］
［１］　张荫麟，宋经元，吕桂兰，等．丹参毛状根培养的建立和丹参酮
的产生［Ｊ］．中国中药杂志，１９９５，２０（５）：２６９．
［２］　邱德有，宋经元，马小军，等．丹参毛状根生物反应器大规模培
养的研究［Ｊ］．分子植物育种，２００４，２（５）：７０２．
［３］　黄炼栋，胡之璧，刘　涤．丹参毛状根中水溶性酚酸类化合物
的产生简报［Ｊ］．植物生理学报，１９９７，３３（４）：２６０．
［４］　中国药典［Ｓ］．一部．２００５：５２．
［５］　金樟照，祝　明，张文婷，等．不同产地丹参水溶性成分和脂溶
性成分指纹图谱测定及相关性研究［Ｊ］．中草药，２００４，３５
（１０）：１１７６．
［责任编辑　张宁宁］
［收稿日期］　２００７０２２８
［基金 项 目］　 国 家 “十 五”、“十 一 五”科 技 项 目
（２００４ＢＡ７２１Ａ２５，２００６ＢＡＩ０６Ａ１５３）
［通讯作者］　董诚明，Ｔｅｌ：（０３７１）６５６８００４１，Ｅｍａｉｌ：ｄｃｍ３７１
＠ｈａｃｔｃｍ．ｅｄｕ．ｃｎ
冬凌草组织培养物中主要次生代谢产物积累动态的研究
苏秀红，董诚明，王伟丽，冯卫生
（河南中医学院 中药学院，河南 郑州 ４５０００８）
　　冬凌草Ｒａｂｄｏｓｉａｒｕｂｅｓｃｅｎｓ（Ｈｅｎｍｓｌ．）Ｈａｒａ为唇
形科香茶菜属多年生植物。许多学者对冬凌草化学
成分、药理作用及临床疗效进行了研究，发现其中主
要抗癌、抗菌活性成分为二萜类化合物（冬凌草甲
素、冬凌草乙素）和多酚类化合物迷迭香酸，并对其
作了较深入的研究［１３］。萜类物质积累与分布不仅
具有较强的组织特异性，而且与植株的生长发育存
在着一定的相关性。迷迭香酸作为冬凌草水溶性部
分中主要的有效成分，具有较好的抗菌、消炎、止痛
的功效［３］。对彩色紫苏 ＣｏｌｅｕｓｂｌｕｍｅｉＢｅｎｔｈ．和洋苏
草ＳａｌｖｉａｏｆｉｃｉｎａｌｉｓＬ．等一些植物的研究表明培养细
胞中迷迭香酸含量远远超过原植物，因此，利用生物
技术生产迷迭香酸的研究越来越受到人们的关
注［４］。有关冬凌草组织培养的研究虽然已有相关
报道［５，６］，但对其培养物中主要次生代谢产物及其
积累规律的报道甚少。为此本实验在对冬凌草组织
培养过程系统研究的基础上，探讨了冬凌草培养物
中主要次生代谢产物冬凌草甲素、迷迭香酸的积累
规律，为进一步利用生物技术生产冬凌草次生代谢
产物的研究提供一些必要的基础资料，同时亦为其
大规模的生产提供科学依据。
１　材料
冬凌草叶片２００６年８月中旬采集于河南中医
学院药用植物种植园内，经董诚明教授鉴定为 Ｒ
ｒｕｂｅｓｃｅｎｓ。冬凌草甲素、迷迭香酸对照品均为河南中
医学院冯卫生教授所赠，纯度为９９８％。
２　方法
２．１　愈伤组织的诱导
取冬凌草幼嫩叶片，自来水冲洗，于超净台上用
７５％乙醇中消毒３０ｓ，之后用０１％升汞溶液消毒
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第３３卷第９期
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