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Effects of Chinese compound prescription on bone metabolism of weightlessness rats simulated by suspension

中药复方对模拟失重大鼠骨代谢的影响



全 文 :Observationofpenetration,distributionandaccumulationin
humanrenalproximaltubularepithelialcelsbyaristololactamⅠ
SHANGPu1,WANGXuan1,LIXiaomei2,TANGJiawei2,CAIShaoqing1
(1.SchoolofPharmaceuticalSciences,PekingUniversity,Beijing100083,China;
2.RenalDivision,DepartmentofMedicine,FirstHospital,PekingUniversity,andKeyLabofRenalDiseases,
PublicHealthMinistryofChina,Beijing100034,China)
[Abstract] Objective:TostudywhetheraristololactamⅠ (ALⅠ)canenterrenalproximaltubularepithelialcelsandthe
situationofintracelulardistributionandaccumulation.Method:Culturedhumanrenalproximaltubularepithelialcelline(HK2)
wasusedasthesubject.IntracelularfluorescencefromALⅠ anditsdistributionareexaminedbyfluorescencemicroscopyaftera
treatmentwithdiferentconcentrationofALⅠ,theintracelularaccumulationofALⅠ wasalsoinvestigatedbyincubatedcelsin
ALⅠfreemediumfor48hafterwashingoutthemediacontainingALⅠ.Result:AftertreatmentofALⅠ (concentrationfrom5μg
·mL-1to20μg·mL-1),glaucousfluorescencecouldbeobservedinsiderenalproximaltubularepithelialcelsat05h,andthe
fluorescencedistributedonlyincytoplasmwhilenotbeobservedinnuclei.Moreover,thefluorescenceofALⅠ couldbekeptincyto
plasmformorethan48hafterwashingoutthemediacontainingALⅠ.Conclusion:ALⅠ isabletoenterrenalproximaltubularep
ithelialcelsinshorttimeandaccumulateincytoplasm,butnotenternuclei.Thispropertymaycontributetothecytotoxicmechanism
ofrenalinjuryinducedbyALⅠ,whichmaypartialyexplainthepersistentrenaltoxicityofAAsanditsmetabolitesinthedevelop
mentofaristolochicacidnephropathy.
[Keywords] aristololactamⅠ;renaltubularepithelialcel;fluorescencemicroscopy;distribution;accumulation
[责任编辑 古云侠]
[收稿日期] 20070920
[基金项目] 国家自然科学基金项目(30500663)
[通讯作者] 胡素敏,Tel:(010)64287006,Email:cinndyhu@yahoo.com.cn
中药复方对模拟失重大鼠骨代谢的影响
佟海英,胡素敏,周 鹏,傅 骞,杨 佳,高学敏,张建军,钟赣生
(北京中医药大学 基础医学院 方药教研室,北京 100029)
[摘要] 目的:观察中药复方对尾部悬吊模拟失重大鼠骨代谢的影响。方法:50只Wistar大鼠按随机区组实
验设计法分成正常组、模型组、悬吊中药低(352g·kg-1)、中(704g·kg-1)、高剂量(1408g·kg-1)组,每组10
只,实验周期21d。造模前7d悬吊中药3个剂量组给予中药复方,空白与模型组给予蒸馏水灌胃,每日1次。第8
天灌胃1h后,模型组与悬吊中药3个剂量组尾部悬吊,正常组大鼠笼中自由活动,继续饲养14d。实验结束,检测
各组动物血清碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(BGP)、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)、股骨羟脯氨酸(HOP)含量及股骨、
腰椎骨密度(BMD)的变化。结果:与正常组相比,模型组大鼠血清 ALP显著降低(P<005),BGP,TRAP含量无明
显变化,股骨、腰椎BMD明显降低(P<005);与模型组相比中药各剂量组血清 ALP含量无显著变化,中药中剂量
组血清BGP显著增高(P<005),中药中、高剂量组血清 TRAP显著降低(P<005),中药中剂量组股骨 BMD显著
增加(P<005)。结论:中药复方能明显促进骨形成作用,有效抑制骨吸收作用,减弱溶骨过程从而促进骨矿盐的
沉积和矿化,增强BMD而达到防治骨丢失的作用;有效的防护和治疗失重性骨丢失采取联合措施很有必要。
[关键词] 中药复方;模拟失重;碱性磷酸酶;骨钙素;抗酒石酸酸性磷酸酶;羟脯氨酸;骨密度
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[中图分类号]R285.5 [文献标识码]A [文章编号]10015302(2008)07079705
  失重或模拟失重对骨骼产生明显的影响,可出
现骨密度减少、骨质脱钙、骨组织结构改变、骨机械
强度降低等[1]。因而失重骨丢失的有效防护措施
的研究一直是航天医学界关注的热点。航天中采用
的运动疗法、药物、营养添加等对抗措施未能起到理
想的效果[2]。中医药在对抗失重骨丢失的研究较
少,有学者报道单味中药和中药复方对失重骨丢失
有防护作用[3,4]。笔者根据中医“肾主骨”、“肝主
筋”、“脾主肌肉”的理论,从整体调节入手,据此以
滋补肝肾,健脾益气,活血化瘀,强筋健骨等治法为
依据组成中药复方。本研究主要观察该方对模拟失
重大鼠骨代谢变化的影响,为研究中医药对抗模拟
失重骨丢失措施及探讨中药对抗模拟失重骨丢失机
制的研究奠定基础。
1 材料
1.1 动物
Wistar大鼠,雄性,体重(150±10)g,由北京维
通利华公司提供,合格证号 SCXK(京)20020003。
适应环境7d后进行实验。
1.2 药物
中药复方由刺五加、黄芪、补骨脂、怀牛膝等药
按一定比例组成。全部药材经北京中医药大学中药
教研室鉴定,按传统工艺煎煮,制成含生药 1g·
mL-1的口服液。
1.3 试剂
血清碱性磷酸酶(ALP)试剂盒,由北京中生北
控生物研究所提供,批号070251;骨钙素(BGP)试
剂盒,由英国皇家医学院内分泌部提供原料,北京华
英生物技术研究所组装,批号20070728;羟脯氨酸
(HOP)及抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)试剂盒,由
南京建成生物工程研究所提供,批号 20070508,
20070509。
1.4 仪器
Y型精密电子天平,美国双杰兄弟(集团)有限
公司;A-6半自动生化分析仪,北京松上技术有限
公司;752紫外光栅分光光度计,上海精密科学仪器
有限公司(分析仪器总厂制造);GC-911-Y放射
免疫计数器,中国科技大学实业总公司;双能 X线
骨密度仪,美国LUNAR公司。
2 方法
2.1 尾部悬吊模型的建立
采用陈杰等改进的鼠尾悬吊法[5],将大鼠在悬
吊笼中尾部悬吊,后肢离地,使躯干与地面成 30°
角,前肢着地可以自由活动。
2.2 实验分组和处理
Wistar大鼠按随机区组实验设计法分成正常
组、模型组、悬吊中药低剂量组(352g·kg-1·
d-1,成人用量为528g,成人用量4倍)、悬吊中药
中剂量组(704g·kg-1·d-1,成人用量8倍)、悬
吊中药高剂量组(1408g·kg-1·d-1,成人用量16
倍)共5组,每组10只,均用悬吊笼单笼饲养,室温
(24±1)℃,相对湿度(60±10)%,自由饮食,实验
周期21d。造模前7d悬吊中药3个剂量组给予中
药复方(10mL·kg-1)灌胃,体现预防性给药和治
疗给药的结合,空白与模型组给予蒸馏水灌胃(10
mL·kg-1),每日1次。第8天灌胃1h后,模型组
与悬吊中药3个剂量组尾部悬吊,正常组大鼠笼中
自由活动。继续每日灌胃1次,每周称重1次,按重
量调整给药剂量,连续灌胃14d。
2.3 标本处理及检测
2.3.1 大鼠血清ALP,BGP,TRAP的测定 实验第
21天水合氯醛(00035mL·g-1)麻醉大鼠,腹主
动脉采血8~10mL,室温下放置1h后,4℃离心
(3000r·min-1,15min),分离血清,采用对硝基苯
磷酸二钠法测ALP含量,放免法测 BGP含量,比色
法测TRAP含量。
2.3.2 大鼠骨密度(BMD)的测定 实验第21天
处死大鼠,取右侧股骨和第4腰椎骨,去净附着结缔
组织,分别用生理盐水纱布包裹后即刻保存于 -70
℃冰箱中,并尽快进行 BMD测定。测定前取出上
述样本,室温下复温,然后将各样本分别置于有机玻
璃板上,固定位置,以全长的1/2交界处为测量点,
应用双能X线骨密度仪作骨横越扫描,荧光屏显示
测量图像,自动打印测量结果。
2.3.3 股骨 HOP的测定 将股骨于80℃烤箱烘
烤72h至恒重,然后将每份骨标本置于10mL刻度
瓶中加入6mol·L-1HCl5mL,刻度瓶口密封后置
于烤箱中,108℃恒温消化24h后取出过滤,取滤
液,调pH6~7后按照羟脯氨酸测定试剂盒方法用
紫外分光光度计测定样品中 HOP的吸光度(A),然
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后根据公式[(测定管A-空白管A/标准管A-空白
管A)×标准管含量×(水解液总体积/取样量)]计
算出HOP的含量。
2.4 统计方法
各指标数据均用 珋x±s表示,使用 SPSS120统
计软件中的方差分析(ANOVA)进行检验,P<005
表示差异有显著性。
3 结果
3.1 中药复方对模拟失重大鼠体重的影响
实验第7天各组大鼠体重无明显差异;实验第
14天与正常组相比模型组大鼠体重明显降低(P<
005),与模型组相比中药复方低、中、高剂量组均
无明显差异;实验第 21天各组大鼠体重无明显差
异。见表1。
表1 中药复方对不同时间模拟失重大鼠体重的影响(珋x±s,n=10)
组别 剂量/g·kg-1 1d 7d 14d 21d
正常   - 18870±968 23289±1035 27150±1948 26130±3364
模型   - 18660±1306 23640±1512 25070±13261) 25740±2425
中药复方 352 18790±661 23920±926 25470±11341) 26170±1628
  704 18930±811 24200±1023 25540±18041) 24670±2817
  1408 18770±882 23670±1110 24850±22681) 24740±3232
  注:与正常组比较1)P<005;与模型组比较2)P<005(表2,3同)
3.2 中药复方对模拟失重大鼠血清 ALP,BGP,
TRAP及股骨 HOP的影响
与正常组相比模型组大鼠血清 ALP含量明显
降低(P<005),BGP,TRAP含量无明显差异;中药
复方低、中、高剂量组血清 ALP含量与模型组均无
明显差异,中药复方中剂量组可显著增加模拟失重
大鼠血清 BGP含量(P<005),中药复方中、高剂
量组可显著降低模拟失重大鼠血清 TRAP含量
(P<005);各组大鼠股骨 HOP含量无明显差异。
见表2。
3.3 中药复方对模拟失重大鼠股骨、腰椎 BMD的
影响
与正常组相比模型组大鼠股骨、腰椎BMD明显
降低(P<005),中药复方中剂量组可明显增加模
拟失重大鼠股骨 BMD(P<005)。见表3。
4 讨论
表2 中药复方对模拟失重大鼠血清 ALP,BGP,TRAP及股骨 HOP的影响(珋x±s,n=8)
组别 剂量/g·kg-1 ALP/U·L-1 BGP/μg·L-1 TRAP/U·L-1 股骨HOP/μg·mL-1
正常   - 7279±936 411±070 2345±384 831±098
模型   - 6261±10481) 398±084 2584±411 850±166
中药复方 352 5878±9371) 461±061 2364±478 879±085
  704 6149±8761) 475±0722) 2032±2592) 880±098
  1408 6287±741 425±085 2013±5192) 806±103
表3 中药复方对模拟失重大鼠股骨、腰椎BMD的影响
(珋x±s,n=8)
组别
剂量
/g·kg-1
股骨BMD
/g·cm-2
腰椎BMD
/g·cm-2
正常   - 01354±00055 01385±00070
模型   - 01195±000441) 01225±000871)
中药复方 352 01200±000471) 01234±000751)
  704 01261±000491,2)01246±000571)
  1408 01188±000411) 01294±000671)
  失重性骨丢失从中医学角度分析,与肝肾脾胃
关系最为密切。中医认为肾主骨,藏精,生髓,为先
天之本;肝主筋,藏血,束骨,而利关节;脾主运化,主
肌肉,四肢,为后天之本,气血生化之源。失重状态
下,造成了肝肾不足,脾胃虚弱,影响到精血化生乏
源,这是引起失重性骨丢失的主要病理机制。所以,
笔者以滋补肝肾,健脾益气,活血化瘀,强筋健骨为
组方原则拟定了由刺五加、黄芪、补骨脂、怀牛膝等
中药组成的科研处方。本实验初步观察该复方对尾
部悬吊模拟失重大鼠骨代谢变化的影响。
大鼠尾部悬吊模型能够复制失重时体液的头向
转移和失重性骨质丢失,同时应激作用很小,保持了
大鼠正常生长的一种被公认并得到广泛应用的模拟
失重模型[6]。本实验结果表明,大鼠出现了明显骨
代谢异常:血清 ALP含量、股骨、腰椎 BMD明显降
低这与国内外的相关报道一致[7,8],说明应用尾部
悬吊大鼠的模型是成功的。在整个实验期间大鼠生
长状况良好,悬吊初期各组大鼠体重明显降低,中药
低、中剂量组有增加趋势,但作用不明显;此后大鼠
体重始终保持相对稳定的增长趋势,且与正常组的
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体重无明显差异,提示采用本模型大鼠生长良好,
应激反应较小。
在模拟失重时承重骨骨丢失的主要原因是骨形
成减少[9];而在大多数空间飞行动物研究中,骨吸
收正常或一过性升高[10,11]。
ALP是成骨细胞的标志酶,参与调节钙化过程。
失重或模拟失重时血清ALP变化不一致。“天空实
验室”航天飞行后 ALP活性轻度下降;而“阿波罗”
飞行后航天员血清 ALP的活性轻度增高[12]。在作
者的实验中模型组大鼠血清 ALP明显降低,而中药
各剂量组与模型组相比无明显差异,这有可能与给
药时间或给药途径有关外与指标的特异性也有关。
BGP是反映机体骨更新状态和骨形成的特异指标。
本实验中,模型组大鼠血清 BGP下降,说明悬吊大
鼠成骨细胞的活性降低,并引起骨形成速度降低和
骨转换速度下降,骨丢失为低转换型骨丢失;中药中
剂量组可明显增加BGP含量,提示其具有提高成骨
细胞活性,促进骨矿盐沉积的作用。
TRAP标志破骨细胞的活性 ,并在一定程度上
反映了骨吸收状况[13]。在本实验中,模型组大鼠血
清TRAP与正常组比较无明显变化,与模型组比较
中药复方中、高剂量组血清 TRAP明显降低。表明,
模拟失重对破骨细胞骨吸收功能无明显影响,但中
药复方可以明显抑制骨吸收,减弱溶骨过程。骨
HOP约占整个骨胶原的 125%,在本实验中各组
大鼠股骨 HOP含量无明显变化,表明中药对股骨有
机质的相对含量无明显作用。
BMD是反映骨皮质厚度、骨小梁结构和骨量的
重要指标。本实验中,与正常组比较模型组大鼠股
骨、腰椎 BMD明显降低,中药中剂量组可明显增加
股骨BMD。说明给与中药干预后可提高成骨细胞
活性,促进骨矿盐的沉积以及抑制破骨细胞活性而
促进骨的矿化,增强BMD。
在2周的尾部悬吊期间,模型组大鼠股骨 BMD
较正常组降低了1174%,中药复方可提高552%,
但与正常组比较仍降低了 687%。有研究表
明[4,14]3周模拟失重可使股骨 BMD降低2209%,
1600%,给与中药复方、营养素合剂干预后可提高
1940%,667%,但 与 正 常 组 比 较 仍 降 低 了
698%,1040%。以上结果表明,2周或 3周模拟
失重引起的BMD的变化给予单一中药复方或营养
素合剂等很难恢复正常。所以,为有效的对抗失重
性骨丢失给予中药干预的同时添加营养素合剂以及
合理应用以往航天实践中常用的体育锻炼或人工重
力等方法采取联合措施很有必要。
综上所述,中药复方能有效的改善失重性骨丢
失,进一步的机制阐明有待于细胞水平和分子水平
的深入研究;而为更有效的防护和治疗失重性骨丢
失采取联合措施是很有必要的。
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EfectsofChinesecompoundprescriptiononbonemetabolismof
weightlessnessratssimulatedbysuspension
TONGHaiying,HUSumin,ZHOUPeng,FUQian,YANGJia,GAOXuemin,ZHANGJianjun,ZHONGGansheng
(BeijingUniversityofTraditionalChineseMedicine,Beijing100029,China)
[Abstract] Objective:TostudytheefectsofChinesemedicinecompoundonbonemetabolismofweightlessnessratssimulated
bytailsuspensionMethod:FiftyWistarratsweredividedinto5groupsrandomly:controlgroup,modelgroup,andlowdoes,medi
umdoseandhighdoestreatedgroupTheexperimentperiodlasted21daysAftertheChinesecompoundprescriptionanddistiledwa
terwereoralygiventotreatedgroups,andcontrolandmodelgroupfor7days,respectively,thetailsuspensionexperimentwasper
formedfortreatedandmodelgroup,meanwhileadministrationofChinesecompoundprescriptionanddistiledwaterstillasteduntilthe
endoftheexperimentBloodserumwascolectedfordeterminationofalkalinephosphatase(ALP),boneglaprotein(BGP),tartrate
resistantacidphosphatase(TRAP),femoralboneHOPThechangesofbonemineraldensity(BMD)offemoralboneandlumbarverte
brawereobserveResult:Comparedwithcontrolgroup,theALPlevelofmodelgroupwasmarkedlydecreased(P<005),nochange
ofBGP,TRAPwasnotobserved,theBMDoffemoralboneandlumbarvertebraweredecreasedremarkably(P<005),Comparedwith
modelgroup,thechangeofALPleveloftreatedgroupswasnotsignificantforaltreatedgroups,theBGPlevelandBMDformedium
dosegroupwereincreased(P<005),theTRAPlevelformediumdoseandhighdoesgroupswasdecreased(P<005)
Conclusion:TheChinesecompoundprescriptioncanimprovetheboneformationandpreventbonelossviainhibitingboneabsorption
andimprovingossify,bonemineraldepositionandmineralizationaswelasincreasingBMD,whichleadstopreventionandtreatmentof
boneloss
[Keywords] Chinesemedicinecompound;weightlessnesssimulatedbysuspension;ALP;BGP;TRAP;HOP;BMD
[责任编辑 古云侠]
[收稿日期] 20070830
[通讯作者] 王岚,Tel:(010)640144112948,Email:wlll@sina.com
儿茶素单体对心肌细胞缺氧再给氧损伤的
保护作用及机制研究
叶锦霞,王 岚,梁日欣,杨 滨
(中国中医科学院 中药研究所,北京 100700)
[摘要] 目的:观察没食子儿茶素没食子酸酯(GCG)和表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对体外培养大鼠乳
鼠心肌细胞缺氧再给氧损伤的保护作用,并初步探讨其作用机制。方法:建立体外培养大鼠心肌细胞缺氧再给氧损
伤模型,倒置显微镜下观察加入各儿茶素单体(50,20,8μg·mL-1)后,各组缺氧再给氧前后细胞形态学和搏动频率
变化;以MTT法检测各组细胞的存活率;测定细胞上清液中乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过
氧化物酶(GSHPx)活性和丙二醛(MDA)含量;测定心肌细胞膜ATP酶;分别给予蛋白激酶(PKC)阻断剂十字孢碱
staurosporine(stau,10nmol·L-1)和Gi/o蛋白失活剂pertussistoxin(PTX,200μg·mL-1),以探讨其作用机制。结果:
GCG,EGCG均能够增加心肌细胞存活率,增加SOD和ATP酶活性,降低心肌细胞LDH的释放,降低培养液中MDA
的含量,给予PKC阻断剂和Gi/o蛋白失活剂后,与单纯GCG组、EGCG组比较,心肌细胞搏动频率和存活率降低,同
时LDH,MDA释放量增加,SOD活性下降。结论:GCG和EGCG具有抗体外培养大鼠乳鼠心肌细胞缺氧再给氧损伤
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