全 文 ：tst1xh otss1{h ~ ≥⁄分别为 u1sh ot1xh ∀
3 样品测定结果
按本方法测定 v批样品 ussysystoussysysuo
ussysysvo计算样品中儿茶素 !原儿茶素的含量 ∀上
述 v个样品溶液中儿茶素和原儿茶素的含量分别为
每支 v1zou1wov1{ou1vov1you1w °ª∀
4 讨论
本实验比较了以甲醇为溶剂 o回流提取法 kvs
°¬±l!超声提取法 kvsoys °¬±l提取的效果 o结果认
为超声 vs °¬±含量最高 o操作时间短 o故选择超声
vs °¬±为提取条件 ∀对于含儿茶的制剂 o本法同样
适用于其中儿茶素与原儿茶素含量的测定 o从而为
此类品种的质量控制提供了一种有效的方法 ∀
≈参考文献
≈t 中国药典 ≈≥ q一部 qussx}|q
≈u 中国药典 ≈≥ q一部 qusss}{q
≈责任编辑 张宁宁
≈收稿日期 ussy2s{2ts
≈通讯作者 3 黄璐琦 oר¯}kstslywstwwtt2u|xx
苍术毛状根的诱导及其化学成分组成分析
袁 媛 o黄璐琦 3 o闫 寒 o吕冬梅
k中国中医科学院 中药研究所 o北京 tsszssl
近年来 o人们在多种植物中建立了毛状根培养
系统 o与植物细胞培养相比 o毛状根培养具有生长速
度快 !激素自养 !分化程度较高以及遗传性状相对稳
定等优点 ∀苍术源于菊科苍术属植物苍术 Ατραχ2
τψλοδεσλανχεα k׫∏±¥ql ⁄≤1的根茎 o其功效为燥湿
健脾 !驱风散寒 !明目 o适用于脘腹胀满 !泄泻 !水肿 !
风湿痹痛 !风寒感冒 !雀目夜盲等 ≈t ∀由于苍术的
生长周期长 o市场需求量日益增加 o加之对野生资源
的破坏等原因 o使得其原料药的供应不能满足临床
应用的需要 ≈u ∀本研究用发根农杆菌侵染苍术无
菌苗叶片 o建立了苍术毛状根培养系统 o并利用 ≤ 2
≥对生长 {周的毛状根挥发油成分进行了初步的
分析 ∀
1 材料和方法
1q1 材料
苍术 Α. λανχεα种子由湖北中医学院詹亚华教
授鉴定并提供 ∀无菌苗由本实验室培养 ≈u ~发根农
杆菌 Αγροβαχτεριυµ ρηιζογενεσw菌株由中国科学院
植物研究所叶和春研究员赠送 ∀
1q2 方法
1q2q1 农杆菌的活化 挑取发根农杆菌 w单菌
落于 ≠∞
培养基中 ou{ ε 下振荡过夜 o备用 ∀
1q2q2 发根农杆菌转化苍术 将苍术无菌苗叶片
切成小块 o放置到 ≥培养基上 v §后 o采用叶盘法
用发根农杆菌 w侵染 ts °¬±∀放置于铺有无菌滤
纸的 ≥培养基上 v §后 o转到含有 xss °ª# pt ≤¥
的 ≥培养基上 ow周后可以观察到毛状根的形成 ∀
1q2q3 苍术毛状根的培养 切下侵染部位长出的
毛状根 o每条毛状根分别接种于含有 xss °ª# pt
≤¥的 ≥培养基上 o每隔 z §转接 t次 o经 v ∗ x次
继代培养获得除菌的毛根系 ∀毛根系在不含激素的
≥培养基中保存和繁殖 ∀
1q2q4 毛状根的 °≤ 检测 用 ≤×
法提取抗性
毛状根的总 ⁄o根据 µ²¯已报道序列 k ±¨
¨¤±®}
÷tuxz|l设计 °≤ 检测引物 }toxχ2≤××≤2
≤≤≤≤≤2vχ~ uo xχ2≤×××≤
≤ 2vχ∀反应体系为 }us1s Λ§§u ou1x Λts
≅
∏©©¨µos1x Λ§×°kts °°²¯ # pt l os1x Λvχ
³µ¬° µ¨ktss ±ª# Λpt los1x Λxχ³µ¬° µ¨ktss ±ª#
Λpt los1x Λפ´ 酶 kx # Λpt los1x Λ基因组
⁄kt Λª# Λpt l∀反应条件为 }|w ε 变性 vs ¶o
yu ε 退火 t °¬±ozu ε 延伸 u °¬±ovs个循环后 ozu
ε 保温 x °¬±∀
1q2q5 苍术毛状根挥发油的提取 取苍术毛状根
洗净 ovs ε 烤箱干燥后 o粉碎 o根据药典挥发油测定
方法 ≈u o精密称取茅苍术细粉 s1t ªo用 s1x °醋酸
#svwu#
第 vu卷第 uu期
ussz年 tt月
中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλοφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
∂ ²¯qvuo ¶¶∏¨ uu
²√ °¨¥¨ µo ussz
乙酯回流提取挥发油 ∀所提取的挥发油常温干燥后
用 ts Λ醋酸乙酯溶解提取物 ∀
1q2q6 苍术毛状根挥发油的主要组分分析 用
≤ 2 ≤对挥发油中的组分进行分离鉴定 ∀气质联
用所用仪器为 × ≤∞usssr ≥o检测条件为 ≥∞2xw
石英毛细管柱 ks1vu °° ≅ vs °lo柱温 ys ∗ uus ε
kw ε # °¬±pt lo气化室温度 uws ε o载气为氦气 o柱
前压 y{1y ®°¤o进样量为 t1s Λo重复进样 v次 o分
流比 xsΒto电离方式 ∞o电子能量 zs ∂¨ o离子源温
度 uss ε o加速电压 w ®∂ o扫描速度 t ¶r§¨ ¦∀峰面
积归一化法计算各化合物的相对百分含量 ∀获得的
质谱数据用 ¤¬± ¬¯¥o2≥∞o≥× ∂ µ¨¶¬²± t1z谱库
进行检索 o最终确认其中的化学成分 ∀
2 结果与分析
2q1 苍术毛状根的诱导和培养
未感染的苍术叶片外植体在含有 xss °ª# pt
≤¥的无激素 ≥培养基上连续培养 t个月后无生
根情况 o而感染发根农杆菌 w的叶片外植体培养
u周后 o从其切口中脉处或附近产生少量愈伤组
织 o再从愈伤组织上产生毛状根 o也可直接从切口
叶脉处产生毛状根 ow周后生根的外植体比例占
zz1{h o毛状根被白色短根毛 ∀将毛状根切下置于
含有 xss °ª# pt ≤¥的 ≥培养基中除菌培养后 o
毛状根可在无外源激素的 ≥培养基上自主生长 o
并且较多分枝和根毛 ∀非转化根不能在无外源激
素的 ≥培养基中自主生长 o并随着培养时间延长
逐渐褐化坏死 ∀
2q2 毛状根中 µ²¯基因的 °≤ 检测
提取苍术毛状根总 ⁄o利用 °≤ 扩增 µ²¯
基因片段 ∀结果表明 o在苍术毛状根中可以检测到
xus ¥³的特异 ⁄片段 o且在阳性对照 k发根农杆
菌 w ⁄l中扩增出的相同大小的特异性片段 o而
在阴性对照中检测不到此片段 k图 tl∀
2q3 苍术毛状根挥发油主要活性成分归一化含量
分析
以水蒸气蒸馏法提取苍术毛状根的挥发油 o进
行毛细管气相色谱分析 o共分离出 t|个峰 o以归一
化法计算了各个峰的相对含量 o用气相色谱 2质谱法
从中共鉴定了 ts个成分 o占挥发油总组分的
z|1vzh k表 tl∀
3 小结
由于苍术药用部位为根茎 o其毛状根培养体系
图 t 苍术毛状根 µ²¯基因的 °≤ 分析
q⁄ °¤µ®¨ µ~tq阴性对照 ~u ∗ xq苍术毛状根 ~
yq发根农杆菌 w ⁄
表 t 苍术毛状根挥发油主要成分分析结果
²1 化合物
τ
r°¬±
相对分
子质量
相对
含量 rh
t 烷烃类化合物 t|1zz t{w t1ts
u 榄香醇 ¨¯ °¨ ±¨¨ uw1yx usw t1wy
v 苍术素异构体 ¤·µ¤¦·¼¯ ²§¬± ¬¶²° µ¨ u{1zx t{u x1u{
w 苍术素 ¤·µ¤¦·¼¯ ²§¬± vs1yt t{u v1|v
x tou2¥¨ ±½¨ ± §¨¬¦¤µ¥²¬¼¯ ¬¦¤¦¬§o vu1{s uz{ t1xx
βισku2° ·¨«¼¯ ³µ²³¼¯ l ¶¨·¨µ
y 十六烷基腈 «¨ ¬¤§¨ ¦¤± ±¨¬·µ¬¯¨ vv1{y uvz t1|z
z 酞酸丁酯 §¬¥∏·¼¯³«·«¤¯¤·¨ vx1tz uz{ t1zy
{ 齐墩果腈 ²¯ ¤¨±¬·µ¬¯¨ v{1t{ uyv u1{s
| 酰胺类化合物 ws1v{ uxx wu1zu
ts 十八碳烯酰胺 wx1yz u{t ty1{s
kΖl2|2²¦·¤§¨ ¦¨±¤°¬§¨ |
的建立对苍术转基因平台和生物转化等研究具有十
分重要的意义 ∀发根农杆菌的转化只发生在细胞分
裂的 ≥期 k即 ⁄合成期 lo因此幼嫩的 !生长旺盛
的组织对农杆菌更敏感 ≈v ∀本研究以苍术叶片外
植体为材料 o利用发根农杆菌 w建立了发根农杆
菌对苍术的遗传转化系统 o°≤ 结果表明 oµ²¯基因
已经整合到毛状根的基因组中 ∀对诱导 {周的苍术
毛状根挥发油成分进行了初步的分析 o通过 ≤ 2 ≥
鉴定出 ts个组分 o其中苍术素 v1|vh !榄香醇
t1wyh ∀虽然转化的毛状根在无激素的培养基上能
够生长 o但生长速度缓慢 o如何提高毛状根生长速
率 o缩短培养周期 o尚待进一步研究 ∀
≈参考文献
≈t 中国药典 ≈≥ q一部 qussx}tttq
≈u 袁 媛 o吕冬梅 o黄璐琦 o等 q苍术不定根诱导培养的研究 ≈ q
中国中药杂志 ousszovuktl}yxq
≈v 许铁峰 o张汉明 o张 威 o等 q应用发根农杆菌 ¬×2⁄建立菘
蓝的毛状根优质株系和植株再生系统 ≈ q第二军医大学学
报 ousssoutktsl}|szq
≈责任编辑 张宁宁
#tvwu#
第 vu卷第 uu期
ussz年 tt月
中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλοφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
∂ ²¯qvuo ¶¶∏¨ uu
²√ °¨¥¨ µo ussz