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ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＧｙｎｏｓｔｅｍｍａｆｒｏｍｔｈｅｉｒａｄｕｌｔｅｒａｎｔＣａｙｒａｔｉａｊａｐｏｎｉｃａ
ｂｙＰＣＲ－ＲＦＬＰ
ＷＡＮＧＣｈｏｎｇ，ＺＨＡＮＧＹｕａｎｙｕａｎ，ＹＡＮＧＪｕａｎ，ＪＩＡＮＧＬｉｎｇｙａｎ，ＬＩＭｉａｏｍｉａｏ，ＺＨＡＯＧｕｉｆａｎｇ
（ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＲｅｓｏｕｒｃｅＢｉｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｉｎＷｅｓｔｅｒｎＣｈｉｎａ（ＮｏｒｔｈｗｅｓｔＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ），
ＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＥｄｕｃａｔｉｏｎ，Ｘｉ＇ａｎ７１００６９，Ｃｈｉｎａ）
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＴｏｅｓｔａｂｌｉｓｈａｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔａｎｄｅｆｅｃｔｉｖｅｍｅｔｈｏｄｆｏｒｔｈｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＧｙｎｏｓｔｅｍｍａａｎｄＣａｙｒａｔｉａｊａｐｏｎｉ
ｃａ．Ｍｅｔｈｏｄ：Ｅｉｇｈｔｓｐｅｃｉｅｓ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇＧｙｎｏｓｔｅｍｍｐｅｎｔａｐｈｙｌｕｍ，Ｇ．ｐｅｎｔａｇｙｎｕｍ，Ｇ．ｃａｒｄｉｏｓｐｅｒｍｕｍ，Ｇ．ｌｏｎｇｉｐｅ，Ｇ．ｙｉｘｉｎｇｅｎｓｅ，Ｇ．
ｌａｘｉｆｌｏｒｕｍ，Ｇ．ｇｕａｎｇｘｉｅｎｓｅａｎｄＣ．ｊａｐｏｎｉｃａｗｅｒｅｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄｔｈｒｏｕｇｈＰＣＲ－ＲＦＬＰｏｆｓｉｘｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔＤＮＡｆｒａｇｍｅｎｔｓ．Ｔｈｅｓｉｘｇｅｎｅ
ｆｒａｇｍｅｎｔｓｗｅｒｅｄｉｇｅｓｔｅｄｂｙｓｉｘｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇＴａｑⅠ，ＨｐａⅡ，ＥｃｏＲⅠ，ＲｓａⅠ，ＨｈａⅠ，ＨｉｎｄⅢ．Ｒｅ
ｓｕｌｔ：ＳｅｖｅｎｓｐｅｃｉｅｓｏｆＧｙｎｏｓｔｅｍｍａａｎｄｔｈｅｉｒａｄｕｌｔｅｒａｎｔｃｏｕｌｄｂｅｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｂｙｔｒｎＫ１ｆｔｒｎＫ２ｒａｎｄＲｓａ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：ＰＣＲ－ＲＦＬＰｐｒｏ
ｖｉｄｅｓａｑｕｉｃｋ，ｒｅｌｉａｂｌｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｍａｒｋｅｒｔｅｃｈｎｉｑｕｅｆｏｒｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＧｙｎｏｓｔｅｍｍａａｎｄｔｈｅｉｒａｄｕｌｔｅｒａｎｔＣａｙｒａｔｉａｊａｐｏｎｉｃａ．
［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］ Ｇｙｎｏｓｔｅｍｍａ；Ｃａｙｒａｔｉａｊａｐｏｎｉｃａ；ＰＣＲＲＦＬＰ；ｃｌａｓｓｉｆｉｅｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ
［责任编辑 吕冬梅］
［收稿日期］ ２００７１２１２
［基金项目］ 国家农业成果转化资金重点项目（０５ＥＦＮ２１３４００１２４）；淮北市重大专项（０６０８５）
［通讯作者］ 薛建平，Ｔｅｌ：（０５６１）３８０２０２５，Ｅｍａｉｌ：ｘｕｅｊｐ２０００＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ
半夏试管块茎银染 ｍＲＮＡ差异显示条件的
建立及优化
薛建平１，黄月琴１，２，徐有明２，田振东２
（１．淮北煤炭师范学院 生命科学学院 资源植物生物学安徽省重点实验室，安徽 淮北 ２３５０００；
２．华中农业大学 园艺林学学院，湖北 武汉 ４３００７０）
［摘要］ 目的：建立半夏试管小块茎ＤＤＲＴＰＣＲ反应最佳体系，为进一步研究半夏试管小块茎相关基因表达
提供技术参考。方法：以半夏试管苗的叶柄
试管小块茎为材料，利用正交试验设计，研究模板。Ｍｇ２＋，ｄＮＴＰｓ，引
物和ＤＮＡ聚合酶等因素，对ＤＤＲＴＰＣＲ反应体系的影响。结果与结论：２０μＬ的反应体系中含有 ｄＮＴＰｓ１５０μｍｏｌ
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第３３卷第１９期
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·Ｌ－１，Ｔａｑ酶０６Ｕ，锚定引物２μｍｏｌ·Ｌ－１，随机引物１μｍｏｌ·Ｌ－１，Ｍｇ２＋２５ｍｍｏｌ·Ｌ－１，２μＬ１０×ｂｕｆｅｒ和２５
μｇ的ｃＤＮＡ模板。各因素影响程度依次为Ｔａｑ酶＞ｃＤＮＡ模板＞ｄＮＴＰｓ＞Ｍｇ２＋＞引物。
［关键词］ 半夏；试管块茎；ＤＤＲＴＰＣＲ；正交优化；非变性ＰＡＧＥ；银染
［中图分类号］Ｑ７８６ ［文献标识码］Ａ ［文章编号］１００１５３０２（２００８）１９２１７００５
目前研究基因差异表达分析的方法有很多，如
抑制消减杂交（ＳＳＨ）、代表性差异分析（ＲＤＡ）、ｍＲ
ＮＡ差异显示技术（ＤＤＲＴＰＣＲ）、基因表达系列分析
技术（ＳＡＧＥ）和 ＤＮＡ微阵列技术（ＤＮＡｍｉｃｒｏａｒａｙ）
等。其中，Ｌｉａｎｇ等［１］建立的差异反转录 ＰＣＲ技术
（ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｌｄｉｓｐｌａｙｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＰＣＲ，ＤＤＲＴ
ＰＣＲ）是以 ＰＣＲ技术和聚丙烯凝胶电泳技术为基
础，结合银染或放射性自显影等显色技术，能快速有
效地鉴定并克隆２个或多个平行材料之间的差异表
达基因，为差异表达基因的分离克隆提供了一个全
新的思路。该方法以其 ＲＮＡ用量少，灵敏度高，操
作简单、快速和可分析低丰度 ｍＲＮＡ等特点，近年
来迅速应用于诸如抗病基因分离，植物阶段发育等
许多领域的基因差异表达研究［２５］。迄今为止，关于
半夏块茎发育过程中基因的差异表达还未见报道，
涉及到其形成的基因表达机制仍不清楚。本试验在
前期工作基础上，通过对影响 ＤＤＲＴＰＣＲ技术的模
板浓度、引物浓度、ｄＮＴＰｓ浓度、镁离子浓度以及
Ｔａｑ酶用量等主要因素在差异显示反应过程中的交
互作用分析［６］，旨在建立无同位素的银染差异显示
的最佳反应条件，为半夏试管小块茎发育相关的基
因异表达分析，以及试管块茎诱导发育的更深入研
究奠定基础。
１ 材料与方法
１．１ 材料
半夏材料由资源植物生物学安徽省重点实验室
提供，经薛建平教授鉴定为天南星科三叶半夏
ＰｉｎｅｌｉａｔｅｒｎａｔａＢｒｅｉｔ．的试管苗和试管微型块茎［７］。
１．２ 方法
１．２．１ ＲＮＡ的提取及纯化 用改进的异硫氰酸胍法
提取试管苗叶柄和叶柄培养３０ｄ后形成的试管小块
茎的总 ＲＮＡ，０８％琼脂糖凝胶电泳检测其完整
性［８］。紫外分光光度计测定 Ａ２６０，Ａ２８０，计算 ＲＮＡ含
量和纯度。用 ＤＮａｓｅⅠ消化总 ＲＮＡ除去样品中痕量
ＤＮＡ，１２％琼脂糖凝胶电泳检测ＲＮＡ完整性。
１．２．２ ｃＤＮＡ第１链的合成 以总 ＲＮＡ为模板，
用锚定引物反转录，６５℃ １０ｍｉｎ，４２℃ ４５ｍｉｎ，４８
℃１５ｍｉｎ，合成ｃＤＮＡ第１链，反转录产物 －２０℃
储存备用。锚定引物ＨＴ１０Ｍ（５ＡＡＧＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ
ＴＡ／Ｇ／Ｃ３ｐｒｉｍｅｒｓ）和随机引物（Ｂ０３０１Ｂ０３２６），购
自上海生工生物工程技术服务有限公司。
１．２．３ ＤＤＲＴＰＣＲ最佳反应体系的建立 以模板
（ｃＤＮＡ）浓度、锚定引物浓度（锚定引物浓度为随机引
物浓度的２倍）、ｄＮＴＰｓ浓度、镁离子浓度以及Ｔａｑ酶
用量为因素，设计５因素４水平正交试验方案（表
１）。各试验反应总体积均为２０μＬ。反应条件为，９４
℃预变性２ｍｉｎ，９４℃变性３０ｓ，４０℃退火２ｍｉｎ，７２
℃延伸４０ｓ，循环４０次，７２℃延伸７ｍｉｎ。４℃保存。
１．２．４ ＰＣＲ产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析［４］
取６μＬＰＣＲ产物加入４μＬ２×ＤＮＡ上样缓冲液，
在６％非变性聚丙烯酰胺胶垂直板上用１×ＴＢＥ电
泳缓冲液电泳，先于２５０Ｖ／１０Ｗ预电泳３０ｍｉｎ，然
后上样电泳４～５ｈ，直至溴酚蓝离胶底１５ｃｍ。电
泳完毕，取下胶板银染。在去离子水中漂 ２０～３０
ｍｉｎ，固定液（１０％乙醇＋０５％ＮａＡｃ）中固定３ｍｉｎ，
染色液（１０％乙醇 ＋０５％ＮａＡｃ＋０２％ＡｇＮＯ３）中
染色５ｍｉｎ，去离子水中漂洗３～５ｍｉｎ，显色液（３％
ＮａＯＨ＋０５％甲醛）中显５～１０ｍｉｎ。
１．２．５ 差异片段回收再扩增 对比染色结果，将仅
在处理中出现的差异条带切下，在去离子水中漂洗
２次后放于０５ｍＬ离心管中，加入５０μＬ无菌水，
沸水中煮１０ｍｉｎ，１３０００ｒ·ｍｉｎ－１离心１０ｍｉｎ，取５
μＬ上清液作为再扩增模板，进行二次ＰＣＲ扩增，扩
增体系同前。
２ 结果与分析
２．１ ＲＮＡ质量
ＲＮＡ的纯度和完整性对 ＤＤＲＴＰＣＲ的成功至
关重要。本试验采用用改进的异硫氰酸胍法提取，
提取的总ＲＮＡ用紫外测定表明Ａ２６０／Ａ２８０介于１９～
２０，２８Ｓ，１８Ｓ条带清晰、比值恰当，说明提取的总
ＲＮＡ质量良好，符合反转录的要求。总 ＲＮＡ用
ＤＮａｓｅⅠ（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＵＳＡ）消化去掉样品中的痕量
ＤＮＡ。纯化后的样品完整性好，纯度高可用于
ＤＤＲＴＰＣＲ。
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２．２ ＤＤＲＴＰＣＲ正交优化
本正交试验为５因素４水平，共１６个组合（表
１）。经非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染显色后，
半夏叶柄以及诱导形成试管小块茎后总 ＲＮＡ的
ＤＤＲＴＰＣＲ正交试验的扩增结果可以分为以下几种
情况（图１）。有扩增带，但带数少且重复性差，如
１，７，９号实验；有扩增带，带数多但重复性差，如２～
６，１０，１６号实验；有扩增带，带数较多且重复性较
好，如８，１１，１２，１４，１５号实验；有扩增带，带数很多，
谱带清晰，重复性好，如 １３号实验，片段大小
１００～１０００ｂｐ，主要集中在１００～５００ｂｐ，说明该组
合的扩增效率最高，综合正交试验的观察结果，１３
号为１６个处理组合中最佳的。
极差Ｒ的大小反映了该因素对扩增结果的影
表１ ＤＤＲＴＰＣＲ正交优化对差异条带多态性的影响
序号
Ａ
模板
／μｇ
Ｂ
锚定引物
／μｍｏｌ·Ｌ－１
Ｃ
ＭｇＣｌ２
／ｍｍｏｌ·Ｌ－１
Ｄ
ｄＮＴＰｓ
／μｍｏｌ·Ｌ－１
Ｅ
Ｔａｑ酶
／Ｕ
条带数 多态性
１ １０ ０５ １０ １００ ０２ ５ ＋
２ １０ １０ １５ １５０ ０４ ７
３ １０ １５ ２０ ２００ ０６ ９
４ １０ ２０ ２５ ２５０ ０８ ９
５ １５ ０５ １５ ２００ ０８ ８
６ １５ １０ １０ ２５０ ０６ ７
７ １５ １５ ２５ １００ ０４ ６ ＋
８ １５ ２０ ２０ １５０ ０２ １０
９ ２０ ０５ ２０ ２５０ ０４ ５ ＋
１０ ２０ １０ ２５ ２００ ０２ ８
１１ ２０ １５ １０ １５０ ０８ １０
１２ ２０ ２０ １５ １００ ０６ １０
１３ ２５ ０５ ２５ １５０ ０６ １５
１４ ２５ １０ ２０ １００ ０８ １０
１５ ２５ １５ １５ ２５０ ０２ １０
１６ ２５ ２０ １０ ２００ ０４ ７
注：＋多态性劣；表示中；表示良；表示优
１～１６．半夏叶柄条带；１′～１６′．半夏叶柄形成试管小块茎后的条带；Ｍｍａｒｋｅｒ
图１ 通过银染法得到差异显示图谱
响程度，正交试验结果的直观统计分析表明，在此次
正交试验所设计的各因素的浓度梯度下，Ｔａｑ酶对
ＤＤＲＴＰＣＲ扩增结果的影响最大，其次分别是模板，
ｄＮＴＰ，Ｍｇ２＋，引物。
利用Ｋ值可以确定每一个因素各水平的最佳
浓度，每个因素的４个 Ｋ值中最大的所对应的水平
即为该因素最佳浓度。此次试验的最佳处理组合为
ｄＮＴＰｓ１５μｍｏｌ·Ｌ－１，Ｔａｑ酶 ０６Ｕ，锚定引物 ２
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μｍｏｌ·Ｌ－１，随机引物１μｍｏｌ·Ｌ－１，Ｍｇ２＋２５０ｍｍｏｌ
·Ｌ－１，再加上１０×ｂｕｆｅｒ和２５μｇ的 ｃＤＮＡ模板。
这个处理组合从理论上来说应该是最理想的条件体
系。为了验证这个推论，用这个最佳处理组合和１３
号处理组合进行了比较，实验结果表明２个体系的
扩增结果都理想，但最佳处理组合扩增出的条带明
显比１３号处理组合扩增条带要多，谱带更清晰。所
以选用最佳处理组合为正式试验的 ＤＤＲＴＰＣＲ反
应体系。
为进一步探讨处理间及各因子水平之间的差
异，进行方差分析。结果表明，Ｔａｑ酶浓度对 ＤＤＲＴ
ＰＣＲ扩增结果的影响差异显著（Ｐ＜００５），其他因
素的影响均不显著。由此可见，Ｔａｑ酶是影响
ＤＤＲＴＰＣＲ扩增结果的主要因素，此结果与极差分
析的结果相吻合。
２．３ 差别显示片断的回收
ｃＤＮＡ差异片段从聚丙烯酰胺凝胶中切下后，
在去离子水中漂洗２次后放于０５ｍＬ离心管中，加
入５０μＬ无菌水，沸水中煮１０ｍｉｎ，１３０００ｒ·ｍｉｎ－１
离心１０ｍｉｎ，取５μＬ上清液作为再扩增模板，扩增
体系同 ＤＤＲＴＰＣＲ，ＰＣＲ重扩增产物进行２％琼脂
糖凝胶电泳（图２）。
图２ 差异表达片断ＰＣＲ重扩增的琼脂糖凝胶电泳
３ 讨论
虽然ＤＤＲＴＰＣＲ技术已广泛应用于差异表达基
因的研究，并且仍在不断地优化和改进，但是该技术
在实际应用中仍存在一些问题［９１１］。如假阳性差异
带过高，差异显示 ＰＣＲ时的差异带往往不能在
Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交和反向Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交中重现；其次，获得
的片段短，ｍＲＮＡ的平均长度１１２ｋｂ，差异显示ＰＣＲ
所得ｃＤＮＡ片段的长度多在１００～４００ｂｐ，平均长度
约３００ｂｐ，这些片段大多数位于ｍＲＮＡ３′端３００ｂｐ左
右的非翻译区，这段ｍＲＮＡ在不同生物间差别较大，
基因文库中常不包括这部分；另外，稀有ｍＲＮＡ差异
显示困难，ＰＣＲ高度灵敏，易扩增展示稀有ｍＲＮＡ片
段，这既是该方法的优点，也是该方法的不足之处，因
为稀有的ｍＲＮＡ在杂交时往往表达的信号较弱。
实验结果表明，模板浓度、引物浓度、ｄＮＴＰｓ浓
度、镁离子浓度以及 Ｔａｑ酶用量等因素对半夏试管
块茎的ＤＤＲＴＰＣＲ技术体系均有影响。
首先，模板的制备。严格把握实验材料，实验材
料间的遗传背景差异越小，假阳性越低，分离的基因
片段与性状间的相关性越强。所以实验材料间的遗
传背景是一致的，并且采用混合取样的方法来降低
取材对实验造成的假阳性。同时，为了防止ＤＮＡ污
染造成的假阳性，本试验中采用的 ＲＮＡ都经过无
ＲＮａｓｅ的ＤＮａｓｅⅠ消化，去除痕量的 ＤＮＡ污染。另
外，为了尽量减少低丰度 ＲＮＡ的丢失，反转录时起
始模板ＲＮＡ的投入量应保证不少于３μｇ［１２］。
其次，差显反应条件的优化。采用正交试验设
计的均衡分散、综合可比以及可伸可缩、效用明确的
特性［１３］。对影响 ＤＤＲＴＰＣＲ反应条件的主要因素
进行筛选，可缩短实验时间，较快地找到最优水平组
合。本研究采用正交法优化反应条件，充分考虑到
模板、引物、ｄＮＴＰｓ、镁离子等各成分的反应浓度以
及Ｔａｑ酶用量等因素在差异显示反应过程中的交互
作用，一次 ＰＣＲ反应即可确定最佳反应组合，这样
就简化了反应条件的优选程序，节省了时间，减少了
试剂用量，大大降低了实验成本。因此在新的试验
条件下建立和优化 ＤＤＲＴＰＣＲ反应体系，正交设计
是值得借鉴的方法。
最后，银染染色和二次扩增。核酸银染方法是
一种高灵敏度检测核酸变化的方法，银离子可以与
核酸形成稳定的复合物，其灵敏度可以检测皮克
（ｐｉｃｏｇｒａｍ）水平核酸的变化，与同位素放射自显影
方法具有相似的灵敏性，并避免同位素曝光切带的
盲目性及对人体和环境造成的危害，同时银染采用
聚丙烯酰胺凝胶电泳，对 ＰＣＲ扩增产物进行分离。
本实验表明，采用银染显示法不仅快速简便（从
ＲＮＡ提取到差异条带回收仅需３ｄ），而且凝胶上所
展示的条带直观可见，假阳性率很低，大大减少了验
证回收带的工作量。二次 ＰＣＲ扩增旨在将获得差
异片段最大限度扩增，以备进一步纯化、测序和克
隆。为了获得高产量，在ＤＤＲＴＰＣＲ反应条件基础
上，增加了 Ｔａｑ酶浓度和 ＰＣＲ循环数，此时，虽然
ＰＣＲ产量明显提高，但也出现了非特异性条带，这
与循环增加、相对低量的模板拷贝数和过高的引物
有关。但将引物降至０２～０４μｍｏｌ·Ｌ－１，退火温
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度升至４２～４４℃，能有效消除了非特异性条带，同
时得到较高产量的特异性扩增产物［１４］。
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Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔａｎｄｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆｓｌｉｖｅｒｓｔａｉｎｉｎｇｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｄｉｓｐｌａｙｏｆ
ｍｉｃｒｏｔｕｂｅｒｓｆｒｏｍＰｉｎｅｌｉａｔｅｒｎａｔａｉｎｖｉｔｒｏ
ＸＵＥＪｉａｎｐｉｎｇ１，ＨＵＡＮＧＹｕｅｑｉｎ１，２，ＸＵＹｏｕｍｉｎｇ２，ＴＩＡＮＺｈｅｎｇｄｏｎｇ２
（１．ＡｎｈｕｉＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＰｌａｎｔＲｅｓｏｕｒｃｅｓａｎｄＢｉｏｌｏｇｙ，ＳｃｈｏｏｌｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ，ＨｕａｉｂｅｉＣｏａｌＩｎｄｕｓｔｒｙ
Ｔｅａｃｈｅｒｓ′Ｃｏｌｅｇｅ，Ｈｕａｉｂｅｉ２３５０００，Ｃｈｉｎａ；
２．ＣｏｌｅｇｅｏｆＨｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ＆ＦｏｒｅｓｔｒｙＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＨｕａｚｈｏｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｈａｎ４３００７０，Ｃｈｉｎａ）
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙ，ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｄｅｓｉｇｎｗａｓｕｓｅｄｔｏｏｐｔｉｎｉｚｅＤＤＲＴＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｏｎＰｉｎｅｌｉａｔｅｒｎａｔａ
ｍｉｃｒｏｔｕｂｅｒｓｉｎｖｉｔｒｏｉｎｆｉｖｅｆａｃｔｏｒｓｆｏｕｒｌｅｖｅｌｓｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｍｅｔｈｏｄ：Ｐ．ｔｅｒｎａｔａｓｔｅｍｓａｎｄｍｉｃｒｏｔｕｂｅｒｓｉｎｖｉｔｒｏｗｅｒｅｓｅｌｅｃｔｅｄａｓｅｘ
ｐｌａｎｔｓ．ＴｈｅｅｆｅｃｔｓｏｆｆｉｖｅｋｉｎｄｓｏｆｆａｃｔｏｒｓｗｅｒｅｓｔｕｄｉｅｄｂｙｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｄｅｓｉｇｎｍｅｔｈｏｄｉｎｃｌｕｄｉｎｇｅｍｐｌａｔｅｃＤＮＡ，Ｍｇ２＋，ｄＮＴＰｓ，ｐｒｉｍｅｒｓ
ａｎｄＴａｑＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，ａｎｄｉｎｏｒｄｅｒｔｏｅｓｔａｂｌｉｓｈｔｈｅｏｐｔｉｍｕｍＤＤＲＴＰＣＲｓｙｓｔｅｍｏｆＰ．ｔｅｒｎａｔａｍｉｃｒｏｔｕｂｅｒｓｉｎｖｉｔｒｏ．Ｒｅｓｕｌｔａｎｄ
Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：ＡｓａｔｉｓｆａｃｔｏｒｙＤＤＲＴＰＣＲｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓｙｓｔｅｍｆｏｒＰ．ｔｅｒｎａｔａｍｉｃｒｏｔｕｂｅｒｓｉｎｖｉｔｒｏｗｉｔｈｄｅｓｉｒａｂｌｅｒｅｐｅａｔａｂｉｌｉｔｙａｎｄｐｏｌｙｍｏｒ
ｐｈｉｃｂａｎｄｓｗａｓｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ．Ｉｎａｔｏｔａｌｖｏｌｕｍｅｏｆ２０μＬＤＤＲＴＰＣＲｓｙｓｔｅｍ，ｉｔｃｏｎｔａｉｎｅｄ１０×ｂｕｆｅｒ，１５０μｍｏｌ·Ｌ－１ｄＮＴＰｓ，２μｍｏｌ
·Ｌ－１ａｎｃｈｏｒｐｒｉｍｅｒ，１μｍｏｌ·Ｌ－１ａｒｂｉｔｒａｒｙｐｒｉｍｅｒ，２５ｍｍｏｌ·Ｌ－１Ｍｇ２＋，０６ＵＴａｑＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅａｎｄ２５μｇｔｅｍｐｌａｔｅｃＤ
ＮＡ．ＴｈｅｅｆｅｃｔｏｆｔｈｅｆｉｖｅｆａｃｔｏｒｓｗａｓｉｎｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆＴａｑＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ＞ｔｅｍｐｌａｔｅｃＤＮＡ＞ｄＮＴＰｓ＞Ｍｇ２＋＞Ｐｒｉｍｅｒｓ．Ｔｈｅｏｐｔｉｍｕｍ
ＤＤＲＴＰＣＲｓｙｓｔｅｍｗｉｌｐｒｏｖｉｄｅｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃｒｅｆｅｒｅｎｃｅｂａｓｉｓｆｏｒｓｔｕｄｙｉｎｇｅｆｅｃｔｉｎｇｃｈａｒａｃｔｅｒｏｆＰ．ｔｅｒｎａｔａｍｉｃｒｏｔｕｂｅｒｓａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｇｅｎｅｓ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．
［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］ Ｐｉｎｅｌｉａｔｅｒｎａｔａ；ｍｉｃｒｏｔｕｂｅｒｓ；ＤＤＲＴＰＣＲ；ｐｏｓｉｔｉｖｅｃｒｏｓｓｔｅｓｔ；ｎｏｎｄｅｎａｔｕｒｉｎｇＰＡＧＥ；ｓｉｌｖｅｒｓｔｒａｉｎｉｎｇ
［责任编辑 吕冬梅］
·４７１２·
第３３卷第１９期
２００８年１０月
中 国 中 药 杂 志
ＣｈｉｎａＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭａｔｅｒｉａＭｅｄｉｃａ
Ｖｏｌ．３３，Ｉｓｓｕｅ １９
Ｏｃｔｏｂｅｒ，２００８