全 文 ：水蛭抗凝血活性成分的研究
钟 山，杨得坡１，崔 征２
（１．中山大学 药学院，广东 广州 ５１００８０；
２．沈阳药科大学 中药学院，辽宁 沈阳 １１００１６）
［摘要］ 目的：研究水蛭的抗凝血成分。方法：以血浆复钙时间为指标，应用ＳｅｐｈａｄｅｘＤＥＡＥＡ－５０阴离子交
换树脂色谱、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－２５和ＳｅｐｈａｄｅｘＬＨ－２０凝胶过滤色谱及反相高压液相色谱技术分离纯化。结果：得到３
个抗凝血活性多肽，其中化合物１，２在自然条件下互相转化，它们的相对分子质量分别为７１００和５５３１；采用
ＨＰＬＣ及ＳＤＳＰＡＧＥ鉴定了化合物３的纯度，采用ＭＡＬＤＩＴＯＦＭＳ法测定出其相对分子质量为８６０８，并测定了其
氨基酸组成。结论：推测化合物３为首次分离得到的抗凝血多肽，命名为蚂蟥多肽（ｗｈｉｔｍａｎｉｎ）。
［关键词］ 蚂蟥；ＭＡＬＤＩＴＯＦＭＳ；蚂蟥多肽
［中图分类号］Ｒ２８４．１ ［文献标识码］Ａ ［文章编号］１００１５３０２（２００８）２３２７８１０４
［收稿日期］ ２００８０２２１
［基金项目］ 广东省自然科学基金（８４５１００８９０１０００１４７）
［通讯作者］ 钟山，Ｔｅｌ：（０２０）８７３３３１５９，Ｆａｘ：（０２０）
８７３３３１５９，Ｅｍａｉｌ：ｌｉｚｈｏｎｇｓｈａｎ１００＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ
宽体金线蛭 ＷｈｉｔｍａｎｉａｐｉｇｒａＷｈｉｔｍａｎ（又名蚂
蟥）为蚂蟥属 Ｗｈｉｔｍａｎｉａ动物，是民间水蛭品种之
一，分布于河北、山东、安徽、江苏、江西、湖北、湖南
等地，药用部位为干燥虫体，具有活血化瘀的功效。
全世界共有水蛭３００多种，目前已知水蛭中的抗凝
成分主要为一些小分子肽类［１７］，其中以欧洲医用水
蛭中所含有的水蛭素（ｈｉｒｕｄｉｎ）研究最为透彻。但
是，我国广泛分布的２种不吸血的水蛭：宽体金线蛭
和柳叶蚂蟥Ｗ．ａｃｒａｎｕｌａｔａ，其活性成分一直未见研
究报道，尤其是作为我国水蛭商品主流的宽体金线
蛭，其活性成分目前仍不清楚，其干燥虫体入药的作
用机制更是未知［８］。因此，本研究对水蛭干燥虫体
中的抗凝血活性成分进行了追踪分离，得到３个活
性多肽。
１ 仪器与试药
ＨＰＬＣ系统包括 ＬＣ－１０ＡＴ高压输出泵（日本
岛津公司）、ＳＰＤ－１０Ａ紫外可变波长检测器（日本
岛津公司）、色谱柱恒温箱（大连中汇达科学仪器有
限公司）及 Ａｎａｓｔａｒ色谱工作站（大连）。冷冻干燥
系统包括ＦＤ－１冷冻干燥机（郑州长城科工贸有限
公司）和２ＸＺ－２型旋片真空泵（浙江黄岩求精真空
泵厂）。ＳＺ－９６型自动纯水蒸馏器（上海亚荣生化
仪器厂），Ｓｐｅｃｔｒｕｍｌａｂ５２紫外分光光度计（上海分
析仪器厂），Ｊ２－ＨＳ型高速冷冻离心机（德国 Ｂｅｃｋ
ｍａｎ公司），Ｒｅｆｌｅｘ－Ⅲ型 ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ仪（德
国Ｂｅｃｋｍａｎ公司）。
ＤＥＡＥＡ－５０阴离子交换树脂、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－２５
凝胶和 ＳｅｐｈａｄｅｘＬＨ－２０凝胶（瑞典 Ｐｈａｍａｃｉａ公
司），色谱纯乙腈（山东禹王实业有限公司），其他试
剂均为国产分析纯。
水蛭购于湖南省长沙县药材公司，为直接晒干
品。经沈阳药科大学中药学院孙启时教授鉴定为宽
体金线蛭Ｗ．ｐｉｇｒａ，药材标本（０５０４９６０２）保存于沈
阳药科大学中药标本馆。新西兰种大白兔（辽动实
合字０４５号）为沈阳药科大学动物室提供。
２ 化合物的分离
２．１ 抗凝血活性成分的提取及分离 参照水蛭素
的提取方法［３］，将干燥的水蛭药材４６０ｇ粉碎后用
４０％的丙酮４℃冷浸４次，每次２４ｈ。提取液４０℃
减压浓缩，再分别用６０％和８５％的乙醇进行沉淀，
得６０％乙醇沉淀（Ａ）２４２ｇ和８５％乙醇沉淀（Ｂ）
４４８ｇ，冷冻干燥。将 Ａ和 Ｂ按相当于原药材２％
的质量浓度配成生理盐水（ＮＳ）溶液，分别测定血浆
复钙时间（ＰＲＴ），具体操作参照文献［９］。Ｂ部分具
有较强的抗凝活性见表１。
２．２ 抗凝血活性成分的跟踪分离 将 Ｂ用缓冲液
Ⅰ（ｐＨ６８的磷酸缓冲液，含 ００１ｍｏｌ·Ｌ－１的
ＮａＣｌ）配制成４５ｇ·Ｌ－１的溶液，１０００×ｇ离心 １０
ｍｉｎ。ＤＥＡＥＡ５０谱柱色（１６ｍｍ×５０ｃｍ）预先用缓
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表１ 分离纯化各步骤的ＰＲＴ测定结果（ｎ＝５）
Ｎｏ ＰＲＴ／ｓ
相对
ＰＲＴ
活性回
收率／％
ＮＳ ２３６０±６３ １０００
粗提液 ３０４７±２８１） １２９１ １００
Ａ ２４５６±６７ １０３８
Ｂ ３２３８±７３１） １３７２ ９０７
Ｆ１ ３４７２±４９１） １４７１ ７７５
Ｆ２ ２３６６±７５ １００２
Ｆ３ ２４４２±４５ １０３５
Ｆ４ ２４６２±３７ １０４３
Ｆ１１ ２４９６±５９ １０５８
Ｆ１２ ３６４８±５１１） １５４６ ７００
Ｆ１２１ ２９８４±４２１） １２６４ １８１
Ｆ１２２ ２４８４±５１ １０５２
Ｆ１２３ ３８４４±５２１） １６２９ ４３２
Ｆ１２４ ２５３６±３６ １０７４
Ｆｒ．１２３１ ２４７６±５７ １０４９
Ｃｏｍｐ．３ ４２０２±４０１） １７８０ ４０６
注：１）Ｐ＜０００１与生理盐水比较
冲液Ⅰ平衡６ｈ。每次上样１０ｍＬ，先用缓冲液Ⅰ洗
脱至洗脱液２８０ｎｍ无紫外吸收，再继续以００１～１
ｍｏｌ·Ｌ－１的 ＮａＣｌ梯度洗脱 １０ｈ，流速为 ５０ｍＬ·
ｈ－１。同时用试管收集流分（每管６ｍＬ），在２８０ｎｍ
处测定紫外吸收度。以吸收度为纵坐标对试管号做
ＸＹ散点图，得洗脱图１。由图１可见，共得４个流
分：Ｆ１，Ｆ２，Ｆ３，Ｆ４，分别测定它们的血浆复钙时间，
结果表明Ｆ１的活性最强，见表１。
图１ ８５％乙醇沉淀的ＤＥＡＥＡ５０色谱图
用００１ｍｏｌ·Ｌ－１的ＮａＣｌ溶液将Ｆ１配制成４５
ｇ·Ｌ－１的溶液，１０００×ｇ离心１０ｍｉｎ。ＳｅｐｈａｄｅｘＧ
－２５色谱柱（２６ｍｍ×１００ｃｍ）预先用００１ｍｏｌ·
Ｌ－１的ＮａＣｌ溶液平衡６ｈ，上样２０ｍＬ，流速为６０ｍＬ
·ｈ－１，收集流分，并测定吸收度，得洗脱图２。由图
２可见，Ｆ１被分离为Ｆ１１和Ｆ１２。活性测定结果表
明Ｆ１２活性较强，见表１，将其冷冻干燥，备用。
将 Ｆ１２溶解于 ００１ｍｏｌ·Ｌ－１的氨水中，
１０００×ｇ离心 １０ｍｉｎ。ＳｅｐｈａｄｅｘＬＨ－２０色谱柱
（２０ｍｍ×５０ｃｍ）预先用００１ｍｏｌ·Ｌ－１的氨水平衡
６ｈ，每次加样０５ｍＬ，洗脱流速２０ｍＬ·ｈ－１。收集
图２ Ｆ１的ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－２５色谱图
流分，并测定吸收度，得如图３所示的４个流分，其
中的Ｆ１２１和 Ｆ１２３都具有较强的活性。富集这
２个流分，待进一步纯化。
图３ Ｆ１２的ＳｅｐｈａｄｅｘＬＨ－２０色谱图
采用ＨＰＬＣ法纯化Ｆ１２１，由于样品量少，选择
反相色谱分析柱（ＨｙｐｅｒｓｉｌＣ１８柱，４６ｍｍ×２００ｍｍ，
５μｍ）。流动相为乙腈水（２∶９８）（含００３％ ＫＨ２
ＰＯ４，用３６％的醋酸调ｐＨ３８），将Ｆ１２１用流动相
溶解，每次进样２０μＬ，流速为１ｍＬ·ｍｉｎ－１，柱温为
室温，于２８０ｎｍ处检测紫外吸收峰，色谱图见图４。
手动收集色谱图中的２个峰，得化合物１，２，由于这
２个化合物的量太少，没有进行活性测定，但由 Ｆ１
２１的ＨＰＬＣ制备色谱图中只显示有化合物１，２，推
测这２个化合物均具有抗凝血活性或至少１个有抗
凝活性。
图４ Ｆｒ．１２１的制备ＨＰＬＣ图
采用 ＨＰＬＣ纯化 Ｆ１２３，色谱柱为反相半制备
柱（ＨｙｐｅｒｓｉｌＣ１８柱，１０ｍｍ×２００ｍｍ，５μｍ），色谱图
见图５，手动收集保留时间为 １５ｍｉｎ的化合物 ３。
该流分显示出强的抗凝活性，见表１。
３ 结果
３．１ 化合物１，２的 ＨＰＬＣ分析 ＭＡＬＤＩＴＯＦＭＳ分
析 在２．２色谱条件下，对化合物１进行分析，在同
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图４中化合物１，２相同的位置上都出现了吸收峰，
但化合物１的吸收峰远大于化合物２的吸收峰。
对化合物２进行研究所得的色谱图中，在与图
４中化合物 １和 ２相同的位置上也都出现了吸收
峰，但化合物２的吸收峰远大于化合物１的吸收峰，
推测化合物１，２在自然条件下即可发生互变，或者
是这２个化合物纯度不够高。为了对这２个化合物
进行进一步的研究，取化合物２进行了 ＭＡＬＤＩＴＯＦ
质谱测定（化合物１的量太少）：将样品溶解在乙腈
０１％三氟乙酸（６０∶４０）中，然后将该溶液与等体积
的基质溶液［芥子酸溶于５０％的乙腈（含０１％）的
三氟乙酸］中，质量浓度为５ｇ·Ｌ－１］混合，取该溶
液共结晶，待溶剂挥干后，用 ＭＡＬＤＩＴＯＦＭＳ仪进
行分析，化合物１，２的相对分子质量分别为７１００
和５５３１。
如果两者在自然条件下能相互转化，但它们的
相对分子质量却相差１５６９。同时由于化合物１和
２茚三酮反应和ｍｏｌｉｓｈ反应均为阳性，因此，推测化
合物１，２可能是相对分子质量为１５６９的糖链在１
个肽链上结合或解离的两种状态。因为样品量较
少，留待进一步累积样品后研究。
３．２ 化合物３的性质分析 在２．２色谱条件下，测
定化合物３的纯度大于９８％。采用１６５％的分离
胶对化合物３进行 ＳＤＳＰＡＧＥ分析，考马斯亮蓝染
色，化合物３为一电泳纯的多肽，相对分子质量在
８１×１０３～１０４×１０３。ＭＡＬＤＩＴＯＦＭＳ测定化合
物３的相对分子质量为８６０８。
采用酸水解法测定化合物３的氨基酸组成。将
化合物３置于硅化试管中干燥后，在１０８℃恒沸盐
酸水解２４ｈ，水解液用氨基酸分析仪进行分析，结果
为：Ａｓｐ５１３（５）；Ｔｈｒ２３３（２）；Ｓｅｒ５５８（６）；Ｇｌｕ
８３９（８）；Ｐｒｏ０７８（１）；Ｇｌｙ９６８（１０）；Ａｌａ３４７（３）；
Ｖａｌ２８２（３）；Ｍｅｔ０９７（１）；Ｉｌｅ２０４（２）；Ｌｅｕ４０５
（４）；Ｔｙｒ２３４（２）；Ｐｈｅ３３５（３）；Ｈｉｓ０９５（１）；Ｌｙｓ
２９０（３）；Ａｒｇ２９８（３）。此外，在 Ｈｉｓ和 Ｌｙｓ之间存
在１个大于２０的未知峰。
Ａｓｎ和Ｇｌｎ在酸水解条件下被分别转化为 Ａｓｐ
和Ｇｌｕ，所以Ａｓｎ和 Ｇｌｎ均以 Ａｓｐ和 Ｇｌｕ计算，合计
５７个氨基酸残基，相对分子质量为６０９７５８１。各
氨基酸的比例与水蛭素系列的组成非常接近，只是
Ａｓｐ的含量较少。Ｃｙｓ在酸水解条件下破坏严重，且
与茚三酮显色反应不明显，因此检测不出。考虑到
２０余种水蛭素均含有６～７个 Ｃｙｓ组成３个分子内
键桥，推测化合物３中 Ｃｙｓ的个数可能也为６，与测
定出的５７个氨基酸残基相加后，为６３个氨基酸残
基，肽链相对分子质量为 ６７１０４０１。而 ＭＡＬＤＩ
ＴＯＦＭＳ所测相对分子质量为 ８６０８，两者相差
１８９８。由于化合物３的 Ｍｏｌｉｓｈ反应为阳性，因此，
推测６３个氨基酸残基形成的肽链上连有１个１８９８
的糖链。
目前为止，文献中没有报道过从水蛭中分离出
相对分子质量为８６０８的多肽，而且没有文献报道
过从水蛭中分离出具有糖基化的多肽。因此，推测
化合物３为１个新的抗凝多肽，将其命名为蚂蟥多
肽（ｗｈｉｔｍａｎｉｎ）。
４ 讨论
本研究从宽体金线蛭中分得３个抗凝血活性多
肽，相对分子质量均在１万以下，均属于糖蛋白类，
推测该品种蚂蟥中还含有此类糖蛋白类物质。其中
ｗｈｉｔｍａｎｉｎ的氨基酸组成与水蛭素具有很大的同源
相近性：氨基酸数目相近，赖氨酸和组氨酸的数目一
致，都不含色氨酸，蛋氨酸的含量都很低，但与水蛭
素不同的是ｗｈｉｔｍａｎｉｎ中精氨酸和丙氨酸的含量较
高。这一方面说明各品种水蛭抗凝血活性成分性质
的相近性，另一方面也为以后研究ｗｈｉｔｍａｎｉｎ的结构
以及其他品种水蛭的化学成分提供参考。
本研究的起始材料为水蛭的干燥药材，与以往
文献报道中所用的新鲜水蛭或唾液不同，这说明水
蛭中所含的抗凝血物质不一定只存在于新鲜唾液
中，而应该是体内本身所含有的，并且其性质应该相
对比较稳定，这样才能在经过干燥和长期的储存后
保持良好活性。
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ＳｔｕｄｉｅｓｏｎａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓｉｎｄｒｉｅｄＷｈｉｔｍａｎｉａｐｉｇｒａ
ＺＨＯＮＧＳｈａｎ１，ＹＡＮＧＤｅｐｏ１，ＣＵＩＺｈｅｎｇ２
（１．ＳｃｈｏｏｌｏｆＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＳｕｎＹａｔｓｅｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ５１００８０，Ｃｈｉｎａ；
２．ＳｃｈｏｏｌｏｆＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅＭａｔｅｒｉａＭｅｄｉｃａ，ＳｈｅｎｙａｎｇＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈｅｎｙａｎｇ１１００１６，Ｃｈｉｎａ）
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏｓｔｕｄｙｔｈｅａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓｉｎｄｒｉｅｄｌｅｅｃｈ（ＷｈｉｔｍａｎｉａｐｉｇｒａＷｈｉｔｍａｎ）．Ｍｅｔｈｏｄ：Ｔｈｅ
ｐｌａｓｍａｒｅｃａｌｃｉｆｉｃａｔｉｏｎｔｉｍｅ（ＰＲＴ）ａｓｉｎｄｅｘ，ｔｈｅｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓｗｉｔｈａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔａｃｔｉｖｉｔｙｗｅｒｅｉｓｏｌａｔｅｄａｎｄｐｕｒｉｆｉｅｄｂｙａｎｉｏｎｅｘｃｈａｎｇｅ
ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙｏｎＳｅｐｈａｄｅｘＤＥＡＥＡ５０，ｇｅｌｐｅｒｍｅａｔｉｏｎｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙｏｎＳｅｐｈａｄｅｘＧ２５ａｎｄＳｅｐｈａｄｅｘＬＨ２０ｃｏｌｕｍｎｓ，ａｎｄｔｈｅｎ
ｒｅｖｅｒｓｅｄｐｈａｓｅｈｉｇｈｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙｓｕｃｃｅｓｓｉｖｅｌｙ．Ｒｅｓｕｌｔ：Ｔｈｒｅｅａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓｗｅｒｅｉｓｏｌａｔｅｄａｎｄｐｕｒｉ
ｆｉｅｄ．Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ１ａｎｄ２ｃａｎｂｅｔｒａｎｓｌａｔｅｄｅａｃｈｏｔｈｅｒｉｎｎａｔｕｒａｌｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，ａｎｄｔｈｅｉｒｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔｓａｒｅ７１００ａｎｄ５５３１，ｒｅｓｐｅｃ
ｔｉｖｅｌｙ．Ｃｏｍｐｏｕｎｄ３ｗａｓｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄａｓａｐｕｒｅｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｂｙＨＰＬＣａｎｄＳＤＳＰＡＧＥ，ａｎｄｉｔｓｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔｗａｓｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄａｓ８６０８
ｂｙＭＡＬＤＩＴＯＦＭＳ．Ｔｈｅａｍｉｎｏａｃｉｄｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｏｆｃｏｍｐｏｕｎｄ３ｗａｓａｌｓｏｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｃｏｍｐｏｕｎｄ３ｗａｓｉｎｆｅｒｅｄｔｏｂｅａ
ｎｏｖｅｌａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ，ａｎｄｎａｍｅｄｗｈｉｔｍａｎｉｎ．
［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］ Ｗｈｉｔｍａｎｉａｐｉｇｒａ；ＭＡＬＤＩＴＯＦＭＳ；ｗｈｉｔｍａｎｉｎ
［责任编辑 王亚君］
［收稿日期］ ２００８０４１１
［基金项目］ 西安理工大学科研创新项目（１０８２１０５１１）
［通讯作者］ 何仰清，Ｔｅｌ：（０２９）８２０６６３６０，Ｅｍａｉｌ：ｈｙｑ７９７８８６３
＠１６３．ｃｏｍ
毛梗翠雀花化学成分的研究
何仰清１，马占营２，杨 谦１，余晓皎１，高黎明３，姚秉华１
（１．西安理工大学 应用化学系，陕西 西安 ７１００５４；
２．咸阳师范学院 化学系，陕西 咸阳 ７２１０００；
３．西北师范大学 化学化工学院，甘肃 兰州 ７３００７０）
［摘要］ 目的：研究毛梗翠雀花化学成分。方法：柱色谱分离，根据波谱数据鉴定化合物结构。结果：从全草
氯仿部位分离得到６个化合物，分别鉴定为 ｓｉｗａｎｉｎｅＥ（１），异阿替生（ｉｓｏａｔｉｓｉｎｅ，２），１２ｅｐｉｎａｐｅｌｉｎｅ（３），乌头原碱
（ａｃｏｎｉｎｅ，４），ａｊａｄｅｌｐｈｉｎｉｎｅ（５）和β谷甾醇（６）。结论：化合物１～６均为首次从该植物中分离得到。
［关键词］ 翠雀属；毛梗翠雀花；二萜生物碱
［中图分类号］Ｒ２８４．１ ［文献标识码］Ａ ［文章编号］１００１５３０２（２００８）２３２７８４０３
毛梗翠雀花属于毛茛科翠雀属植物，广泛分布 于陕西东南部［１］，全草可入药，具有镇痛、镇静、祛
风湿、解热等功效，民间用于治疗跌打损伤、止咳平
喘等疾病［２］。有关该植物化学成分的研究迄今未
见文献报道，因此，对毛梗翠雀花全草的化学成分进
行了研究，从氯仿部位中分离得到６个化合物，皆为
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第３３卷第２３期
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