全 文 :毛细管电泳电化学检测法研究肉苁蓉多糖的单糖组成
龚立冬 o曹玉华 3 o侯建霞 o汪 云
k江南大学 化学与材料工程学院 o江苏 无锡 utwtuul
≈收稿日期 ussy2sz2uz
≈通讯作者 3 曹玉华 oר¯}ksxtsl{x{ss|v|o∞2°¤¬¯}¼∏«∏¤¦¤²
¼¤«²²q¦²°q¦±
肉苁蓉为列当科肉苁蓉属多年生高等寄生植
物 o具有补肾壮阳 !填精补髓 !养血润燥 !悦色延年之
功效 ≈t ∀本属植物全世界约有 t{个种 o我国约有 w
种 t变种 o分别为肉苁蓉 Χιστανχηε δεσερτιχολα ≠ q ≤q
¤!盐生肉苁蓉 Χ. σαλσαk≤qq ¼¨ql q
¦¨®o管
花肉苁蓉 Χ. τυβυλοσαk≥¦«¨ ±®l q • ¬ª«·!白花盐肉
苁蓉 Χ. σαλσα √¤µq αλβιφλορα °qƒq×∏¨·q≤q²∏及沙
苁蓉 Χ. σινενσισ q
¦¨®o5中药大辞典 6收载有 v
种 }盐生肉苁蓉 !肉苁蓉 !迷肉苁蓉 Χ. αµ βιγυα
k
ª¨ ql
q
¦¨®≈u ∀ 5中国药典 6仅收载了肉苁蓉
Χ. δεσερτιχολα为药用肉苁蓉 ≈v ∀由于肉苁蓉珍贵稀
少 o目前有大量人工栽培的代用品 ∀
肉苁蓉中的主要活性成分为苯乙醇苷类化合
物 !肉苁蓉多糖 !甜菜碱 !∆2甘露醇等 ≈w ∀对肉苁蓉
多糖的研究大都集中在多糖的提取分离 !总糖含量
测定及其理化性质的研究方面 ≈xoy ∀对肉苁蓉多糖
的单糖组成及其摩尔比研究的报道少见 ≈t ∀常见
的多糖中单糖含量测定的方法有薄层色谱法 !气相
色谱法 !分光光度法 !高效液相色谱法 !毛细管电泳 2
紫外检测等 ≈z2tt o这些方法往往检测灵敏度不高 o或
需柱前衍生 o操作繁琐 ∀毛细管电泳 2电化学检测系
统 k≤∞2∞⁄l对糖类的测定具有快速 !灵敏 !选择性好
的特点 o由于糖类物质在结构上具有多羟基的特性 o
碱性条件下 o易在铜电极上发生氧化还原反应 o使用
电化学检测器进行检测 o不需衍生直接测定 ≈tu o可
以得到较高的灵敏度 ∀且采用铜电极 o安培检测糖
类物质 o具有高的选择性 o肉苁蓉中大多数物质在铜
电极上没有响应 o肉苁蓉粗多糖不需严格纯化 ∀本
研究采用 ≤∞2∞⁄对不同种肉苁蓉粗多糖中单糖的
组成及其各单糖相对摩尔比进行了初步的研究 ∀
1 仪器和试剂
毛细管电泳 2电化学检测系统 k≤∞2∞⁄l为自组
装 o包括 ? vs ®∂高压电源 k上海原子核研究所 lo
≥
≤ p v⁄安培检测器 k
¬²¤±¤¯¼·¬¦¤¯ ≥¼¶·¨°¶o≥ lo
• pusss色谱软件 k上海千谱软件有限公司 l∀长
熔融石英毛细管 kzs ¦°oux Λ°o河北永年仪器厂 l∀
半乳糖 !葡萄糖 !鼠李糖 !阿拉伯糖 !果糖 !蔗糖 !
棉子糖均为分析纯 k上海试剂一厂 l∀其他试剂均
为分析纯 o水为重蒸水 ∀
半乳糖 !葡萄糖 !鼠李糖 !阿拉伯糖 !果糖 !蔗糖 !
棉子糖标准储备液质量浓度分别为 | ≅ tspw o|1u ≅
tspw o|1u ≅ tspw oz1x ≅ tspw o| ≅ tspw ot ≅ tspv ot ≅
tspv ª# °pt o用蒸馏水配制 o再用运行缓冲液稀释
至所需浓度 ∀
本试验所用药材为内蒙产肉苁蓉 !新疆产管花
肉苁蓉 !人工栽培管花肉苁蓉均由洛阳高新开发区
陆生天然植物研究所王忠东教授鉴定 ∀具体药材来
源见表 t∀
表 t 药材产地及来源
品种 来源 产地
Χιστανχηε δεσερτιχολα 内蒙古 无锡中药采购供应站
Χ. τυβυλοσα 新疆 甘肃兰州安泰堂药店
Χ. τυβυλοσα 新疆 新疆民丰浴丰生态科技有限公司
k人工栽培 l
2 方法
2q1 肉苁蓉粗多糖的制备 将肉苁蓉原药材切成
片状 o置于 ys ε 烘箱中烘 ys °¬±∀药材粉碎 o精确
称取药材约 us ªo置 txs °锥形瓶中 o加入 xs °
石油醚 kys ∗ |s ε l超声提取约 us °¬±o过滤得滤
渣 o重复以上操作 v到 w次 ~滤渣加入 {sh乙醇 xs
°o超声提取 us °¬±o过滤得滤渣 o重复此操作 v到
w次 ~滤渣挥干溶剂后 o置 uxs °圆底烧瓶中 o加入
蒸馏水 txs °o|s ε 水浴加热 t «o超声提取 vs
°¬±o过滤 o重复操作 w次 o滤液合并约 yss °减压
浓缩至约 tss °o活性碳脱色 o以 ¶¨√¤ª法脱蛋白 o
此过程重复数次 o至静置后无蛋白析出 ∀浓缩溶液
至 us °o加入乙醇至溶液含醇量达 {sh以上 o静置
过夜析出固体物质 o过滤 o沉淀相继以无水乙醇 !丙
#vzsu#
第 vu卷第 t|期
ussz年 ts月
中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλοφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
∂ ²¯qvuo ¶¶∏¨ t|
¦·²¥¨ µo ussz
酮 !乙醚反复洗涤干燥 o即得肉苁蓉棕褐色粗多糖固
体 ∀ ys ε 烘干备用 ∀
2q2 肉苁蓉粗多糖的水解方法 采用盐酸 !硫酸稀
酸溶液进行肉苁蓉粗多糖的水解研究 o以不同比例
的盐酸 !硫酸混合 o在 tss ε 水浴条件下水解 ∀
方法 t 肉苁蓉多糖 s1sy ªo加入 y °u °²¯#
pt硫酸及 u °蒸馏水 o在沸水浴下回流水解 x «o
取水解液 u °o用氢氧化钠中和至 ³ z ∗ {o然后以
s1t °²¯# pt氢氧化钠稀释至 y °o测定前加运行
缓冲液稀释 ∀
方法 u 肉苁蓉多糖 s1sy ªo加入 w °t °²¯#
pt硫酸及 w °t °²¯ # pt盐酸 o沸水浴下回流水
解 y «o以下步骤同方法 t∀
方法 v 肉苁蓉多糖 s1sy ªo加入 v °t °²¯#
pt盐酸 ou °u °²¯ # pt硫酸及 v °蒸馏水 o沸
水浴下回流水解 { «o以下步骤同方法 t∀
方法 w 肉苁蓉多糖 s1sy ªo加入 u °t °²¯#
pt盐酸 ow °s1x °²¯ # pt硫酸及 u °蒸馏水 o
沸水浴下回流水解 w «o以下步骤同方法 t∀
方法 x 肉苁蓉多糖 s1sy ªo加入 y °t °²¯#
pt盐酸 ou °蒸馏水 o沸水浴下回流水解 y «o以下
步骤同方法 t∀
2q3 毛细管电泳测定方法 使用自组装的 ≤∞2∞⁄
装置 o电化学检测为三电极体系 }s1vu{ °°直径的
铜圆盘电极为工作电极 o饱和甘汞电极为参比电极 o
铂丝为辅助电极 ∀铜电极使用前先用砂纸打磨再超
声清洗 u °¬±o通过三维定位调节器时使之与毛细管
出口在一条直线上 o并尽可能靠近毛细管的末端 ∀
试验条件 }分离电压 ty ®∂ ~进样时间 y ¶~电极电位
s1yx ∂ ~电泳运行液 s1t °²¯# pt氢氧化钠 ∀
3 结果与讨论
3q1 肉苁蓉多糖中单糖组分的鉴定 半乳糖
kx1w ≅ tspx ª# °pt l!葡萄糖 kx1x ≅ tspx ª#
°pt l!鼠李糖 kx1x ≅ tspx ª# °pt l!阿拉伯糖
kw1x ≅ tspx ª# °pt l!果糖 kx1w ≅ tspx ª# °pt l
以及蔗糖 kx1y ≅ tspx ª# °pt二糖 l!棉子糖 ky ≅
tspx ª# °pt三糖 l在上述电泳条件下进行 ≤∞2∞⁄
测定 o混合标样的 ≤∞图谱如图 t所示 ∀
将肉苁蓉粗多糖按 2q2所述方法进行水解 o相
同电泳条件下测定 o粗多糖水解液的 ≤∞2∞⁄图谱见
图 u∀
以加入单糖标准溶液记录峰高及峰面积变化的
方法对水解液中的单糖组分的进行定性 o确定内蒙
产正品肉苁蓉 Χ. δεσερτιχολα粗多糖水解液中的单糖
为半乳糖 !葡萄糖 !鼠李糖 !阿拉伯糖 !果糖 ~新疆产
管花肉苁蓉 Χ. τυβυλοσα粗多糖水解液中单糖为半
乳糖 !葡萄糖 !鼠李糖 !果糖 ~新疆人工栽培管花肉苁
蓉 Χ. τυβυλοσα粗多糖水解液中的单糖为半乳糖 !葡
萄糖 !鼠李糖 ∀结果表明 ov种样品肉苁蓉粗多糖的
单糖种类有明显差异 ∀
3q2 x种单糖定量方法研究
3q2q1 精密度试验 对 x种单糖混合标准溶液重
复进样 z次 o半乳糖 !葡萄糖 !鼠李糖 !阿拉伯糖 !果
糖的峰高 !峰面积的相对标准偏差 k ≥⁄l分别为
s1uvo s1yt~ s1vyo t1yy~ s1wxo s1{w~ t1sso u1wv~
t1u|ou1yzo结果表明 o该法具有很好的重复性 ∀
3q2q2 回归方程 !线性范围 !检测限 将以上 x种
糖的混合标准溶液进行毛细管电泳电化学测定 o以
电泳峰的峰面积 kΨl对单糖的质量浓度 kΞl做工作
曲线 o得到 x种糖的回归方程 !线性范围 !检测限
k≥rvl见表 u∀
#wzsu#
第 vu卷第 t|期
ussz年 ts月
中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλοφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
∂ ²¯qvuo ¶¶∏¨ t|
¦·²¥¨ µo ussz
表 u x种糖的回归方程 !线性范围 !检测限
标样 回归方程 ρ 线性范围 rª# °pt 检测限 rª# °pt
半乳糖 Ψ t1vy{ ≅ tsw n x1vuz ≅ tsts Ξ s1||{ w1x ≅ tspy ∗ |1s ≅ tspx w1x ≅ tspz
葡萄糖 Ψ w1sxt ≅ tsw n w1syt ≅ tsts Ξ s1||z |1u ≅ tspy ∗ |1u ≅ tspx v1z ≅ tspz
鼠李糖 Ψ w1usz ≅ tsw n u1tuy ≅ tsts Ξ s1||z |1u ≅ tspy ∗ |1u ≅ tspx |1u ≅ tspz
阿拉伯糖 Ψ s1zyy ≅ tsw n y1wss ≅ tsts Ξ s1||{ v1{ ≅ tspy ∗ z1x ≅ tspx v1{ ≅ tspz
果糖 Ψ p t1tt{ ≅ tsx n w1xst ≅ tsts Ξ s1||{ |1s ≅ tspy ∗ |1s ≅ tspx t1t ≅ tspy
3q3 肉苁蓉粗多糖水解液中单糖的测定
3q3q1 水解方法选择 采用内蒙产肉苁蓉多糖 o按
2q2所述方法进行水解 o按 2q3所述方法进行 ≤∞2
∞⁄测定 ∀ x种水解方法测得的单糖的浓度见表 vo
由此可以得出方法 v的水解较为彻底 o所得水解液
中的各单糖浓度均较高 ∀
表 v 水解条件的选择 ≅ tspw ª# °pt
水解方法 半乳糖 葡萄糖 鼠李糖 阿拉伯糖 果糖
t t1y ut w1| u1w v1s
u t1w t| w1u u1t u1z
v u1u u{ y1s v1s v1z
w t1y ut w1y u1v v1s
x t1{ ux x1w u1{ v1x
3q3q2 样品测定 精确称取不同种肉苁蓉粗多糖
样品各 s1sy ªo按 2q2方法水解 o取水解液 u °用
氢氧化钠中和至 ³ z ∗ {o然后以运行缓冲液稀释
至适量浓度 o按 2q3所述方法进行毛细管电泳测定 o
平行测定 v次 o测定结果见表 w∀内蒙产肉苁蓉粗
多糖单糖相对摩尔比为葡萄糖 Β半乳糖 Β鼠李糖 Β阿
拉伯糖 Β果糖 ktsΒs1zxΒu1vwΒt1u|Βt1vtl~新疆产管
花肉苁蓉为葡萄糖 Β半乳糖 Β鼠李糖 Β果糖
ktsΒs1{tΒx1t|Βu1twl~新疆人工栽培管花肉苁蓉
为葡萄糖 Β半乳糖 Β鼠李糖 ktsΒu1ysΒt1vvl∀
3q3q3 回收率试验 在上述内蒙产肉苁蓉粗多糖
水解样品中分别加入 tsΛ半乳糖 !葡萄糖 !鼠李
表 w 肉苁蓉多糖水解样品测定 kν vl ≅ tspw ª# °pt
样品 半乳糖 葡萄糖 鼠李糖 阿拉伯糖 果糖
内蒙 Χιστανχηε δεσερτιχολα u1t ? s1sz u{ ? s1uw y1s ? s1tv v1s ? s1tv v1z ? s1tz
新疆 Χ. τυβυλοσα t1x ? s1sv t{ ? s1t| {1y ? s1uu p v1| ? s1ut
栽培 Χ. τυβυλοσα s1z ? s1su u1y ? s1s{ s1v ? s1st p p
糖 !阿拉伯糖 !果糖储备液溶液进行测定 ∀ x种单糖
的加样回收率分别为 tst1|h otsu1{h o||1sh o
tsu1th otsx1uh o说明该方法是可靠的 ∀
4 结论
对不同种及同种 !同产地 o天然与人工栽培的肉
苁蓉样品的肉苁蓉粗多糖的单糖组成进行了研究 ∀
测定结果表明 o内蒙产正品肉苁蓉粗多糖由葡萄糖 !
半乳糖 !鼠李糖 !阿拉伯糖 !果糖组成 o新疆产管花肉
苁蓉粗多糖由葡萄糖 !半乳糖 !鼠李糖 !果糖组成 o新
疆人工栽培管花肉苁蓉粗多糖由葡萄糖 !半乳糖 !鼠
李糖组成 ∀可见 o同属不同种肉苁蓉多糖的单糖组
分不相同 o而且各单糖之间的比例也大不相同 ∀对
同产地同种肉苁蓉而言 o人工栽培与天然肉苁蓉粗
多糖的单糖组成也存在很大差异 ∀由此推论 o不同
种或人工栽培的肉苁蓉药效之间会有一定差异 o本
实验结果为进一步研究肉苁蓉多糖结构及药理性质
具有一定的参考价值 ∀
≈参考文献
≈t 吴向美 o屠鹏飞 q肉苁蓉多糖 ≤⁄°2w的化学结构研究 ≈ q北
京大学学报 k医学版 lousswovyktl}uwq
≈u 江苏新医学院 q中药大辞典 ≈ q上海 }上海人民出版社 o
t|zz}{|xq
≈v 中国药典 ≈≥ q一部 qusss}tsvq
≈w 王 彦 o张耀春 o王立为 q肉苁蓉化学成分及改善智力抗衰老
研究 ≈ q中国药物应用与监测 ousswou}{q
≈x 吴 波 o付玉梅 q肉苁蓉多糖对衰老小鼠脂质过氧化的影响
≈ q广州医学院学报 ousswovukwl}uzq
≈y 薛德钧 o章 明 q三种肉苁蓉糖类成分的分析 ≈ q中药材 o
t||wotzkul}vyq
≈z 黄雪松 q大蒜多糖的提取分离与分析 ≈ q食品科学 oussxouy
k|l}w{q
≈{ 陈汝贤 o王海燕 o许鸿章 o等 q岷当归两个多糖组分的分离 !纯
化与鉴定 ≈ q中药材 ousstouwktl}vyq
≈| 欧阳臻 o常 钰 o李永辉 o等 q桑叶多糖的提取纯化及其含量
测定 ≈ q时珍国医国药 oussxotyktsl}|ytq
≈ts 林 雪 o贾敬芬 o黄琳娟 o等 q °2°≤用于芦荟多糖的单糖
组成研究 ≈ q食品科学 oussyouzkwl}t|uq
≈tt 王建波 o林鲁霞 o窦江丽 o等 q玉米花粉多糖中的单糖组成分
析 ≈ q山东师范大学学报 k自然科学版 lousswot|kvl}y|q
≈tu 丁祥欢 o叶建农 q牛膝多糖中单糖组分的毛细管电泳 2电化学
检测方法研究 ≈ q分析测试学报 ousssot|kxl}xvq
≈责任编辑 牛泽宇
#xzsu#
第 vu卷第 t|期
ussz年 ts月
中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλοφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
∂ ²¯qvuo ¶¶∏¨ t|
¦·²¥¨ µo ussz