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Experimental study on protective effects of curcumin on exaggerated extracellular matrix accumulation of pulmonary fibrosis rats

姜黄素抗肺纤维化大鼠细胞外基质过度形成的实验研究



全 文 :姜黄素抗肺纤维化大鼠细胞外基质过度
形成的实验研究
周 刚,王继峰,牛建昭,李银生,陈伟涛,李泽华,刘同祥
(北京中医药大学 细胞与生化实验室,北京 100029)
[摘要] 目的:研究姜黄素抗博莱霉素诱导大鼠肺纤维化细胞外基质过度沉积的作用。方法:SD雄性大鼠
144只,分为假手术组,模型组,姜黄素高、中、低剂量组,醋酸泼尼松组,每组24只。除假手术组外其余各组大鼠气
管内一次性滴注盐酸博莱霉素,假手术组大鼠气管内一次性滴注等体积的生理盐水。造模后第1天开始给药,持
续到处死动物的前一天。姜黄素高,中,低剂量组分别为200,100,50mg·kg-1·d-1,醋酸泼尼松组为056mg·kg-1·
d-1,假手术组,模型组分别灌服等体积的生理盐水。各组动物于7,14,28d随机处死8只,分别观察大鼠肺组织羟
脯氨酸(HYP)和血清中Ⅲ型胶原,Ⅳ型胶原及层黏连蛋白和透明质酸的含量,同时取肺组织进行 HE,Malory染色。
结果:姜黄素可降低肺纤维化大鼠血清Ⅲ,Ⅳ胶原,层黏连蛋白及透明质酸含量,减轻肺组织纤维性增生。结论:可
能是通过降低肺纤维化大鼠细胞外基质含量而发挥治疗肺纤维化作用。
[关键词] 姜黄素;肺纤维化;Ⅲ型胶原;Ⅳ型胶原;层黏连蛋白;透明质酸
[中图分类号]R2855 [文献标识码]A [文章编号]10015302(2006)07057004
[收稿日期] 20050922
[基金项目] 国家自然科学基金重大课题项目(30130220);教
育部“长江学者和创新团队发展计划”项目(IRT0413)
[通讯作者] 牛建昭,Tel:(010)64286960,Email:niujzz@263.
net
姜黄素(curcumin)是从中药姜黄 Curaumalonga
L中提取的一种酚性色素,通常作为调味品及化妆
品使用。近年的研究表明姜黄素具有广泛药理作
用,如抗炎[1]、抗氧化[2]、抗缺血[3]、抗癌[4]和抗肝纤
维化[5]等作用。为了探讨其对肺纤维化的作用,本
室采用博莱霉素诱导大鼠肺纤维化模型,研究姜黄
素对肺纤维化大鼠细胞外基质的影响,以期为临床
防治肺纤维化提供药效学基础。
1 材料
11 动物 SD雄性大鼠 144只,体重(198±7)g,
购自北京维通利华实验动物技术有限公司,动物级
别SPF/V,AF,许可证编号SCXK20020003。
12 药物 姜黄素(四川金郁金科技有限公司,批
号050302,含量 956%),醋酸泼尼松片(实验阳性
对照药,天津太平洋制药有限公司,批号050102),注
射用盐酸博莱霉素(日本化药株式会社,批号
740140)。
13 仪器 GC-911-γ-放射免疫计数器(中国科
技大学实业总公司)。
2 方法
21 大鼠模型复制方法[6] 用 15%戊巴比妥钠
腹腔注射麻醉(25mL·kg-1),仰卧固定于鼠台上,
颈部酒精消毒后逐层分离并暴露气管,注射器经气
管软骨环间隙朝向心端刺入气管,然后缓慢注入
03mL博莱霉素生理盐水溶液(5mg·kg-1)或生理
盐水溶液,继续注入 03mL的空气,注后立即将动
物直立并左右旋转,使药液在肺内均匀分布。其中
假手术组大鼠肺部注入等体积的生理盐水。实验期
间,大鼠自由饮水和进食。
22 动物分组和给药方法 动物分组:SD雄性大
鼠随机分为 6组。模型组,姜黄素高、中、低剂量 3
组;阳性药物组(醋酸泼尼松片),造模同模型组;假
手术组(气管内注入03mL生理盐水),每组24只。
给药方法:SD大鼠造模第 2天后,分别给各组
大鼠生理盐水、醋酸泼尼松、姜黄素。姜黄素在使用
时将其溶于05%羧甲基纤维素钠配成混悬液。醋
酸泼尼松片在使用时用蒸馏水溶解,配成混悬液。
其中假手术组、模型组大鼠分别给予生理盐水,给药
剂量为0014L·kg-1·d-1。醋酸泼尼松组大鼠给予
醋酸泼尼松混悬液,给药剂量为056mg·kg-1·d-1。
姜黄素高、中、低剂量组大鼠分别给予 50,100,200
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mg·kg-1·d-1姜黄素羧甲基纤维素钠溶液。
23 取材方法 大鼠在造模7,14,28d后分3次取
材,每次各组随机处死8只,共48只。具体步骤:大
鼠腹腔注射 15%戊巴比妥钠溶液麻醉(25mL·
kg-1)后将大鼠固定,腹主静脉取血,分离血清,同时
取肺脏做相应的研究。
24 血清学指标测定 采用放免法测血清中Ⅲ型
胶原(ⅢC),Ⅳ型胶原(ⅣC)及层黏连蛋白(LN)和
透明质酸(HA)的含量。
25 肺组织羟脯氨酸测定 采用碱水解法测定肺
组织匀浆中羟脯氨酸(HYP)的含量(HYP试剂盒购
自南京建成生物工程研究所),HYP的测定方法按
试剂盒说明书步骤进行。
26 肺组织病理学检查 取肺,按常规病理学方法
进行固定,包埋,切片。将病理切片分别进行 HE,
Malory染色。
27 实验结果处理 数据采用统计软件 SPSS110
进行单因素方差分析,实验结果采用(珋x±s)表示。
3 结果
31 大鼠体重变化情况 第7天时,与假手术组相
比,各组大鼠体重均呈下降的趋势(P<001或 P<
005);第14天时,模型组大鼠的体重与假手术组相
比,下降到最低点;第28天时,各组大鼠体重均呈上
升的趋势,但仍低于假手术组,其中姜黄素高、中剂
量组大鼠体重与假手术对照组相比,无显著性差异。
32 血清中ⅢC的含量测定 与假手术组相比,7,
14,28d时模型组大鼠血清中ⅢC的含量均明显升
高(P<001或 P<005),以28d时血清中ⅢC的
含量最高。与模型组相比,姜黄素高、中、低剂量均
可降低肺纤维化大鼠血清中ⅢC的含量,其中 7d
时姜黄素中剂量的降低作用较为显著(P<005),
14,28d时,姜黄素中,高剂量的降低作用较为显著
(P<001)(表1)。
33 血清中ⅣC的含量测定 与假手术组相比,7,
14,28d时模型组大鼠血清中ⅣC的含量均明显升
高(P<001),以 28d时血清中ⅣC的含量最高。
与模型组相比,姜黄素高、中、低剂量均可降低肺纤
维化大鼠血清中ⅣC的含量,其中姜黄素中、高剂
量的降低作用较为显著(P<001或 P<005);除
假手术组外,7,14d时姜黄素中剂量组大鼠血清中
ⅣC的含量最低,28d时,姜黄素高剂量组大鼠血
清中ⅣC的含量最低(表2)。
表1 各组大鼠血清中ⅢC含量(珋x±s,n=8) μg·L
-1
组别 7d 14d 28d
假手术 114.77±19.16 118.13±14.40 123.09±14.45
模型 137.27±19.451) 177.69±24.872) 199.05±17.322)
醋酸泼尼松 121.02±21.08 145.67±27.401,3)169.96±32.292,3)
姜黄素高剂量 120.37±16.82 143.41±22.131,4)157.965±19.442,4)
姜黄素中剂量 117.93±12.193) 138.75±20.224) 166.21±28.592,4)
姜黄素低剂量 129.69±16.08 162.75±29.562) 181.13±23.802)
注:与假手术组比较,1)P<0.05,2)P<0.01;与模型组比较,
3)P<0.05,4)P<0.01(表2~5同)
表2 各组大鼠血清中ⅣC含量(珋x±s,n=8) μg·L
-1
组别 7d 14d 28d
假手术 98.99±13.49 102.40±27.17 109.05±18.35
模型 128.10±22.872) 144.78±18.122) 159.34±26.862)
醋酸泼尼松 109.29±17.663) 121.92±25.873) 133.16±22.421,3)
姜黄素高剂量 109.78±19.563) 118.59±16.033) 127.28±17.144)
姜黄素中剂量 105.12±15.784) 114.97±16.784) 130.62±25.943)
姜黄素低剂量 118.78±13.091) 130.02±12.492) 146.03±28.102)
34 血清中LN的含量测定 与假手术组相比,7,
14,28d时模型组大鼠血清中LN的含量均明显升高
(P<001),以28d时血清中LN的含量最高。与模
型组相比,姜黄素高、中、低剂量均可降低肺纤维化
大鼠血清中 LN的含量,其中姜黄素中、高剂量的降
低作用较为显著(P<001)(表3)。
表3 各组大鼠血清中LN含量(珋x±s,n=8) μg·L
-1
组别 7d 14d 28d
假手术 55.10±3.81 58.20±4.12 59.32±5.72
模型 69.42±7.082) 81.19±7.432) 93.12±11.692)
醋酸泼尼松 60.38±3.264) 69.47±7.772,4) 74.24±9.582,4)
姜黄素高剂量 59.22±8.234) 67.10±6.621,4) 68.97±10.294)
姜黄素中剂量 57.72±6.994) 65.05±4.344) 72.18±11.691,4)
姜黄素低剂量 65.40±7.792) 75.15±10.332) 85.53±10.732)
35 血清中HA的含量测定 与假手术组相比,7,
14,28d时模型组大鼠血清中 HA的含量均明显升
高(P<001),以28d时血清中HA的含量最高。与
模型组相比,姜黄素高、中、低剂量均可降低肺纤维
化大鼠血清中HA的含量,其中姜黄素中,高剂量的
降低作用较为显著(P<001或 P<005);除假手
术组外,7,14d时姜黄素中剂量组大鼠血清中 HA
的含量最低,28d时,姜黄素高剂量组大鼠血清中
HA的含量最低(表4)。
36 肺组织羟脯氨酸(HYP)的含量测定 与假手
术组比较,7,14,28d时模型组大鼠血清中 HYP的
含量均明显升高(P<001),以 28d时肺组织中
HYP的含量最高。与模型组相比,姜黄素高,中,低
剂量均可降低肺纤维化大鼠血清中 HYP的含量,其
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表4 各组大鼠血清中HA含量(珋x±s,n=8) μg·L
-1
组别 7d 14d 28d
假手术 127.20±12.69 134.90±53.49 134.35±60.50
模型 220.21±49.112) 281.35±53.462) 318.46±97.082)
醋酸泼尼松 157.95±87.563) 198.09±50.231,4)246.96±56.962,3)
姜黄素高剂量 153.74±64.563) 190.80±68.664) 208.02±33.751,4)
姜黄素中剂量 138.61±60.684) 174.95±40.184) 238.831±40.042,3)
姜黄素低剂量 177.57±44.56 226.15±75.362) 277.21±50.592)
中14,28d时姜黄素中,高剂量的降低作用较为显
著(P<001或 P<005)(表5)。
表5 各组大鼠肺组织中HYP含量(珋x±s,n=8) mg·g-1
组别 7d 14d 28d
假手术 1.038±0.159 1.014±0.114 1.063±0.195
模型 1.353±0.2232) 2.743±0.1062) 3.667±0.1302)
醋酸泼尼松 1.181±0.270 1.904±0.6461,3) 2.518±0.1212,3)
姜黄素高剂量 1.169±0.199 1.857±0.7761,3) 2.298±0.7931,4)
姜黄素中剂量 1.149±0.142 1.750±0.7963) 2.516±0.7862,3)
姜黄素低剂量 1.268±0.2161) 2.338±0.1162) 3.194±0.1192)
37 肺组织病理观察 假手术组肺各时期未见明
显病变;模型组第7天肺泡间隔增厚,肺泡腔及间隔
内炎症细胞聚集,肺泡腔缩小;14d时炎性细胞渗出
减轻,肺泡间隔增厚,成纤维细胞增多;第28天肺泡
结构破坏,纤维化明显。模型组 Malory染色可见:7
d时肺泡间隔可见明显的纤维增生灶,部分肺泡腔
充满渗出物和脱落的各种炎性细胞及Ⅱ型肺泡上
皮,部分肺泡呈现实变倾向。14d炎症减轻,肺泡间
隔增宽,可见部分纤维母细胞。28d大鼠肺泡壁及
间隔显著增厚,各级支气管周围可见大量纤维增生。
与文献[7]报道一致,证明造模成功。通过 HE,Mal
lory染色观察,姜黄素高、中、低剂量组肺泡炎和纤
维化程度均较模型组轻。
4 讨论
本实验研究了姜黄素对肺纤维化大鼠细胞外基
质过度形成的作用。在实验期间观察了大鼠的一般
状况,发现通过气管内一次性注入盐酸博莱霉素后
第1天,大鼠出现明显躁动,干咳,食欲下降。2d后
大鼠体重下降,呼吸伴有明显的哮鸣音,口鼻及尾巴
青紫。第6天,体重降至最低点,6d后体重逐渐回
升,至28d基本恢复正常。大鼠体重统计结果显
示,模型组大鼠体重减轻,姜黄素组大鼠体重不同程
度增加。这表明姜黄素在治疗肺纤维化同时可以改
善机体代谢机能,促进机体消化,吸收营养物质,增
强一般健康状态。
肺内的细胞外基质成分主要有4种,它们是胶
原蛋白、弹性蛋白、蛋白多糖及糖黏连蛋白。这些成
分相互混合交织,使肺间质组织成为一个整体并具
有一定的硬度和韧性,藉以完成相应的生理功
能[8,9]。基底膜主要由ⅣC,LN,纤黏连蛋白,肝素
硫酸软骨素蛋白多糖等构成。基底膜成分的聚积可
刺激炎症细胞的吸附和活化[10]。基底膜的裂解在
肺纤维化的病理中也尤为重要[11]。ⅢC分布于肺
间质,ⅣC分布于基底膜和肺间质。而胶原蛋白是
由3条不同或相同的肽链构成的三螺旋结构,富含
脯氨酸、羟脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸,因此测定肺组织
羟脯氨酸含量可以反映肺组织胶原蛋白及细胞外基
质的含量。HA是体内结构最简单的一种糖胺多
糖,为细胞外基质组成成分之一。HA增高主要见
于肺损伤的炎性期[12]。也有人认为早期的 HA积
聚是增生的炎性细胞和成纤维细胞必需的基质,因
而有助于纤维组织的形成[13]。实验研究表明在应
用博莱霉素后肺内间质性胶原的含量是增高的,肺
纤维化大鼠血清中ⅢC,ⅣC,LN,HA明显升高,说
明肺内细胞外基质的合成明显增加,而且还有炎症
存在。肺纤维化大鼠给予姜黄素后以上4种细胞外
基质的含量可明显降低,其中高、中剂量效果较为明
显。因而提示姜黄素通过影响细胞外基质的合成而
治疗肺纤维化,其作用机制有待于进一步研究阐明。
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Experimentalstudyonprotectiveefectsofcurcumin
onexaggeratedextracelularmatrixaccumulationofpulmonaryfibrosisrats
ZHOUGang,WANGJifeng,NIUJianzhao,LIYinsheng,CHENWeitao,LIZehua,LINTongxiang
(LaboratoryofCelandBiochemistry,BeijingUniversityofTraditionalChineseMedicine,Beijing100029,China)
[Abstract] Objective:Tostudytheprotectiveefectsofcurcuminonexaggeratedextracelularmatrixaccumulationofpulmonaryfibro
sisrats.Method:OnehundredandfortyfourmaleSpragueDawleyratswererandomLydividedinto6groups(24ratsineachgroup).Ratsin
themodelcontrolgroup,positivemedicinegroup,andhigh,moderateandlowcurcumingroupswereinjectedwithasingledoseofbleomycin
bytrachea,andratsinshammodelcontrolgroupwithsamevolumenormalsaline.Onedayaftertheinjection,curcuminsolutionofdiferent
dosages(200,100,50mg·kg-1·d-1)wasrespectivelygiventoratsinthehigh,moderateandlowcurcumingroupdailybygastrogavage,
whileequalvolumeofnormalsalinewasgiventothoseintheshammodelcontrolgroupandmodelcontrolgroup,andanequalvolumeofpred
nisone(056mg·kg-1·d-1)wasgiventothoseinpositivemedicinecontrolgroup.Onthe7,14,28days,8ratspertreatmentgroupwere
randomlykiled,thelevelsofⅢcolagen,Ⅳcolagen,lamininandhyaluronicacidintheserumweredetermined,thedeterminationofhy
droxyprolineinlunghomogenateswasanalyzed,andthelungwasincisedtomakepathologicalsectionswhichwerestainedwithHEandMalo
ry.Result:CurcumincoulddecreasthelevelsofⅢcolagen,Ⅳcolagen,lamininandhyaluronicacidintheserum,andinhihittheprolifer
ationoffibroustissue.Conclusion:Curcuminmayplayitstherapetuicrolebylevelingdownthecontentofextracelularmatrixinratswithpul
monaryfibrosisinducedbybleomycin.
[Keywords] curcumin;pulmonaryfibrosis;Ⅲcolagen;Ⅳcolagen;laminin;hyaluronicacid
[责任编辑 方文贤]
关于评选第九届中国药学会施维雅
青年药物化学奖和专项研究资助项目的通知
中国药学会施维雅青年药物化学奖和专项研究资助项目是由中国药学会与法国施维雅公司研究院共同设立的,每年评
选一次,旨在鼓励中国优秀青年药物化学工作者立足于中国国内和致力于中国新药研究。根据设奖宗旨和国内药物化学学
科发展的实际情况,2006年的奖励办法为:(1)继续面向全国,奖励3名从事药物化学研究的青年药物化学(合成药物和天然药
物)学者;获奖者每人可获得奖金15000元人民币以及奖杯和证书。(2)面向边远地区的专项资助项目,奖励1项研究课题,经
费为50000元人民币,二年内完成;并颁发专项资助项目证书。奖金和专项研究经费均由法国施维雅公司研究院提供。第九
届评选工作已经开始,欢迎国内高等医药院校和科研机构积极推荐有关学者申报,有关事宜可从中国药学会网站 www.cpa.
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第31卷第7期
2006年4月
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Vol31,Issue 7
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