全 文 ：·研究论文·
重庆何首乌遗传多样性的 ＳＲＡＰ研究
程远辉１，周昌华２，马爱芬１，石小刚１，张兴翠１
（１．西南大学 农学与生物科技学院，重庆 ４００７１６；
２．西南大学 科技处，重庆 ４００７１６）
［摘要］ 目的：采用新型分子标记ＳＲＡＰ对重庆地区何首乌资源进行遗传多样性研究，为何首乌种质资源的
分类、鉴定和选种打下良好的理论基础。方法：选择重庆各地区形态差异较大的１６份何首乌材料进行 ＳＲＡＰ多态
性分析，利用ＤＰＳｖ３０１和ＵＰＧＭＡ法进行聚类分析，构建遗传系统树。结果：从１５５个引物组合中筛选出１０４个多
态性组合，共扩增产生了２５０个多态性位点，聚类分析结果显示，１６份材料可以分为２大类和１个特异类，Ｎｅｉ＆Ｌｉ
相似系数在０２３～０９９，平均遗传距离为０４４。结论：何首乌资源遗传关系大体上符合地域差异，但也不能完全按
照地理位置来判定它们的亲缘关系，应有少量的变异，ＳＲＡＰ技术研究中药资源多样性具有极大的优越性和可行
性。
［关键词］ 重庆何首乌；遗传多样性；ＳＲＡＰ
［中图分类号］Ｓ５６７ ［文献标识码］Ａ ［文章编号］１００１５３０２（２００７）０８０６６１０３
［收稿日期］ ２００６０５２０
［通讯作者］ 张兴翠，Ｔｅｌ：（０２３）６８２５１１８８
何首乌 ＰｏｌｙｇｏｎｕｍｍｕｌｔｉｆｌｏｒｕｍｔｍＴｈｕｎｂ，蓼科多
年生缠绕性藤本植物，喜生于温湿、腐殖质丰富的砂
质土中，全株都可入药，尤以根部为佳［１］。主要分
布在广西、广东、贵州、四川、重庆、云南等地［１３］。目
前何首乌野生资源滥采殆尽，栽培生产刚刚起步，而
栽培用种混乱，尚处在原始的混杂群体状态，严重影
响了产量的提高和质量的稳定。
ＳＲＡＰ（ｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅｌａｔｅｄａｍｐｌｉｆｉｅｄｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）
是一种基于ＰＣＲ标记技术的相关序列扩增多态性。
此技术由美国加州大学蔬菜作物系 Ｌｉ等于２００１年
提出，目前在国外已得到较多应用，而在国内中药资
源上的研究尚未见到报道。该标记具有简便、稳定、
中等产率等特点，已在棉花、西瓜等多种植物上成功
的进行了遗传多样性分析［４９］。本研究将ＳＲＡＰ技术
首次应用于药材何首乌的遗传多样性研究，探讨
ＳＲＡＰ在何首乌乃至中药资源研究中的可行性。
１ 材料
取何首乌幼嫩茎段（除旅途外尽量放置于４℃
冰箱中保持材料鲜活性）作外植体组培扩繁建立单
株系。野外取材应选取形态差异较大个体，以避免
重复和便于多态性分析。其中实验室原有材料（采
自重庆地区，具体来源不详）共 ４个，分别编号为
１～４；重庆沙坪坝区４个，编号５～８；重庆石柱县５
个，编号９～１３；重庆北碚区３个，编号１４～１６。所
有材料经张兴翠研究员鉴定均为蓼科何首乌。
２ 方法
２．１ ＤＮＡ提取 取组培苗幼叶０５ｇ，液氮研磨，采用
ＣＴＡＢ法［７］进行，经琼脂糖电泳检测，适于ＰＣＲ扩增。
２．２ ＳＲＡＰ标记分析 ＰＣＲ引物［４］和 Ｔａｑ酶均由
上海生工合成和生产。ＰＣＲ扩增总体积为１０μＬ：
ＤＮＡ模板５０ｎｇ，引物１μＬ（５０ｎｇ），１０ｍｍｏｌ·Ｌ－１
ｄＮＴＰｓ０２μＬ，１０×ＰＣＲｂｕｆｅｒ１μＬ，２５ｍｍｏｌ·Ｌ－１
Ｍｇ２＋１μＬ，０１μＬＴａｑ酶，不足部分用ｄｄＨ２Ｏ补充。
ＰＣＲ反应程序［４］：９４℃预变性 ４ｍｉｎ，Ⅰ９４℃ １
ｍｉｎ，３５℃１ｍｉｎ，７２℃１ｍｉｎ共５个循环；Ⅱ９４℃１
ｍｉｎ，５５℃ １ｍｉｎ，７２℃ １ｍｉｎ共３５个循环，最后７２
℃延伸５ｍｉｎ。扩增产物用６％ ＰＡＧＥ胶分离，电泳
缓冲液为０５×ＴＢＥ，电压３５０Ｖ，电泳时间为４０～
５０ｍｉｎ。电泳后银染，银染方法为：固定液（１０％醋
酸 ５０ｍＬ＋无水乙醇１００ｍＬ＋水８５０ｍＬ）固定１２
ｍｉｎ，０２％ＡｇＮＯ３染色 １２ｍｉｎ，水洗 １ｍｉｎ，显色剂
（３３ｍＬ甲醛＋４５ｇＮａＯＨ＋３００ｍＬ水）显色。
２．３ 扩增片断遗传距离指数及数据分析 对扩增
·１６６·
第３２卷第８期
２００７年４月
中 国 中 药 杂 志
ＣｈｉｎａＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭａｔｅｒｉａＭｅｄｉｃａ
Ｖｏｌ．３２，Ｉｓｓｕｅ ８
Ａｐｒｉｌ，２００７
产物进行统计，将电泳结果按条带的有或无量化成
１和０，有带赋值为１，无带赋值为０。根据Ｎｅｉ和Ｌｉ
的公式：Ｆ＝２ＮＸＹ／（ＮＸ＋ＮＹ）获得各样品间的遗传
相似度，其中 ＮＸＹ为 ２个样品共同享有的标记数，
ＮＸ，ＮＹ分别为Ｘ和Ｙ样品各自拥有的标记数，再经
Ｄ＝１－Ｆ公式计算相应的遗传距离，得到的数据输
入计算机，用ＤＰＳｖ３０１软件ＵＰＧＭＡ（类平均法）进
行聚类分析，构建聚类关系图。
３ 结果与分析
３．１ 多态性引物扩增结果 从１５５个引物组合筛
选出１０４个具有多态性条带的组合，共扩增出２５０
个清晰的多态性条带，平均扩增２４条，片段大小为
１００～１０００ｂｐ。每个引物扩增出的多态性位点１～
１０个不等，部分引物扩增结果见表１，图１。
表１ 部分引物组合产生的多态性条带数
上游引物 下游引物 多态性条带数
ｍｅ３０：ＴＡＧＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＣＴＣ ｅｍ３２：ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＣＴＴ ３
ｍｅ２９：ＴＡＧＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＣＧＴ ｅｍ３６：ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＧＡＴ １０
ｍｅ１１：ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＡＧＧ ｅｍ４２：ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＧＧＣ ６
ｍｅ３４：ＴＡＧＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＧＡＣ ｅｍ４５：ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＧＴＡ ３
ｍｅ３：ＴＡＧＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＡＡＧ ｅｍ４９：ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＴＡＡ ４
ｍｅ１２：ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＡＧＴ ｅｍ４８：ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＧＴＴ １０
ｍｅ１０：ＴＡＧＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＡＧＣ ｅｍ５０：ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＴＡＣ ５
ｍｅ４６：ＴＡＧＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＧＴＣ ｅｍ５２：ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＴＡＴ ４
ｍｅ２６：ＴＡＧＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＣＧＣ ｅｍ５６：ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＴＣＴ ５
ｍｅ７：ＴＡＧＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＡＣＣ ｅｍ５８：ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＴＧＣ ４
图１ ２个引物组合扩增图谱
Ａｍｅ２６，ｅｍ５６；Ｂｍｅ３０，ｅｍ３２
３．２ 遗传距离和聚类分析结果 根据１０４对引物
扩增得到的结果，采用Ｎｅｉ和Ｌｉ的公式计算出了 ｌ６
组何首乌间的遗传距离。其中１０与１６的遗传距离
最大为０７７；１与２间的遗传距离最小为００８９；１６
份何首乌的平均遗传距离为０４４，说明１６组不同
区域的何首乌在分子水平具有较大差异。其中材料
９与所有材料的平均遗传距离为０６３，远高于平均
水平，可视为特异材料。
用软件ＤＰＳｖ３０１软件 ＵＰＧＭＡ（类平均法）对
１６份何首乌材料的亲缘关系进行了聚类分析，结果
见图２。根据各试验材料之间的遗传距离，以０５０
（Ｅｕｃｌｉｄｅａｎｄｉｓｔａｎｃｅｓ）为临界值，可将１６份材料大
概划分成２大类和１个变异材料９，同一地区的材
料大体上聚到一起，地理位置较远的在聚类图上一
般分的比较开。
图２ １６份何首乌材料ＵＰＧＭＡ聚类图
４ 讨论
４．１ ＳＲＡＰ的优越性和可行性 作者首次将 ＳＲＡＰ
技术应用于何首乌的研究，结果显示了极大的优越
性和可行性，尤其是扩增的条带多而且清晰，易于分
辨。特别是 ＳＲＡＰ引物同样具有通用性，上游引物
和下游引物可以两两任意搭配，提高了引物的利用
效率，且一般都可以扩增出条带。作者在做 ＳＲＡＰ
分析之前曾试着采用 ＲＡＰＤ进行了较长时间的研
究，结果显示，扩增出条带少（一般３条左右），且重
复性差，反应体系和程序也很不稳定。
但目前，通过分子技术进行中药资源的分类和
鉴定选用最多的还是 ＲＡＰＤ。ＳＲＡＰ具有 ＲＡＰＤ同
·２６６·
第３２卷第８期
２００７年４月
中 国 中 药 杂 志
ＣｈｉｎａＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭａｔｅｒｉａＭｅｄｉｃａ
Ｖｏｌ．３２，Ｉｓｓｕｅ ８
Ａｐｒｉｌ，２００７
样的操作简便性，仅在扩增产物的检测上采用较复
杂的聚丙烯酰胺凝胶电泳结合银染技术，但是与琼
脂糖电泳检测结果相比，分辨率大大提高，多次重复
试验结果稳定，克服了 ＲＡＰＤ重复稳定性差的缺
点［６，７］。已有研究表明，ＳＲＡＰ比 ＡＦＬＰ等技术更能
反映表型的多样性及进化历史［９］。所以作者认为，
ＳＲＡＰ技术从各个方面优于ＲＡＰＤ，是该技术一个很
好的替代。
４．２ 何首乌资源的遗传多样性分析 聚类分析结
果显示，何首乌资源遗传关系大体上符合地域差异，
与王凌晖等结论相符［３］，但也不能完全按照地理位
置来判定它们的亲缘关系，应有少量的变异。作者
从重庆石柱地区取的５个材料中１０～１３号３个材
料关系相邻，而材料９和１２则都具有了各自较为独
立的遗传特性，可能是由于环境影响和长期演化所
导致的变异。另外何首乌是自花授粉植物，理论上
变异和分化的几率较低，而作者在取材范围较为狭
窄的情况下所得出的遗传数据差异，说明了何首乌
也有很丰富的遗传多态性，可以利用此方法在更大
范围内进行何首乌资源的整理和分类。此外，作者
还要对这些材料进行栽培性状考察和有效成分测
定，这样结合遗传分析，进行综合评价，为进一步的
何首乌选种提供理论依据。
［参考文献］
［１］ 廖海民，胡正海．何首乌的生物学及化学成分研究进展［Ｊ］．中
草药，２００５，３６（２）：３１１．
［２］ 罗瑞芝，贾 伟，赵利斌，等．何首乌研究进展［Ｊ］．中草药，
２００５，３６（７）：１０９７．
［３］ 王凌晖，曹福亮，汪贵斌，等．何首乌野生种质资源的ＲＡＰＤ指
纹图谱构建［Ｊ］．南京林业大学学报（自然科学版），２００５，２９
（４）：３７．
［４］ ＬｉＧ，ＱｕｉｒｏｓＣＥ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅｌａｔｅｄａｍｐｌｉｆｉｅｄｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ
（ＳＲＡＰ），ａｎｅｗｍａｒｋｅｒｓｙｓｔｅｍｂａｓｅｄｏｎａｓｉｍｐｌｅＰＣＲｒｅａｃｔｉｏｎ：
ｉｔｓａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｔｏｍａｐｐｉｎｇａｎｄｇｅｎｅｔａｇｇｉｎｇｉｎＢｒａｓｓｉｃａ［Ｊ］．Ｔｈｅｏｒ
ＡｐｐｌＧｅｎｅｔ，２００１，１０３：４５５．
［５］ 李 颜，张春庆．新型分子标记ＳＲＡＰ技术体系优化及应用前
景分析［Ｊ］．中国农学通报，２００５，２１（５）：１０８．
［６］ 李 颜，张春庆．西瓜杂交种遗传多态性的 ＳＲＡＰ标记分析
［Ｊ］．园艺学报，２００５，３２（４）：６４３．
［７］ 林忠旭，张献龙，聂以春．新型标记ＳＲＡＰ在棉花Ｆ２分离群体及
遗传多样性评价中的适用性［Ｊ］．遗传学报，２００４，３１（６）：６２２．
［８］ 任 羽，王得元，张银东．相关序列扩增多态性（ＳＲＡＰ）一种新
的分子标记技术［Ｊ］．中国农学通报，２００４，２０（６）：１１．
［９］ ＦｅｒｉｏｌＭ，ＰｉｃｏＢ，ＮｕｅｚＦ．Ｇｅｎｅｔｉｃｄｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆａｇｅｒｍｐｌａｓｍｃｏ１
１ｅｃｔｉｏｎｏｆＣｕｃｕｒｂｉｔａＰｅｐｏｕｓｉｎｇＳＲＡＰａｎｄＡＦＬＰｍａｒｋｅｒｓ［Ｊ］．
ＴｈｅｏｒＡｐｐｌＧｅｎｅｔ，２００３，１０７：２７１．
ＳＲＡＰｓｔｕｄｙｏｎｇｅｎｅｔｉｃｄｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆ
ＲａｄｉｘＰｌｙｇｏｎｉＭｕｌｔｉｆｌｏｒｉｉｎＣｈｏｎｇｑｉｎｇ
ＣＨＥＮＧＹｕａｎｈｕｉ１，ＺＨＯＵＣｈａｎｇｈｕａ２，ＭＡＡｉｆｅｎ１，ＳＨＩＸｉａｏｇａｎｇ１，ＺＨＡＮＧＸｉｎｇｃｕｉ１
（１．ＴｈｅＣｏｌｅｇｅｏｆＡｇｒｏｎｏｍｙ＆Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＳｏｕｔｈｗｅｓｔＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ４００７１６，Ｃｈｉｎａ；
２．ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌＳｅｃｔｉｏｎｏｆＳｏｕｔｈｗｅｓｔＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ４００７１６，Ｃｈｉｎａ）
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＴｏｄｅｔｅｃｔｔｈｅｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓｏｆＲａｄｉｘＰｌｙｇｏｎｉＭｕｌｔｉｆｌｏｒｉｉｎＣｈｏｎｇｑｉｎｇｂｙｍｅａｎｓｏｆａｎｅｗｍａｒｋｅｒｓｙｓｔｅｍ
ＳＲＡＰ．Ｍｅｔｈｏｄ：ＤｉｆｅｒｅｎｔｓｈａｐｌｅｓｏｆＲａｄｉｘＰｌｙｇｏｎｉＭｕｌｔｉｆｌｏｒｉｆｒｏｍｍａｊｏｒｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎａｒｅａｓｗｅｒｅｃｏｌｅｃｔｅｄ．ＴｈｅＳＲＡＰｗａｓｕｓｅｄｔｏａｓｓｅｓ
ｄｉｖｅｒｇｅｎｃｅａｍｏｎｇ１６ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ．Ｔｈｅｄａｔａｗｅｒｅａｎａｌｙｚｅｄｕｓｉｎｇｕｎｗｅｉｇｈｔｅｄｐａｉｒｇｒｏｕｐｍｅｔｈｏｄ，ｂａｓｅｄｏｎａｒｉｔｈｍｅｔｉｃａｖｅｒａｇｅｓ（ＵＰＧ
ＭＡ）ｂｏｏｔｓｔｒａｐａｎａｌｙｓｉｓ．ＣｌｕｓｔｅｒａｎａｌｙｓｅｓｗａｓｐｅｒｆｏｒｍｅｄｂｙｕｓｉｎｇＤＰＳｖ３０１ｓｏｆｔｗａｒｅ，ｔｈｅａｌｋａｌｏｉｄｗａｓｅｘｔｒａｃｔｅｄｆｒｏｍＰ．ｔｅｒｎａｔｅｗｉｔｈ
ｃｈｌｏｒｏｌｆｏｒｍ．Ｒｅｓｕｌｔ：１０４ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓｇｅｎｅｒａｔｅｄ２５０ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｅｂａｎｄｓ，ｔｈｅｃｌｕｓｔｅｒａｎａｌｙｓｉｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔ１６ｍａｔｅｒｉａｌｓｃｏｕｌｄｂｅｄｉｓ
ｔｉｎｇｕｉｓｈｅｄｉｎｔｏｔｗｏｍａｉｎｇｒｏｕｐｓａｎｄｏｎｅｓｐｅｃｉａｌｔｙｐｅ，Ｎｅｉ＆Ｌｉｓｉｍｉｌａｒｉｔｙｃｏｅｆｉｃｉｅｎｔｒａｎｇｅｄｆｒｏｍ０２３０９９，ａｎｄｔｈｅａｖｅｒａｇｅｄｉｓｔａｎｃｅｉｓ
０４４．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｔｈｅｓｔｕｄｙｓｈｏｗｅｄａｐｏｔｅｎｔｉａｌａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆＳＲＡＰｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇｆｏｒｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＲａｄｉｘＰｌｙｇｏｎｉ
Ｍｕｌｔｉｆｌｏｒｉ．
［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］ ＲａｄｉｘＰｌｙｇｏｎｉＭｕｌｔｉｆｌｏｒｉ；ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ；ＳＲＡＰ
［责任编辑 张宁宁］
·３６６·
第３２卷第８期
２００７年４月
中 国 中 药 杂 志
ＣｈｉｎａＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭａｔｅｒｉａＭｅｄｉｃａ
Ｖｏｌ．３２，Ｉｓｓｕｅ ８
Ａｐｒｉｌ，２００７