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Fingerprint of Curcuma phaeocaulis by LC-MS

蓬莪术药材醇提取物LC-MS指纹图谱的研究



全 文 :Simultaneousdeterminationoffourglycosylflavonesfrom
LophatherumgracilebyRPHPLC
YUANKe1,XUEYueqin1,YINMingwen2,LOULuhuan1
(1.ResearchandDevelopmentCerterofNaturalMedicine,ZhejiangForestryUniversity,Lin′an311300,China;
2.DepartmentofChemistry,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052,China)
[Abstract] Objective:TodevelopaRPHPLCmethodforsimultaneousdeterminationoforientin,isorientin,vitexinand
isovitexininLophatherumgracilefromdiferenthabitatandharvestingtime.Method:TheHPLCmethodwasappliedandthe
chromatographiccolumnwasaWatersXBridgeC18column(46mm×250mm,5μm).Themobilephaseconsistedofmethanol
005% aceticacid(35∶65).Theflowratewas10mL·min-1andthedetectionwavelengthwassetat340nm.Thecolumn
temperaturewassetat25℃.Result:Fourcomponentswereisolatedwel,thelinearrelationshipswereexcelent.Themean
recoveriesandRSDvaluesoforientin,isorientin,vitexinandisovitexinwere1032%,21%;1016%,27%;984%,23%;
992%,18%,respectively.Conclusion:TheHPLCmethodissimple,sensitiveandreliable,andcanbeusedforthequalitycontrol
ofthemedicinalmaterial.
[Keywords] RPHPLC;Lophatherumgracile;glycosylflavone
[责任编辑 王亚君]
蓬莪术药材醇提取物 LCMS指纹图谱的研究
周 欣,陈华国,赵 超,龚小见,李 明
(贵州师范大学 天然药物质量控制研究中心,贵州 贵阳 550001)
[摘要] 目的:建立蓬莪术药材醇提取物的LCMS指纹图谱评价方法。方法:以四川中药材规范化种植基地
的蓬莪术药材为研究对象,采用甲醇冷浸法提取蓬莪术有效成分,用液相色谱质谱联用法测定其指纹图谱(LC
MSFPS),并采用国家药典委员会颁布的中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件(2004版)对测定结果进行评价。
结果:四川种植的蓬莪术药材醇提取物的指纹图谱有良好的相似度,生成的指纹图谱,有14个共有特征峰。通过
与对照品的保留时间、紫外光谱及LCMS所得分子量信息比较,4~6号峰和9号峰分别鉴定为姜黄素、脱甲氧基
姜黄素、莪术烯醇和莪术酮。结论:建立的蓬莪术醇提取物的LCMS指纹图谱,为其质量控制提供科学依据。
[关键词] 蓬莪术;指纹图谱;液相色谱质谱联用法
[中图分类号]R284.1 [文献标识码]A [文章编号]10015302(2008)19221804
[收稿日期] 20080102
[通讯作者] 周欣,Tel:(0851)6690018,Email:alice9800@
sinacom
  莪术是姜科植物蓬莪术 Curcumaphaeocaulis
Val.、广西莪术C.kwangsinensisS.G.LeeetC.F.
Liang或温郁金 C.wenyujinY.H.ChenetC.Ling
的干燥根茎[1]。中医理论认为莪术辛、苦、温,归
肝、脾经,具行气破血,消积止痛的功效[1]。莪术具
有抗肿瘤、抗早孕、抗凝血、抗炎、抗菌、抗氧化和保
肝等活性[25]。文献多采用气相色谱或气相色谱质
谱联用对莪术的挥发性成分进行研究[67]。由于指
纹图谱质量控制模式可以综合反映药材中各主要成
分及其相对含量,近年文献报道[89]采用 GCMS对
莪术的挥发性指纹图谱进行研究。本实验选用四川
双流等中药材规范化种植基地产蓬莪术(道地药
材[10]),采用液相色谱质谱(LCMS)联用技术对蓬
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莪术药材醇提物进行指纹图谱分析,对提取方法、测
定条件、实验方法考察、图谱的相似度等进行研究,
由于质谱所具有的定性功能,所建立的蓬莪术药材
醇提物的LCMS指纹图谱为其质量控制和评价提
供了更加全面、丰富的信息。
1 材料
HP1100LCMS仪及 Chemstation色谱工作站
(美国惠普公司)。甲醇和异丙醇(色谱纯,TEDIA
COMPANY,INC);水为乐百氏纯净水;对照品莪术
酮和莪术烯醇由本室从蓬莪术中分离得到,并经波
谱确证[11];采用高效液相色谱测定,经峰面积归一
化法确证,纯度为99%。其他试剂均为分析纯。
2 方法
2.1 色谱条件 ZorbaxRXC18色谱柱(46mm×
250mm,5μm)。流动相为三元梯度溶剂系统,流动
相A为甲醇,流动相B为异丙醇,流动相C为04%
甲酸水溶液,梯度洗脱程序为ABC12∶23∶65,0~8
min;12∶23∶65~36∶167∶473,8~20min;36∶167∶
473~60∶104∶296,20~35min;60∶104∶296,35~
40min;60∶104∶296~70∶78∶222,40~50min。检
测波长254nm;流速1mL·min-1;柱温35℃;自动
进样;进样量10μL。
2.2 质谱条件 电喷雾电离(ESI);检出模式 正离
子;干燥气(N2)流速 98L·min
-1;干燥气温度350
℃;雾化室压力138kPa;毛细管电压4000V;碰撞
诱导解离电压80V。
2.3 对照品溶液的制备 取经减压干燥过夜的莪
术酮和莪术烯醇对照品,均精密称取10mg,用甲
醇溶解定容在10mL的量瓶中,摇匀,045μm微孔
滤膜过滤后进样10μL。
2.4 供试品溶液的制备 精密称取蓬莪术样品细
粉(40目)050g,以50mL甲醇冷浸12h,过滤,减
压蒸发溶剂,最后用甲醇定容在10mL的棕色量瓶
中,摇匀,045μm微孔滤膜过滤后进样10μL。
3 结果
3.1 精密度试验 取同一批供试品溶液,在所建立
的测定条件下,连续进样5次,检测指纹图谱结果表
明:5次进样得到的总离子流图(TIC)中各共有峰相
对保留时间的 RSD<094%;各共有峰的相对峰面
积的RSD<42%,5次指纹图谱的相似度大于09,
符合指纹图谱要求。
3.2 重复性试验 取同一批蓬莪术药材6份,按2.4
项下方法制备供试品溶液,在2.1色谱条件下,测定
指纹图谱。结果表明:各共有峰相对保留时间的
RSD<14%;各共有峰的相对峰面积的 RSD<
47%,6份样品指纹图谱的相似度大于09,符合指
纹图谱要求。
3.3 稳定性实验 取同一批供试品溶液,在所建立
的测定条件下,分别在0,2,4,8,12,24h进行指纹
图谱测定。结果表明:各共有峰相对保留时间的
RSD<11%;各共有峰的相对峰面积的 RSD<
48%,6次指纹图谱的相似度大于09,表明样品溶
液在24h内稳定。
3.4 蓬莪术醇提取物LCMS指纹图谱及共有指纹
峰的标定 按上述所建立的测定方法对四川产10
批次的蓬莪术药材样品的醇提取物进行指纹图谱测
定,其典型的 LCMS的色谱指纹图谱见图1,10批
次蓬莪术药材的色谱峰均在50min内全部出完,有
14个主要的共有特征峰(占总峰面积92%以上)。
A.总离子流图;B.紫外吸收图;
4.姜黄素;5.脱甲氧基姜黄素;6.莪术烯醇;9.莪术酮;其他未鉴定
图1 3号蓬莪术药材醇提物的LCMS指纹图谱
3.5 蓬莪术醇提取物LCMS指纹图谱分析 根据
《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求 (暂
行)》[12],选择9号峰(莪术酮)为参照峰,此峰为10
批蓬莪术样品所共有,以对照品莪术酮色谱峰(S)
的保留时间和峰面积为参考,分别求出各特征峰的
调整保留时间之比(α值)和相对峰面积比(峰面积
之比)。
单峰面积占总峰面积大于20%的共有峰只有1
个,是峰6;将蓬莪术醇提物的 LCMS的 TIC图与
莪术酮和莪术烯醇对照品的 LCMS的 TIC图对照
见图2分析可知,α值为072时(峰6)的组分是莪
术酮;α值为100时的组分(峰 9),是莪术烯醇,莪
术烯醇和莪术酮是蓬莪术的有效活性成分。单峰面
积占总峰面积大于10%的共有峰有3个,分别是 α
值为043时的组分(峰2)、α值为047时的组分
(峰3)和α值为091时的组分(峰8)。在10批次
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的蓬莪术醇提物中,峰2,3,6和8的相对峰面积的
范围分别是:047~078,062~103,130~195
和042~070。
A.2号蓬莪术药材醇提物;B.莪术酮;C.莪术烯醇
图2 LCMS的总离子流图
3.6 指纹图谱相似度分析 采用国家药典委员会
开发的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004
版)”对10批次蓬莪术药材的指纹图谱进行数据处
理,生成对照指纹图谱(图3)。进行相似度评价分
析,其相似度分别为 0889,0984,0912,0975,
0962,0892,0926,0972,0960,0983。
1~14蓬莪术特征峰
图3 蓬莪术醇提物的对照指纹图谱
4 讨论
4.1 检测方法 如前所述,文献报道多采用 GC
MS研究莪术的挥发性成分,王琰[1314]曾采用 HPLC
测定莪术中的3种姜黄素、吉马酮、异莪术烯醇等,
但由于姜黄素类化合物的测定波长是420nm,吉马
酮、异莪术烯醇等化合物的测定波长是210nm,无
法在同一张HPLC图谱体现所有化合物的色谱峰。
采用LCMS就可以尽可能多的体现化合物。同时,
LCMS具有定性功能的优点,ESI是一种软电离方
式,能得到较强的分子离子峰。因而采用 LCMS建
立蓬莪术醇提物的指纹图谱,基本不受不同仪器等
条件的限制。对所确定的指标成分,可根据其质谱
图进行辨认。在蓬莪术醇提物的 LCMS的 TIC图
谱中,主要的指标成分的分子离子峰如表1。研究
中利用分离得到的对照品对蓬莪术指纹图谱中的一
些谱峰进行了指认,通过与对照品的保留时间、紫外
光谱及LCMS所得分子量信息比较,确定峰4,5,6,
9分别是姜黄素 (curcumin)脱甲氧基姜黄素
(demethoxycurcumin),莪术烯醇(curcumenol),莪术
酮(curcumone),见图1。
表1 蓬莪术醇提物中指标性成分的分子离子峰
Peak 2 3 4 5 6 8 9
α 043 047 051 057 072 091 100
[M+H]+m/z 235 235 369 339 235 231 231
[M+Na]+m/z 257 257 391 361 257 253 253
相对分子质量 234 234 368 338 234 230 230
4.2 流动相的选择 蓬莪术药材醇提取物中的化
合物极性差别大,故采用梯度洗脱的方式。比较了
甲醇水系统、乙腈水系统及甲醇甲酸水溶液系统,
结果发现甲醇04%甲酸水溶液系统可以使大部分
化合物得到较好的分离;由于部分相邻化合物极性
非常相近,如峰2与峰3、峰4与峰5,故流动相中增
加了粘度较大的溶剂异丙醇,定为三元系统,流动相
A为甲醇,流动相B为异丙醇,流动相C为水(含醋
酸04%),梯度洗脱。
4.3 提取溶剂 试验中分别比较了甲醇、乙醇、异
丙醇、醋酸乙酯和乙醚对蓬莪术药材的提取效果。
结果表明甲醇提取的色谱峰的种类最多且各色谱峰
含量相对较高,故选择甲醇作为提取溶剂。
4.4 提取方法 分别比较了加热回流、超声提取和
冷浸提取3种方法,结果发现加热回流提取的效率
较差,超声提取和冷浸提取效率基本一致,因此选择
冷浸提取方法。
4.5 提取时间 采用一次冷浸方法,分别考察了8,
10,12,14,24h的冷浸时间,结果表明,一次冷浸12
h,提取的各色谱峰含量相对较高,12h以后,部分色
谱峰含量开始下降。因而选择冷浸时间为12h。
采用上述 LCMS测定莪术醇提物指纹图谱的
方法,对来自不同产地的蓬莪术、广西莪术、温莪术
等24批药材进行研究,结果发现不同种莪术药材醇
提取物所含化合物及其含量有较大差别,应分别对
其进行研究。本研究以蓬莪术为研究对象,10批药
材来源于四川蓬莪术道地产区四川的双流、乐山、彭
洲等中药材 GAP种植基地,10批药材分别采自不
同地点。
蓬莪术醇提物的LCMS的TIC图谱中,采用14
个指标成分群作为评价指标,对单峰面积占总峰面
积大于10%以上的共有峰,给出了共有峰的峰面积
比值及其误差范围;同时对照所建立的共有指纹图
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谱,10批药材指纹图谱的相似度大于089,说明四
川双流等产地的蓬莪术质量稳定。四川的蓬莪术是
道地药材,而且是蓬莪术的 GAP种植基地,对其建
立的指纹图谱,将对其他产地种植的蓬莪术质量控
制有一定的指导意义。
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FingerprintofCurcumaphaeocaulisbyLCMS
ZHOUXin,CHENHuaguo,ZHAOChao,GONGXiaojian,LIMing
(ResearchCenterofQualityControlofNaturalMedicine,GuizhouNormalUniversity,Guiyang550001,China)
[Abstract]  Objective:TostudyandestablishthefingerprintofCurcumaphaeocaulisbyhighperformanceliquid
chromatographymassspectrometry.Method:LCMSanalysiswascariedoutinaHewletPackardmodel1100liquidchromatograph
coupledwithelectrospraymassspectrometry.TheanalysiswasperformedonaZORBAXRXC18column(46mm×250mm,5μm)
withamobilephaseofmethanolisopropanolwater(mathanoicacid04%)inagradientmodeataflowrateof10mL·min-1,and
thecolumntemperatureof35℃.ThewavelengthoftheUVdetectorwassetat254nm.RSDvaluesofprecision,repeatabilityand
stabilityofthisLCMSmethodwerelessthan5%.Thetotal10batchesofC.phaeocaulisfromthediferentplacesofSichuanprovince
weredetected,anddiferentcommoditiesandpreparativemethodswerecompared.Result:ThestandardfingerprintoftheextractofC.
phaeocaulis,whichcolectedinthediferentplacesofSichuanprovince,wasoriginatedfromtheSimilarityEvaluationSystemfor
ChromatographicFingerprintofTCM2004'software,and15commonpeaksexistedinthefingerprint.Eachpeakinthefingerprintwas
separatedwelundertheaboveanalysisconditionandsimilaritiesoftheextractsofC.phaeocaulissamplesofthetenbatcheswereal
above090.BycomparisonoftheretentiontimeandtheonlineUVspectraandtheirmolecularweightsofthechemicalstandards,
peaks46and9wereidentifiedascurcumin(4),demethoxycurcumin(5),curcumenol(6),andcurcumone(9),respectively.
Conclusion:ThisLCMSfingerprintandquantitativeassessmentcanbeusedinthequalitycontrolofC.phaeocaulis.
[Keywords] LCMS;fingerprint;Curcumaphaeocaulis
[责任编辑 王亚君]
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