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Study of catalpol promoting axonal growth for cultured cortical neurons from rats

梓醇促大鼠大脑皮质神经元轴突生长的离体研究



全 文 :梓醇促大鼠大脑皮质神经元轴突生长的离体研究
万 东1,祝慧凤2,罗 勇1,谢 鹏1,徐晓玉2
(1.重庆医科大学 附属第一医院 神经内科,重庆 400016;
2.重庆医科大学 药学院,重庆 400016)
[摘要] 目的:观察梓醇对原代培养的新生SD大鼠皮质神经元生存活性及轴突生长的影响。方法:新生24h
内SD大鼠大脑皮质神经元原代培养6d后,分为空白组、终浓度分别为025,05,10,25,50mg·mL-1梓醇干
预组和终浓度为10mg·mL-1胞磷胆碱阳性药物对照组。药物干预48h后,观察细胞生长情况,用 NF200免疫
组化染色鉴定神经元,MTT法检测神经元生存活性,测微尺测量神经元轴突长度。结果:梓醇终浓度在1~5mg·
mL-1时,可明显促进神经元轴突生长,25mg·mL-1时作用最强;梓醇各浓度组神经元生存活性与空白组和胞磷
胆碱组差异无显著性。结论:梓醇能明显促进皮质神经元轴突生长,但对其生存活性无显著影响。
[关键词] 梓醇;皮质神经元;细胞培养;轴突长度
[中图分类号]R285.5 [文献标识码]A [文章编号]10015302(2007)17177104
[收稿日期] 20061220
[基金项目] 国家自然科学基金项目(30070915),重庆市科委
应用基础研究项目(渝科发计字[2002]1899)
[通讯作者] 谢鹏,Tel:(023)68485490,Fax:(023)68485111,
Email:xiepeng58@21cn.com
  梓醇(catalpol)是地黄最主要的有效成分之一,
具有利尿、缓泻、降血糖及保肝等多种药理作用[1]。
近年发现[24],梓醇对短暂性脑缺血所致脑损伤具有
明显的神经保护作用,能保护神经元免遭细胞毒性
损害,对脑外伤、脑代谢障碍、缺血性脑卒中和帕金
森病等多种脑部病变可能具有潜在的治疗价值。梓
醇是否具有“填精补髓”的作用,能否像地黄饮子一
样有效治疗脑卒中后遗症等问题目前尚未见报道。
脑卒中后神经功能恢复主要依赖于健存神经元轴突
芽形成新的连接和神经新生[5],有效促进神经元轴
突生长和神经新生的药物和手段可能对卒中后神经
功能恢复有益。因此,本研究观察梓醇对培养的大
鼠大脑皮质神经元生存活性及轴突生长的影响,旨
在为阐释滋阴类中药或方剂如地黄和地黄饮子等治
疗脑卒中的作用机制提供实验依据,并为研发新的
有效治疗脑卒中的天然药物奠定基础。
1 材料
1.1 取材动物 出生后24h内的SD大鼠乳鼠,购
自重庆医科大学实验动物中心,动物合格证号:检动
字2002A040。
1.2 主要试剂与药物 NeurobasalA,DF12培养
基,B27添加剂购自 Gibco公司(美国);胰蛋白酶、
二甲亚砜(DMSO)、四氮唑蓝(MTT)均为美国Sigma
公司产品;胎牛血清(FBS)为 Hyclone公司产品;鼠
抗人神经丝蛋白 200×103(NF200)单克隆抗体
(BM0100),SABC试剂盒(SA2001),DAB显色试剂
盒(AR1022)均为武汉博士德生物技术有限公司产
品。
梓醇对照品购自中国药品生物制品检定所(批
号110808200508);胞磷胆碱注射液为山西晋新双
鹤药业有限责任公司产品,批号200607281。
1.3 主要仪器 二氧化碳培养箱(美国 Thermo
Forma公司),96孔细胞培养板(美国 NatureGene公
司),倒置相差显微镜和测微尺(日本 Olympus公
司),550型全自动酶标仪(美国BioRad公司)。
2 方法
2.1 皮质神经元培养 无菌条件下取出生后24h
内的乳鼠大脑皮质,剪去胼胝体和其他白质,
DHank液清洗两遍,02%胰酶溶液 37℃消化 5
min,制备细胞悬液,以1×105细胞密度接种于两块
96孔板内,每孔接种100μL。在37℃,5%的 CO2
培养箱中培养,培养基为 DF12,血清浓度为15%。
培养24h后全量换成NeurobasalA神经元专用培养
基(含2%B27),选择性培养神经元,以后每3d半
量换液1次。
2.2 分组及药物干预 皮质神经元培养第6天后
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    中 国 中 药 杂 志
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进行神经元鉴定,并分组开始作相应药物干预,继续
培养48h后行指标检测。实验分为空白组、梓醇干
预组和胞磷胆碱组。空白组不用任何药物;梓醇干
预组分设终浓度为 025,05,10,25,50mg·
mL-15个组,梓醇用 NeurobasalA神经元专用培养
液配制;胞磷胆碱组为本实验阳性药物对照组,其终
浓度为1mg·mL-1。每组重复3次。
2.3 神经元鉴定及纯度检测 皮质神经元培养6d
后,弃培养液,用 002mol·L-1PBS洗 2min×3
次,加入 4%多聚甲醛室温固定 15min后,用 NF
200单克隆抗体免疫组化染色鉴定神经元。阴性对
照用002mol·L-1PBS代替一抗,其余步骤同上。
镜下观察,阳性细胞胞浆内有棕黄色颗粒沉着。在
400倍镜下分别计数3个孔各5个视野的阳性细胞
数和总细胞数,计算阳性细胞的百分比,以此代表神
经元纯度。
2.4 MTT法检测神经元生存活性 各实验组药物
干预48h后,1000r·min-1离心2min,弃原培养
液,每孔加入180μL无血清培养液及20μLMTT,
继续培养4h。1000r·min-1离心2min,弃原液,
每孔加入DMSO200μL,震荡5min,选择570nm波
长,用酶标仪检测各孔吸光度(A)。
2.5 形态学观察及轴突长度测量 神经元种植后
定时在倒置相差显微镜下观察其生长情况。药物干
预48h后,HE染色,400倍镜下测量神经元轴突起
始部至生长锥末端的距离,计为神经元轴突长度。
每组各孔随机选择5个视野,共测量100个神经元
轴突长度,所测细胞必须有晕光和突起,取其平均值
为该组结果。实验中测量目尺1个刻度表示25×
10/98μm。
2.6 统计方法 实验数据以 珋x±s表示,用 SPSS
130统计软件处理。首先采用单因素方差分析检
验各组总体均值之间的差别有无显著性;若有显著
性意义,再用t检验进行两个均值之间的比较。
3 结果
3.1 培养神经元的形态学观察 皮质神经元在接
种后分散良好,接种后最初 3h呈圆形透明,无突
起;培养4~6h可见单个细胞圆形贴壁,胞体饱满,
折光性好;培养24h,可见大部分细胞已贴壁生长,
部分细胞伸出细小突起;培养2d后更换为神经元
专用培养液,非神经元飘浮崩解死亡,神经元生长状
态良好,胞体饱满,核大,折光性强,突起延长;
第5~6d突起明显延长,折光性强,有立体感,周围
有光晕,但绝大多数神经元仅可见有一根较长的轴
突,尾部可见明显的呈纺锤形的生长锥;少部分神经
元突起有分支,部分细胞突起交织成网;第6天鉴定
并进行药物干预,干预后 2d,终浓度为 10,25,
50mg·mL-1的梓醇干预组细胞晕光明显,轴突较
空白组和胞磷胆碱组更长,更粗。
3.2 神经元鉴定及纯度 NF200免疫组化显示,
神经元胞浆内可见棕色阳性颗粒,而阴性组未见相
应的免疫反应;培养神经元纯度为95%以上。
3.3 不同药物干预对神经元生存活性的影响 
MTT法检测结果显示,梓醇各浓度组神经元生存活
性差异无显著性,梓醇各浓度组与空白组、胞磷胆碱
组的差异无显著性,见表1。
3.4 不同药物干预对神经元轴突生长的影响 药
物干预2d后,025mg·mL-1梓醇组轴突长度明显
小于空白组和胞磷胆碱组(P<005);05mg·
mL-1梓醇组轴突长度与胞磷胆碱组、空白组差异无
显著性;1,25,5mg·mL-13个梓醇组的轴突长度
均比胞磷胆碱组、空白组明显延长(P<O05),提示
梓醇浓度在1~5mg·mL-1时,可明显促进神经元
轴突延伸。梓醇各组间比较,浓度为25mg·mL-1
时对神经元轴突生长促进作用最强;浓度增至5mg
·mL-1时,其促进作用较25mg·mL-1组减弱,见
表1。
表1 不同浓度药物干预对神经元生存活性
及轴突长度的影响(珋x±s,n=3)
组别
剂量
/mg·mL-1
A570
轴突
/μm
空白   - 0463±0042 72779±21404
胞磷胆碱 10 0464±0128 72562±15783
梓醇   025 0357±0100 58107±125481,3)
  05 0338±0126 78231±16757
  10 0351±0069 98098±383561,3)
  25 0358±0132 132885±409822,4)
  50 0325±0195 106122±400872,3)
  注:与空白组比较1)P<005,2)P<001;与胞磷胆碱组比较
3)P<005,4)P<001
4 讨论
地黄是滋阴、补血、填精、补髓的代表中药,既往
研究表明[6],“补肾填髓”中药可促进神经元细胞能
量代谢和利用,增加内源性神经营养因子生成,抑制
神经毒素的生成,从而减少神经元死亡,促进神经元
存活与再生。但地黄类药物对神经元生存活性和轴
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突生长有无影响尚缺乏直接的实验依据。
本研究观察了地黄的主要活性成分梓醇对离
体培养的新生大鼠皮质神经元生存活性及轴突生长
的影响。结果发现,梓醇终浓度在1~5mg·mL-1
时可明显促进神经元轴突生长,25mg·mL-1时促
进作用最强(P<005),提示适宜浓度的梓醇能促
进大脑皮质神经元轴突生长。既往报道多种葡萄糖
苷类物质,包括梓醇,对 PC12细胞的轴突生长有分
化促进作用[7],但国内外尚未见梓醇促进大脑皮质
神经元轴突生长的报道。本研究结果证实,一定浓
度范围的梓醇可明显促进大脑皮质神经元轴突生
长,而脑卒中后神经元轴突再生障碍是其功能恢复
不全或根本无法恢复的主要原因,为地黄及其组方
地黄饮子有效治疗脑卒中后遗症提供了较直接的细
胞学依据。
本研究发现,梓醇终浓度增至5mg·mL-1时,
其促神经元轴突生长的作用仍然存在,但较25mg
·mL-1组已呈下降趋势,提示高浓度梓醇可能会表
现出一定的细胞毒性作用。这与 Li等[4]动物实验
结果相吻合,他们发现梓醇剂量为100和50mg·
kg-1时,动物的死亡率为 100%,剂量为 20mg·
kg-1时,动物的死亡率为 25%。本研究还发现,梓
醇终浓度为025mg·mL-1时不促进神经元轴突生
长,反而表现出明显的抑制效应,其原因目前尚不明
确,是否与梓醇对神经元轴突生长存在双向调节作
用有关尚需进一步研究。
本研究选用的阳性对照药物胞磷胆碱在临床上
应用甚广,通常用于脑卒中功能恢复期,以改善患者
的功能预后[8]。但本研究结果发现,1mg·mL-1的
胞磷胆碱对离体培养的大鼠皮质神经元的生存活性
及其轴突生长均未显示出明显的促进作用。提示临
床上真正能有效促进脑卒中后神经修复的药物非常
缺乏,梓醇对脑损伤(包括脑卒中)后神经修复极具
潜力。
总之,本研究结果进一步证实了梓醇是地黄
“填精补髓”的重要物质基础,促神经元轴突生长是
其“填精补髓”的现代医学内涵之一;同时也预示了
梓醇对中枢神经系统损伤后神经再生可能会有潜在
的治疗价值。
[参考文献]
[1] 刘庆丰,孙启祥,胡雅儿,等.地黄中的梓醇对 β肾上腺素受体
cAMP系统的调整作用[J].放射免疫学杂志,2004,17(5):
358.
[2] LiDQ,BaoYM,LiY,etal.Catalpolmodulatestheexpressions
ofBcl2andBaxandatenuatesapoptosisingerbilsafterischemic
injury[J].BrainRes,2006,1115(1):179.
[3] LiDQ,LiY,LiuY,etal.CatalpolpreventsthelossofCA1
hippocampalneuronsandreducesworkingerorsingerbilsafteris
chemiareperfusioninjury[J].Toxicon,2005,46(8):845.
[4] LiDQ,DuanYL,BaoYM,etal.Neuroprotectionofcatalpolin
transientglobalischemiaingerbils[J].NeurosciRes,2004,50
(2):169.
[5] CarmichaelST.Celularandmolecularmechanismsofneuralre
pairafterstroke:makingwaves[J].AnnNeurol,2006,59(5):
735.
[6] 李 林,魏海峰,张 兰,等.中医“肾生髓,脑为髓海”现代生
物学基础探讨[J].中国中药杂志,2006,31(17):1397,1417.
[7] YamazakiM,ChibaK,MohriT.Neuritogenicefectofnaturaliri
doidcompoundsonPC12hcelsanditspossiblerelationtosigna
lingproteinkinases[J].BiolPharmBul,1996,19(6):791.
[8] AdibhatlaRM,HatcherJF,DempseyRJ.Citicoline:neuropro
tectivemechanismsincerebralischemia[J].JNeurochem,2002,
80(1):12.
Studyofcatalpolpromotingaxonalgrowthforculturedcortical
neuronsfromrats
WANDong1,ZHUHuifeng2,LUOYong1,XIEPeng1,XUXiaoyu2
(1.DepartmentofNeurology,FirstAfiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China;
2.PharmacyColegeofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China)
[Abstract] Objective:Toexploretheefectsofdiferentconcentrationofcatalpolonthecelsurvivalandaxonalgrowthofcor
ticalneuronsculturedinvitrofrom24hnewlybornrat.Method:Primaryculturedcorticalneuronsfrom24hnewlybornratweredis
sociatedandcultured.Thediferentconcentrationofcatalpoland1mg·mL-1citicolinewereaddedtothecultureplatesfor48h,and
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thefinalofcatalpolconcentrationwere025,05,1,25,5mg·mL-1,respectively.ThecorticalneuronwasidentifiedbyNF200
antigenanditssurvivalactivitydetectedbyMTTassay.Theaxonalgrowthofculturedcorticalneuronwereobservedbyinvertedmicros
copywithmicrometer.Result:Immunocytochemistrydemonstratedmorethan95% oftheprimaryculturedcorticalneuronswereposi
tiveforNF200antigen,whichindicatedtheculturedcelswereneurons.Neuronssurvivedgrowingontheconcentrationof025,05,
1,25,5mg·mL-1.Comparedwithblankand1mg·mL-1citicolinegroup,neuronssurvivalrateswerenotstatisticalsignificant
diference.However,itdemonstratedthatcatalpolsignificantlypromotedaxonalgrowthfrom15mg·mL-1(P<005).Interestedly,
comparedwiththedoseof25mg·mL-1,axonalgrowthwasshorteratthedoseof5mg·mL-1,and25mg·mL-1catalpolshowed
thestrongestpromotionefect.Conclusion:Thecatalpolcanenhancecorticalneuronaxonalgrowth,butnotpromotecorticalneuron
survival.
[Keywords] catalpol;corticalneurons;primaryculture;axonlength
[责任编辑 古云侠]
鹅绒藤对小鼠镇静催眠作用的研究
彭晓东,闫乾顺,王 锐,杨卫东,彭建中
(宁夏医学院,宁夏 银川 750004)
[摘要] 目的:研究鹅绒藤全草水提物和氯仿提取物对小鼠的镇静催眠作用。方法:观察鹅绒藤全草提取物
对小鼠正常自主活动的影响,以及对阈下戊巴比妥钠镇静催眠作用的协同作用;采用转轮法测定提取物对小鼠的
最小中枢神经系统毒性。结果:腹腔给予鹅绒藤全草提取物对实验小鼠自主活动有剂量依赖性抑制作用;对阈下
剂量戊巴比妥钠(30mg·kg-1,ip)的催眠效应有协同作用,水提物作用的ED50为236g·kg
-1,氯仿提取物作用的
ED50为075g·kg
-1;2种提取物在本实验条件下,未呈现出中枢神经系统毒性。结论:鹅绒藤全草水提物和氯仿
提取物对实验小鼠有镇静催眠作用。
[关键词] 鹅绒藤;自由活动;镇静催眠
[中图分类号]R285.5 [文献标识码]A [文章编号]10015302(2007)17177403
[收稿日期] 20061015
[通讯作者] 彭晓东,Tel:(0951)4075005,4072614,Email:
pengxd@nxmc.edu.cn
  鹅绒藤别名心叶牛皮消,系萝雐科Asclepiadace
ae鹅绒藤属植物,宁夏全区普遍分布,民间以其根及
茎的乳汁入药[1]。作者已有的研究结果表明[2],宁夏
产鹅绒藤的根、茎正丁醇提取物有较强的抗超强电休
克惊厥(maximalelectroshockseizure,MES)和抗戊四
氮惊厥(metrazolseizuretest,MET)的作用。近来,作
者对宁夏产鹅绒藤的抗惊厥药理作用的进一步研究
表明,其水提物可以对抗戊四氮惊厥,氯仿提物无对
抗超强电休克惊厥作用。而氯仿提取物可以MES惊
厥,其水体物无对抗作用。结果说明鹅绒藤抗惊厥作
用广泛,有效成分可能比较分散。
研究表明,抗惊厥药物的筛选,除了要求药物具
有好的抗惊厥药效学特性外,其对中枢抑制作用的
强度,也是评价其筛选前景的重要因素。即对中枢
的抑制作用的强度越低,临床治疗的中枢抑制不良
反应也就越弱,病人的治疗依从性也就越好。所以,
本研究拟采用自主活动实验和阈下剂量戊巴比妥钠
催眠作用的协同实验,观察鹅绒藤全草提取物对实
验小鼠中枢神经系统的影响,进一步评价其作为抗
惊厥药物的开发前景。
1 材料
1.1 动物
ICR小鼠,体重18~22g,雌雄各半。宁夏医学
院实验动物中心提供,许可证号:SCXK(宁)2005
0001。
1.2 药品试剂
苯妥因钠,戊巴比妥钠为 Sigma公司产品。鹅
绒藤全草,秋季采集于宁夏银川南郊,经我院化学室
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