全 文 ：ｔｅｄ．Ａｔｔｈｅｓａｍｅｔｉｍｅ，ａｃｔｉｖｉｔｙｏｆＮａ＋Ｋ＋ＡＴＰａｓｅａｎｄＣａ２＋ＡＴＰａｓｅ，ｃｏｎｔｅｎｔｏｆｗａｔｅｒｉｎｂｒａｉｎｔｉｓｓｕｅｗｅｒｅｍｅａｓｕｒｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔ：Ｃｏｍ
ｐａｒｅｄｗｉｔｈｃｅｒｅｂｒａｌｉｓｃｈｅｍｉａｇｒｏｕｐ，ＥＣａｎｄｃｏｎｔｅｎｔｏｆＡＴＰ，ＡＤＰ，ＰＣｒｉｎＳａｌＢｔｒｅａｔｅｄｇｒｏｕｐｈｅｉｇｈｔｅｎｅｄｅｖｉｄｅｎｔｌｙ（Ｐ＜００１）．Ｍｏｒｅ
ｏｖｅｒ，ａｃｔｉｖｉｔｙｏｆＮａ＋Ｋ＋ＡＴＰａｓｅａｎｄＣａ２＋ＡＴＰａｓｅｉｎＳａｌＢｔｒｅａｔｅｄｇｒｏｕｐｈａｄａｒｅｍａｒｋａｂｌｅｉｎｃｒｅａｓｅ（Ｐ＜００１）．Ｂｕｔｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆ
ｗａｔｅｒｉｎｂｒａｉｎｔｉｓｓｕｅｄｅｃｒｅａｓｅｄｍａｒｋｅｄｌｙ（Ｐ＜００５）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：ＴｈｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｔｈａｔＳａｌＢｃａｎｒｅｌｉｅｖｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆｗａｔｅｒｉｎｂｒａｉｎｔｉｓ
ｓｕｅｏｆｃｅｒｅｂｒａｌｉｓｃｈｅｍｉａｉｎｍｉｃｅ，ｍａｙｂｅａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｉｍｐｒｏｖｉｎｇｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆｈｉｇｈｅｎｅｒｇｙｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃａｃｉｄｃｏｍｐｏｕｎｄｓａｎｄｅｎｈａｎ
ｃｉｎｇｔｈｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆＡＴＰａｓｅ．
［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］ ｃｅｒｅｂｒａｌｉｓｃｈｅｍｉａ；ｅｎｅｒｇｙｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ；ｓａｌｖｉａｎｏｌｉｃａｃｉｄＢ；ｍｉｃｅ
［责任编辑 古云侠］
［收稿日期］ ２００６０５２０
［基金项目］ 山东省自然科学基金（Ｙ２００５Ｃ５７）
［通讯作者］ 李贵海，Ｔｅｌ：（０５３１）８２９４９８０３，Ｆａｘ：（０５３１）８２９６
８４７３，Ｅｍａｉｌ：ｇｕｉｈａｉ９９＠１６３．ｃｏｍ
黄连解毒汤醇提物预防给药对
ＭＤＲ模型小鼠相关基因表达产物的影响
李贵海１，孙付军１，陈 锋２，杨书斌１，张 军１
（１．山东省中医药研究院，山东 济南 ２５００１４；２．山东省肿瘤防治研究院，山东 济南 ２５０１１７）
［摘要］ 目的：观察黄连解毒汤７０％醇提物预防给药对小鼠多药耐药（ＭＤＲ）基因表达产物 Ｐ１７０、肺耐药蛋
白（ＬＲＰ）和拓扑异构酶Ｉ（ＴＯＰＯＩ）的影响，探讨其干预ＭＤＲ的分子生物学基础，指导临床应用以预防ＭＤＲ的产
生。方法：小鼠随机分为非耐药模型组、耐药模型组、黄连解毒汤７０％醇提物１００，５０ｍｇ·ｋｇ－１组，模拟临床ＰＦＣ方
案，建立小鼠Ｓ１８０肿瘤细胞多药耐药在体模型，同时给予黄连解毒汤７０％醇提物４周，流式细胞仪荧光检测Ｐ１７０，
ＬＲＰ，ＴＯＰＯＩ。结果：黄连解毒汤７０％醇提物明显降低化疗诱导后耐药细胞 Ｐ１７０，ＬＲＰ的表达率和 ＲＯＰＯＩ活性。
结论：黄连解毒汤７０％醇提物可通过对相关生物活性物质的调节，干预和逆转化疗诱发的肿瘤ＭＤＲ的产生。
［关键词］ 黄连解毒汤７０％醇提物；肿瘤多药耐药；小鼠；Ｐ１７０；ＬＲＰ；ＴＯＰＯＩ
［中图分类号］Ｒ２８５．５ ［文献标识码］Ａ ［文章编号］１００１５３０２（２００７）１８１９０６０３
黄连解毒汤原载于《外台秘要》，主要由黄连、
黄芩、黄柏和栀子４味药组成，为清热解毒代表方。
现代药物学研究证实，该方含有小檗碱（ｂｅｒｂｅｒｉｎｅ）、
黄连碱（ｃｏｐｔｉｓｉｎｅ）、甲基黄连碱（ｗｏｒｅｎｉｎｅ）、药根碱
（ｊａｔｒｏｒｈｉｚｉｎｅ）、黄柏碱（ｐｈｅｌｏｄｅｄｒｉｎｅ）、掌叶防己碱
（ｐａｌｍａｔｉｎｅ）、蝙蝠葛碱（ｍｅｎｉｓｐｅｒｉｎｅ）等多种生物
碱［１］。本研究在建立了小鼠 Ｓ１８０肿瘤多药耐药在
体模型的基础上［２，３］，观察了黄连解毒汤７０％醇提
物对小鼠Ｓ１８０肿瘤细胞多药耐药相关分子生物活
性物质表达或活性的影响，以探讨其干预化疗多药
耐药的作用和作用机制。
１ 材料
１．１ 药品 黄连解毒汤７０％醇提物由本院植化室
杨书斌教授协助制备。制备方法：黄连６ｇ，黄柏６
ｇ，黄芩６ｇ，栀子６ｇ粉碎，７０％乙醇回流提取２次，
每次１５ｈ，４０℃旋转蒸发得干膏５７ｇ，含小檗碱
６０６％，黄芩苷６４３％，栀子苷５４８％，研磨为细粉
配成１％和０５％的混悬液备用；注射用顺铂：山东
齐鲁制药厂产品，批号０１１１１６１１；环磷酰胺：上海华
联制药有限公司产品，批号０３０７０３；５氟尿嘧啶（５
ＦＵ）：天津金耀氨基酸有限公司产品。
１．２ 动物 昆明种小鼠，由山东大学实验动物中心
提供，合格证号：鲁动质字２００２１００２３；小鼠 Ｓ１８０腹
水型瘤种鼠：由山东医科大学药物所药理室提供。
１．３ 试剂 碘化嘧啶 ＰＩ：Ｃ２７Ｈ３４Ｎ４Ｉ２，编号
［２５５３５１６４］，美国Ｓｉｇａｒｍ公司产品，批号２４７０８１
０；ＭＤＲ表达产物 Ｐ１７０（Ｐ糖蛋白，Ｐｇｐ），ＴＯＰＯＩ，
ＬＲＰ，异硫氢酸荧光素（ＦＩＴＣ）标记的单克隆抗体
ＩｇＧ１及免疫阴性对照品ＩｇＧ１ＦＩＴＣ均为美国Ｐｈａｒｍ
ｉｎｇｅｎ公司产品，由北京岳泰生物公司提供。
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第３２卷第１８期
２００７年９月
中 国 中 药 杂 志
ＣｈｉｎａＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭａｔｅｒｉａＭｅｄｉｃａ
Ｖｏｌ．３２，Ｉｓｓｕｅ １８
Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ，２００７
１．４ 仪器 ＦＡＣＳｃａｎ型流式细胞仪：美国 ＢＤ公司
产品；梅特勒 ＧＢ－３０３电子天平：美国梅特勒公司
产品。
２ 方法
２．１ 耐药模型的建立及分组 小鼠１８～２２ｇ，随机
分为４组，每组１４只，分别为非耐药模型组、耐药模
型组、黄连解毒汤７０％醇提物１００，５０ｍｇ·ｋｇ－１组。
无菌抽出３只Ｓ１８０小鼠腹水，用无菌生理盐水稀释
至含瘤细胞１×１０６个／ｍＬ，摇匀，每只小鼠腹腔接种
０２ｍＬ，接种２４ｈ后（非耐药模型组除外），均开始
给予顺铂 ３ｍｇ·ｋｇ－１腹腔注射（ｉｐ），每周１次；环
磷酰胺和 ５ＦＵ各 ３ｍｇ·ｋｇ－１灌胃（ｉｇ），每天 １
次［２，３］。接种第１５天，存活的小鼠无菌抽出腹水，
一对一传代，传代 ２４ｈ后，再给予上述化疗药物。
在化疗诱导的同时，耐药模型组和非耐药模型组，给
予凉开水００２ｍＬ·ｇ－１灌胃，黄连解毒汤７０％醇提
物１００，５０ｍｇ·ｋｇ－１组分别给予０５％，０２５％的黄
连解毒汤混悬液００２ｍＬ·ｇ－１灌胃，共给药４周。
停药２４ｈ后，无菌抽出各小鼠腹水２ｍＬ，入肝
素抗凝试管中，１５００ｒ·ｍｉｎ－１离心５ｍｉｎ，去除上清
液，由ｐＨ７４ＰＢＳ液漂洗，离心洗脱３次，以７０％乙
醇１０ｍＬ固定，４℃保存，待测。
２．２ ＭＤＲ表达产物 Ｐ１７０，ＴＯＰＯＩ，ＬＲＰ表达的检
测 取７０％乙醇固定的小鼠 Ｓ１８０细胞，由 ｐＨ７４
ＰＢＳ液稀释后，１５００ｒ·ｍｉｎ－１离心５ｍｉｎ，再次洗脱
１次，并调整细胞密度为１×１０６个／ｍＬ，摇匀，取细
胞悬液５００μＬ，加入各自相对应的异硫氢酸荧光素
标记的鼠抗人的单克隆抗体 ＩｇＧ１工作液２０μＬ，另
各取一支阴性对照抗 ＩｇＧ１ＦＩＴＣ，３７℃避光反应３０
ｍｉｎ后，由流式细胞仪荧光检测。仪器的检测变异
系数＜２％，测定１万个细胞的上述３种相关生物分
子的表达，激发光波长均为４８８ｎｍ。
２．３ 对Ｐ１７０，ＴＯＰＯＩ，ＬＲＰ抑制率的计算
抑制率（％）＝（耐药模型组表达率 －７０％醇提物组表
达率）／耐药模型组表达率×１００％
２．４ 统计方法 表达率采用 珋ｘ±ｓ的形式表示，
ＳＰＳＳ１１０进行统计，ｔ检验进行组间统计。
３ 结果
３．１ 对ＭＤＲ模型小鼠耐药细胞表达产物 Ｐ１７０过
度表达的影响 经模拟临床化疗诱导４周后，腹水
型小鼠 Ｓ１８０细胞其 Ｐ１７０表达明显增加，与非耐药
模型组比较具有显著性差异（Ｐ＜００１）；黄连解毒
汤７０％醇提物显著抑制化疗诱导后的 Ｓ１８０细胞
Ｐ１７０的过度表达（Ｐ＜００１），结果见表１。
表１ 黄连解毒汤７０％醇提物对ＭＤＲ模型小鼠
Ｓ１８０细胞Ｐ１７０表达的影响（珋ｘ±ｓ）
组别
剂量
／ｍｇ·ｋｇ－１
ｎ
表达率
／％
抑制率
／％
非耐药模型 － １１ ３６１±１７５２） －
耐药模型 － １０ １３１３±５３３ －
黄连解毒汤 １００ １０ ６１２±３３２２） ５３３９
５０ １０ ８３５±２３６２） ３６４１
注：与模型组比较１）Ｐ＜００５，２）Ｐ＜００１（表２，３同）
３．２ 对 ＭＤＲ模型小鼠耐药相关蛋白 ＬＲＰ过度表
达的影响 经模拟临床化疗诱导后的小鼠 Ｓ１８０细
胞表达耐药相关蛋白肺耐药蛋白（ｌｕｎｇｒｅｓｉｓｔａｎｔｐｒｏ
ｔｅｉｎ．ＬＲＰ）明显增加，与非耐药模型组比较具有显
著性差异（Ｐ＜００１）。黄连解毒汤７０％醇提物能有
效的降低化疗诱导小鼠 Ｓ１８０细胞 ＬＲＰ的表达率。
抑制ＬＲＰ的过度表达（Ｐ＜００１）。结果见表２。
表２ 黄连解毒汤７０％醇提物对ＭＤＲ模型小鼠
Ｓ１８０细胞ＬＲＰ表达的影响（珋ｘ±ｓ）
组别
剂量
／ｍｇ·ｋｇ－１
ｎ
表达率
／％
抑制率
／％
非耐药模型 － １１ ４９９±１７５２） －
耐药模型 － １０ ６２７３±１５２４ －
黄连解毒汤 １００ １０ ５８０±３９０２） ９０７５
５０ １０ １１９７±５１０２） ８０９２
３．３ 对ＭＤＲ模型小鼠细胞 ＤＮＡ拓扑异构酶Ⅱ活
性的影响 结果表明，给予模拟临床化疗诱导后的
小鼠Ｓ１８０细胞ＴＯＰＯＩｇ表达明显增强，而黄连解毒
汤醇提物明显抑制化疗诱导后 Ｓ１８０细胞的 ＴＯＰＯ
Ⅱ表达，说明抑制 ＴＯＰＯＩｇ表达是黄连解毒汤醇提
物干预肿瘤细胞ＭＤＲ的途径之一。见表３。
表３ 黄连解毒汤７０％醇提物对ＭＤＲ模型小鼠
Ｓ１８０细胞ＴＯＰＯＩｇ表达的影响（珋ｘ±ｓ）
组别
剂量
／ｍｇ·ｋｇ－１
ｎ
ＴＯＰＯＩｇ表达率
／％
抑制率
／％
非耐药模型 － １１ ５４６±１９５２） －
耐药模型 － １０ ２６６６±１００２ －
黄连解毒汤 １００ １０ １５９５±８３１２） ４０１７
５０ １０ ２０３１±２１０１） ２３８２
４ 讨论
肿瘤化疗获得性多药耐药ＭＤＲ的发生，可见到
肿瘤细胞多药耐药基因、耐药蛋白过度表达，肿瘤细
胞ＤＮＡ拓扑异构酶ＴＯＰＯＩ等相关酶活性增加等表
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现。耐药基因和耐药蛋白的过度表达时，可将化疗药
物经跨膜转运排出细胞并阻止药物进入细胞核，使化
疗药物不能发挥细胞毒性作用［４６］；ＴＯＰＯＩ表达增
强，增强 ＤＮＡ修复能力，拮抗化疗药物的细胞毒
性［６］，还原性谷胱苷肽酶活性增加，与化疗药物结合，
阻止化疗药物作用于肿瘤细胞，而产生耐药性。中药
生物碱具有干预和逆转肿瘤多药耐药的作用［７１０］。
本研究模拟临床ＰＦＣ化疗方案，化疗诱导小鼠
Ｓ１８０细胞表达产生耐药性，观察了黄连解毒汤７０％
醇提物体内给药对肿瘤细胞耐药相关生物活性物质
Ｐ１７０，ＬＲＰ，ＴＯＰＯＩ表达的影响，结果显示黄连解毒
汤７０％醇提物预防给药可以明显降低模拟临床化
疗所诱导的小鼠Ｓ１８０细胞耐药基因ＭＤＲ的表达产
物Ｐ１７０、肺耐药蛋白 ＬＲＰ的过度表达，抑制细胞拓
扑异构酶 Ｉ（ＴＯＰＯＩ）的活性。提示黄连解毒汤
７０％醇提物预防给药可以抑制肿瘤细胞多药耐药的
产生，其干预机制可能是通过对耐药基因和耐药蛋
白表达的调控，相关酶活性的影响而实现的。
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细胞获得性多药耐药相关生物因子的过度表达［Ｊ］．中国中
药杂志，２００５，３０（２３）：１８４４．
ＥｆｅｃｔｏｎｍｏｕｓｅＳ１８０ＭＤＲｔｕｍｏｕｒｃｅｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄｆａｃｔｏｒｉａｌｍａｔｅｒｂｙ７０％ ｅｔｈａｎｏｌｗｉｔｈＨｕａｎｇｌｉａｎＪｉｅｄｕＴａｎｇ
ＬＩＧｕｉｈａｉ１，ＳＵＮＦｕｊｕｎ１，ＣＨＥＮＦｅｎｇ２，ＹＡＮＧＳｈｕｂｉｎ１，ＺＨＡＮＧＪｕｎ１
（１．ＳｈａｎｄｏｎｇＡｃａｄｅｍｙｏｆＣｈｉｎｅｓｅｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅ，Ｊｉｎａｎ２５００１４，Ｃｈｉｎａ；
２．ＳｈａｎｄｏｎｇＴｕｍｏｕｒＨｏｓｐｉｔａｌ，Ｊｉｎａｎ２５０１１７，Ｃｈｉｎａ）
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＴｏｏｂｓｅｒｖｅｔｈｅｅｆｅｃｔｏｎＰ１７０，ＬＲＰ，ＴＯＰＯＩｏｆＳ１８０ｔｕｍｏｕｒＭＤＲｍｉｃｅｆｏｒｍａｔｅｒｂｙ７０％ ｅｔｈａｎｏｌ
ｗｉｔｈＨｕａｎｇｌｉａｎＪｉｅｄｕＴａｎｇ，ａｎｄｔｈｅｎｄｉｓｃｕｓｓｔｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｙｂａｓｅｆｏｒｃｌｉｎｉｃ．Ｍｅｔｈｏｄ：１８２２ｇｒａｍｍｅＫＭｒａｔｓｗｅｒｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ
ｆｏｕｒｇｒｏｕｐｓｆｏｒｎｏｒｍａｌＳ１８０ｔｕｍｏｕｒｃｅｌｇｒｏｕｐ，ｍａｔｅｒｂｙ７０％ ｅｔｈａｎｏｌｗｉｔｈＨｕａｎｇｌｉａｎＪｉｅｄｅｔａｎｇ１００ｍｇ·ｋｇ－１ａｎｄ５０ｍｇ·ｋｇ－１ｉｎ
ｒａｎｄｏｍＥｖｅｒｙｒａｔｗａｓｇｉｖｅｎＳ１８０ｃｅｌ０２ｍＬｂｙｃｅｌｉａｃ，ａｎｄａｆｔｅｒ２４ｈｏｕｒｓｇｉｖｅＣｉｓｐｌａｔｉｎｆｏｒＩｎｊｅｃｔｉｖｅ３ｍｇ·ｋｇ－１，ｉｐ，ｏｎｃｅａ
ｗｅｅｋＡｎｄｇｉｖｅｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅａｎｄ５ＦＵ３ｍｇ·ｋｇ－１，ｉｇ，ｏｎｃｅｅｖｅｒｙｄａｙＡｆｔｅｒ１５ｄａｙｓ，ｃｏｌｅｃｔｌｉｖｅｌｙｒａｔｓａｓｃｉｔｅｓａｎｄｇｉｖｅｉｔｆｏｒ
ｏｎｅｆｏｌｄｎｏｒｍａｌｒａｔＡｎｄｔｈｅｎｒｅｐｅａｔｂｅｆｏｒｅｐｒｏｃｅｓｓＡｔｔｈｅｓａｍｅｔｉｍｅ，ｅｖｅｒｙｇｒｏｕｐｗａｓｇｉｖｅｎｃｏｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇｍｅｄｉｃｉｎｅｆｏｒ０２ｍＬ·１０
ｇ－１Ｔｈｅｎｏｒｍａｌｇｒｏｕｐａｎｄｔｈｅｍｏｄｅｌｇｒｏｕｐｗｅｒｅｇｉｖｅｎｔｈｅｓａｍｅｃｕｂａｇｅｗａｔｅｒ，ａｌｔｏｇｅｔｈｅｒｆｏｒｅｗｅｅｋｓＡｔｌａｓｔｏｂｓｅｒｖｄｔｈｅＰ１７０，ＬＲＰ，
ＴＯＰＯⅡ ｂｙｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙＲｅｓｕｌｔ：Ｍａｔｅｒｂｙ７０％ ｅｔｈａｎｏｌｗｉｔｈＨｕａｎｇｌｉａｎＪｉｅｄｕＴａｎｇｃｏｕｌｄｏｂｖｉｏｕｓｌｙｒｅｄｕｃｅｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｏｆＰ１７０ａｎｄ
ＬＲＰ，ａｎｄｔｈｅａｃｔｉｖｉａｔｉｏｎｏｆＴＯＰＯＩ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｍａｔｅｒｂｙ７０％ ｅｔｈａｎｏｌｗｉｔｈＨｕａｎｇｌｉａｎＪｉｅｄｕＴａｎｇｃａｎｉｎｔｅｒｖｅｎｅｔｈｅｏｃｕｒｅｎｃｅｏｆ
ｔｈｅｍｕｌｔｉｄｒｕｇｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｏｆｔｕｍｏｕｒｃｅｌｓｂｙｒｅｇｕｌａｔｉｎｇｔｈｅｂｉｏｌｏｇｙｇｅｎｅ．
［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］ ｍａｔｅｒｂｙ７０％ ｅｔｈａｎｏｌｗｉｔｈＨｕａｎｇｌｉａｎＪｉｅｄｕＴａｎｇ；ｍｕｌｔｉｄｒｕｇｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ；ｍｏｕｓｅ；Ｐ１７０；ＬＲＰ；ＴＯＰＯＩ
［责任编辑 古云侠］
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