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黄连解毒汤70％醇提物对小鼠8180细胞MDR相关因子
表达的逆转作用
李贵海，孙付军，董 学，李晓晶，杨书斌
(山东省中医药研究院，山东济南250014)
摘 要：目的 观察黄连解毒汤70％醇提物对小鼠多药耐药(MDR)基因表达产物Pm、肺耐药蛋白(LRP)和拓
扑异构酶I(TOPOI)的影响，明确其干预MDR的分子生物学基础，指导临床应用其逆转MDR的产生。方法
模拟临床PFC方案，建立小鼠S。肿瘤细胞MDR在体模型，同时给予黄连解毒汤70％醇提物10d，流式细胞仪
荧光检测P。，。、LRP、TOPOI。结果 黄连解毒汤70％醇提物明显逆转S。。。肿瘤细胞MDR相关基因表达产物
P。，。、LRP、TOPOⅡ的过度表达。结论黄连解毒汤70％醇提物可通过逆转相关生物活性物质的过度表达，逆转
化疗诱发的肿瘤MDR的产生。
关键词：黄连解毒汤70％醇提物；肿瘤多药耐药；P，70-LRP；TOPO1I
中图分类号：R286．91 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2007)07—1050—03
Revertionof700AethanolicextractfromHuanglianJ eduDecoction
onmiceS180cellMDRrelativefactorexpression
LIGui-hai，SUNFu—jun，DONGXue，LIXiao—jing，YANGShu—bin
(ShandongAcademyofTraditionalChineseMedicine，Jinan250014，China)
Keywords：70％ethanolicextractfromHuanglianJ eduDecoction；multi—drugres stanceoftumour；
P170；LRP；TOP0Ⅱ
黄连解毒汤主要由黄连、黄芩、黄柏和栀子4味
药组成，为清热解毒代表方。现代药物学研究证实，
该方含有小檗碱、黄连碱、甲基黄连碱、药根碱、黄柏
碱、掌叶防己碱、蝙蝠葛碱等多种生物碱叫。生物碱
是一类有广泛生物学效应的中药成分，近年来国内
学者对其干预肿瘤细胞多药耐药(MDR)的研究做
了大量工作，但大多限于体外实验，而体外细胞培养
难以客观模拟临床化疗所致MDR的在体环境。本
研究在建立了小鼠S，。。肿瘤MDR在体模型的基础
上‘2，3|，观察黄连解毒汤70％醇提物对小鼠S。。。肿
收稿日期：2007一01—06
基金项目：山东省自然科学基金资助项目(Y2005C57)
作者简介：李贵海(1959一)，男，研究员，从事中药抗肿瘤作用及机制的研究，在本领域发表论文数十篇。
Tel：(0531)82949803Fax：( 531)82968473E—mail：guihai99@163．corn
万方数据
中草喃ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第7期2007年7月·1051·
瘤细胞MDR相关分子生物活性物质表达或活性的
影响，以探讨其干预化疗MDR的作用和作用机制。
1材料
1．1药品：黄连解毒汤70％醇提物由本院植化室
杨书斌教授协助制备。制备方法：黄连6g、黄柏6
g、黄芩6g、栀子6g，粉碎，70％乙醇回流提取2
次，每次1．5h，浓缩得干膏5．7g，含小檗碱
6．06oA、黄芩苷6．43％、栀子苷5．48％，研磨为细粉
配成10、5mg／mL的混悬液备用。注射用顺铂：山东
齐鲁制药厂产品，批号01111611；环磷酰胺(CTX)：
上海华联制药有限公司产品，批号030703；5一氟尿嘧
啶(5一Fu)：天津金耀氨基酸有限公司产品。
1．2动物：昆明种小鼠，由山东大学实验动物中心
提供，合格证号：鲁动质字200210023；小鼠S。。。腹
水型瘤种鼠：由山东医科大学药物所药理室提供。
1．3试剂：碘化丙啶(PI)为美国Sigam公司产
品，多药耐药基因(MDRl)表达产物P170,DNA拓
扑异构酶Ⅱ(TOPOⅡ)、肺耐药蛋白(LRP)、异硫
氢酸荧光素(FITC)标记的单克隆抗体IgGz及免
疫阴性对照品IgG。一FITC均为美国Pharmingen公
司产品，由北京岳泰生物公司提供。
1．4仪器：FACScan型流式细胞仪，美国BD公司
产品；梅特勒GB一303电子天平，美国梅特勒公司
产品。
2方法
2．1 小鼠S。。。肿瘤细胞耐药模型的建立及小鼠分
组：18～22g昆明种小鼠，模拟临床化疗PFC方
案，无菌抽出3只S。。。小鼠腹水，由无菌NS稀释至
含瘤细胞1×i06／mL，摇匀，每只小鼠ip接种0．2
mL，接种24h后，开始ip给予顺铂3mg／kg，每周
1次；igCTX和5-Fu各3mg／kg，每天1次[2’3]，连
续4周(两周时一对一传代一次)。获得S。。。小鼠
MDR模型，无菌抽取化疗诱导4周的小鼠腹水，无
菌NS稀释至含瘤细胞1×106／mL，每鼠接种0．2
mL，并取各化疗诱导4周的模型小鼠腹水2mL，入
肝素抗凝试管中，1500r／min离心5min，去除上清
液，由pH7．4PBS液漂洗，离心洗脱3次，以70％
乙醇1．0mL固定，4℃保存。小鼠接种耐药S，。。细
胞液24h后，随机分为模型对照组、黄连解毒汤
70％醇提物100、50mg／kg组。每组14只，模型对
照组ig给予凉开水0．2mL／10g，黄连解毒汤70％
醇提物组分别ig给予黄连解毒汤混悬液100、50
mg／kg，连续10d，于末次给药24h后，无菌抽出腹
水，入肝素抗凝试管中，1500r／min离心5min，去
除上清液，由pH7．4PBS液漂洗，离心洗脱3次，以
70％乙醇1．0mL固定，4℃保存备测。
2．2 MDR表达产物P。，。、TOPO11、LRP表达的检
测：取70％乙醇固定的小鼠S。。。细胞，由pH7．4
PBS液稀释后，1500r／min离心5min，再次洗脱1
次，并调整细胞浓度为1×106／mL，摇匀，取细胞悬
液500弘L，加入各自相对应的FITC标记的鼠抗人
的单克隆抗体IgG，工作液20弘L，另各取一支阴性
对照抗IgG。一FITC，37℃避光反应30min后，由流
式细胞仪荧光检测。仪器的检测变异系数<2％，测
定1×104个细胞的P，，。、TOPOⅡ、LRP3种相关生
物分子的表达，激发光波长均为488nm。黄连解毒
汤70％醇提物对MDR表达产物P，，。、TOPOⅡ、
LRP过度表达的抑制率按公式计算。
抑制率一(模型组表达率一给药组表达率)／模型组表达
率×100％
3结果
3．1黄连解毒汤70％醇提物对S。。。小鼠MDR模
型MDR表达产物P，，。过度表达的影响：诱导4周
和再传代10d后模型对照组小鼠S。。。肿瘤细胞肿
瘤MDR相关基因P。，。表达无显著性差异，提示诱
导后的耐药小鼠S。。。细胞的基因表达较为稳定。黄
连解毒汤70％醇提物明显逆转对耐药小鼠S㈣细
胞耐药基因P。，。过度表达。见表1。
表1 黄连解毒汤70％醇提物对MDR模型小鼠S。船细胞PiToTOPOⅡ、LRP表达的影响(i士s)
Table1 Effectof70％ethanolicextra tofHuanglianJ eduDecoctiononexpressionofPⅢ，
TOPOa，andLRPinMDRmiceSl∞cell(i士s)
与模型对照组比较：⋯P<0．001
⋯P<0．001口smodelcontrolgroup
万方数据
·1052· 中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第7期2007年7月
3．2黄连解毒汤70％醇提物对S，。。小鼠MDR模
型MDR表达产物LRP过度表达的影响：经化疗诱
导4周后传代10d的小鼠耐药S，。。肿瘤细胞LRP
表达率与诱导4周比较无明显变化，而给予黄连解
毒汤70％醇提物明显逆转了耐药S。。。肿瘤细胞
LRP的过度表达，与模型对照组比较差异极显著
(P<0．001)，见表1。
3．3黄连解毒汤70％醇提物对S。。。小鼠MDR模
型MDR表达产物TOPOⅡ表达的影响：黄连解毒
汤70％醇提物显著逆转由化疗诱导后的获得性耐
药小鼠S，。。细胞TOPOⅡ的过度表达，而诱导后传
代10d的模型对照组与诱导后4周时其表达率无
明显差异，提示黄连解毒汤70％醇提物可能通过
逆转TOPOⅡ的过度表达，干预化疗引起的MDR，
见表1。
4讨论
肿瘤化疗获得性MDR的发生，可见到肿瘤细
胞MDR基因、耐药蛋白过度表达，肿瘤细胞TOPO
Ⅱ等相关酶活性增加等表现。耐药基因和耐药蛋白
的过度表达时，可将化疗药物经跨膜转运排出细胞
并阻止药物进入细胞核，使化疗药物不能发挥细胞
毒性作用[4~63；TOPOⅡ活性增强，增强DNA修复
能力，拮抗化疗药物的细胞毒性[6]，还原性谷胱苷肽
酶活性增加，与化疗药物结合，阻止化疗药物作用于
肿瘤细胞，而产生耐药性。中药生物碱具有干预和逆
转肿瘤MDR的作用[7]。
本研究应用模拟临床肿瘤患者临床化疗诱导小
鼠S。。。细胞表达产生耐药性，观察了黄连解毒汤
70％醇提物体内给药对肿瘤细胞耐药相关生物活
性物质P。，。、LRP、TOPOⅡ表达的影响，结果显示
黄连解毒汤70％醇提物可以明显逆转小鼠S。。。细
胞耐药基因MDR的表达产物P。，。、肺耐药蛋白
LRP过度表达，抑制细胞拓扑异构酶Ⅱ(TOPOⅡ)
的活性。提示黄连解毒汤70％醇提物可以抑制肿
瘤细胞MDR的产生，其干预机制可能是通过对耐
药基因和耐药蛋白表达的调控，相关酶活性的影响
而实现的。
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(1．苏州大学药学院，江苏苏州 215123；2．苏州中药研究所，江苏苏州215123；
3．苏州大学细胞和分子生物学教研室，江苏苏州 215123)
沙苑子为豆科植物扁茎黄芪Astragalus
complanatusR．Br．exBunge干燥成熟的种子，具
有温补肝肾、固精、缩尿、益肝明目的功能。药理研究
表明沙苑子提取物具有改善血液流变学指标、降低
血压、调节血脂、抑制血小板聚集、保护肝脏、增强免
疫功能、抗炎、镇痛及调节中枢神经系统等作用‘¨。近
年来，本课题组对沙苑子的有效成分和药理活性进行
了深入研究，实验证明沙苑子黄酮具有较好的保肝、
收稿日期：2006—12—10
基金项目：江苏省高校自然科学基础研究项目(06KJB360105)；苏州市社会发展科技项目(SS0515)
作者简介：刘春宇，女，硕士生导师，教授，研究方向为中药有效成分及药理作用研究。
Tel：(0512)55221518E—mail：chunyuliu998@msn．eom
*通讯作者杨吉成Tel：(0512)65880107E—mail：yangjicheng@suda．edu．an
万方数据
黄连解毒汤70%醇提物对小鼠S180细胞MDR相关因子表达的逆
转作用
作者： 李贵海， 孙付军， 董学， 李晓晶， 杨书斌， LI Gui-hai， SUN Fu-jun， DONG Xue，
LI Xiao-jing， YANG Shu-bin
作者单位： 山东省中医药研究院,山东,济南,250014
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2007,38(7)
被引用次数： 5次

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