全 文 :四物汤对人骨髓基质细胞蛋白质表达的作用
郭 平t ou o王升启t 3
kt1 军事医学科学院 放射医学研究所 o北京 tss{xs ~
u1 山东中医药大学 生化教研室 o山东 济南 uxsstwl
≈摘要 目的 }考察四物汤对骨髓基质细胞 ƒ≤增殖及蛋白质表达的影响 o探讨四物汤补血作用的分子机
制 ∀方法 }分别用 ××法 !流式细胞术和蛋白质组学方法测定四物汤对 ƒ≤增殖 !细胞周期及蛋白质表达的影
响 ∀结果 }四物汤能促进 ƒ≤的增殖 o提高其增殖指数 o并使 ƒ≤的 tu种蛋白质表达上调 ox种下调 ∀结论 }四
物汤能促进 ƒ≤增殖 o作用于多个蛋白质靶点 o间接发挥补血作用 ∀
≈关键词 四物汤 ~骨髓基质细胞 ~细胞增殖 ~蛋白质组学
≈中图分类号 u{x1x ≈文献标识码 ≈文章编号 tsst2xvsukussyltv2ts{v2sw
≈收稿日期 ussx2tt2sz
≈基金项目 国家自然科学基金资助项目kvsuztytzl ~全军医
药卫生科研基金 kstst|l ~北京市 / uw{0 重大创新工程项目
kstsutsuusttvl
≈通讯作者 3 王升启 oר¯ }kstslyy|vuutt o ∞2°¤¬¯}≥ º´¤±ª
±¬¦q¥°¬q¤¦q¦±
骨髓基质细胞在骨髓造血细胞的增殖 !分化 !迁
移和定居中发挥重要作用 ∀已有研究证实四物汤能
直接作用于骨髓造血细胞而发挥补血作用≈t ou o但
有关四物汤对骨髓基质细胞作用的研究较少 ∀本实
验利用流式细胞术 !蛋白质组学等技术 o研究了四物
汤对培养的人骨髓成纤维样基质细胞系k±²µ°¤¯ «∏2
°¤± ¥²±¨ °¤µµ²º ©¬¥µ²¥¯¤¶·²¬§¶·µ²°¤¯ ¦¨¯¯ ¬¯±¨ o ƒ≤l
细胞增殖和蛋白质表达的影响 o旨在为阐明四物汤
对骨髓基质细胞的作用及其补血的分子机制提供依
据 ∀
1 材料
111 药物 四物汤的 w味药熟地黄 !当归 !白芍和
川芎均购自北京同仁堂中药厂 o由军事医学科学院
二所九室马白平教授鉴定 o按5太平惠民和剂局方6
规定的剂量比ktxΒtsΒtsΒyl称取 ∀按人用药剂量计
算小鼠用药剂量为 ts ª#®ªpt#§pt ∀经水煎 !过滤 !
浓缩 !配制成 tss h 药液k即每 t °药液含生药 t
ªl o用不含血清的⁄ 培养液稀释为 x °ª#°pt的
溶液 o过滤除菌备用 ∀
112 细胞系 ƒ≤来源于正常胎儿骨髓基质细
胞 o由中国医学科学院血液学研究所姜学英教授建
系 o军事医学科学院二所九室保存 ∀培养于含 ts h
胎牛血清的 ⁄ 培养液 o实验均使用处于对数生
长期的细胞 ∀
113 试剂及仪器 ××k≥¬ª°¤公司l o⁄ 培养
液 !胎牛血清k¬¥¦²
公司l o胰酶k²¦«¨ 公司l o
丙烯酰胺 !Ν , Νχ2甲叉双丙烯酰胺 !×µ¬¶2¥¤¶¨ !过硫酸
铵 !四甲基乙二胺 !十二烷基磺酸钠 k≥⁄≥l !尿素 !
丙基磺酸盐 !°«¤µ°¤¯¼·¨v ∗ ts !固定 ³ 梯度干胶条
k¬°°²¥¬¯¬½¨ §³ ªµ¤§¬¨±·ª¨¯o°l !甘油 !琼脂糖 !溴
酚蓝等k°¨ µ¶«¤°
¬²¶¦¬¨±¦¨¶公司l o甘氨酸 !考马斯
亮蓝 2uxs和 2uxs !二硫苏糖醇 k⁄××lk°µ¨¶¦²公
司l o三氟乙酸 !碘乙酰胺k¦µ²¶µª¤±¬¦¶公司l o乙腈
kƒ¬¶«¨µ公司l o碘化丙啶k°«¤µ°¬±ª¨±公司l o其他试
剂均为国产分析纯 ∀
¤³¦²2xwts ≤u培养箱 k µ¨¤¨ ∏¶公司l ~• ¤¯ ¤¯¦
twus酶标仪k美国l品 ∀蛋白质双向电泳及电泳图
谱图像处理采用 °¨ µ¶«¤°
¬²¶¦¬¨±¦¨¶公司蛋白质组
学研究配套仪器 }∞·¤±×°³«²µ等电聚焦仪 o∞·¤±×
⁄׶¬¬二向垂直电泳仪 o∏¯·¬× °¨³ ¶ 温控循环水
浴 o°µ²¦¨¶¶²µ °¯∏¶
¤¶¨ ±¬·全自动染色仪 o°¤ª¨
≥¦¤±±¨ µ扫描仪 o°¤ª¨ ¤¶·¨µu⁄√ w1st¦软件 ∀
2 方法
211 ×× 法测定不同含量四物汤对 ƒ≤增殖的
影响 ƒ≤传代培养 ∀将处于对数生长期的 ƒ≤
细胞接种于 |y孔培养板 o经 vz ε ox h ≤u培养箱
孵育 uw «o观察细胞生长状态良好 o换无血清培养
液 o继续孵育 w{ «∀换 v h低血清培养液 ∀四物汤
#v{st#
第 vt卷第 tv期
ussy年 z月
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Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
∂²¯1vt o¶¶∏¨ tv
∏¯¼ oussy
分为 ts个给药组 o分别为 s1ssz { os1stx y os1svt v o
s1syu x os1tux os1ux os1x ot ou ow °ª#°pt o每组设 {
个复孔 o同时设细胞对照组和空白对照组各 {个复
孔 ∀于 vz ε ox h ≤u o饱和湿度条件下培养 w{ «
后 o每孔加入 ××液 o继续避光培养 w «o弃上清 o加
入二甲基亚砜 o振荡 ts °¬±o在酶联免疫检测仪上于
w|s ±°波长测定各孔吸光度kΑl o计算细胞增殖率 ∀
212 流式细胞术测定四物汤对 ƒ≤细胞周期的
影响 将处于对数生长期的 ƒ≤悬液接种于 ux
¦°u培养瓶 o每瓶接种培养液 { °o含 w ≅ tsx细胞 ∀
经 ≤u培养箱孵育 uw «o换无血清培养液 o继续孵育
w{ «∀换 v h低血清培养液 ∀细胞分为对照组和四
物汤组 o每组 w瓶细胞 o细胞给药后继续避光培养
tu «∀消化细胞 o离心kt sss µ#°¬±pt ox °¬±l o吸弃
上清 o°
≥ 洗涤细胞 ∀加入 vss Λ含 x h 血清的
°
≥ o再加入 zss Λ无水乙醇 o充分摇匀 op us ε 固
定细胞 w{ «以上 ∀将固定细胞离心 o°
≥洗涤 ∀加
入 tss Λt ª#pt的 ¤¶¨ ovz ε 水浴放置 vs °¬±
以消化 o加入 xss Λys °ª#pt的碘化丙啶 o避
光反应 vs °¬±o用流式细胞仪进行荧光检测 o检测各
细胞周期 ⁄含量 ∀
213 用蛋白质组学技术确定差异蛋白质 细胞培
养及给药 }ƒ≤传代培养 ∀将处于对数生长期的
ƒ≤接种于 xs ¦°u培养瓶 o≤u培养箱孵育 o待贴壁
{s h后 o换无血清培养液 o继续孵育 w{ «∀换 v h低
血清培养液继续孵育 o细胞分为对照组和四物汤组 ∀
细胞给药后 vz ε ox h ≤u培养箱继续孵育 uw «∀
蛋白质提取 }收集细胞于离心管 o°
≥ 洗涤 v
次 o转入 ∞°管 ∀w sss µ#°¬±p t ow ε o离心 u °¬±o弃
上清 ∀加入细胞裂解液 o液氮冻融 v次 o加入 ¤¶¨
o冰浴放置 us °¬±o离心 o取上清 ∀用
µ¤§©²µ§法测
定蛋白质含量 ∀
双向电泳 }电泳重复 v次 ∀° v ∗ ts ouw ¦°o采
用胶内泡涨法 ∀将含有 u °ª蛋白质的两组骨髓提
取液分别与 °胶条溶涨液混合 o进行一向等电聚
焦电泳 ∀电泳参数 }vs ∂ 再水化 otu «~uss ∂ ot «~
xss ∂ ot «~t sss ∂ ot «~{ sss ∂ otv «∀°胶条分别
在含有 ⁄××和碘乙酰胺的平衡液中平衡 tx °¬±∀将
°胶条置于预制的 tu1x h ≥⁄≥2聚丙烯酰胺凝胶
k简称凝胶l上 o进行第二向 ≥⁄≥2聚丙烯酰胺凝胶电
泳k≥⁄≥2°∞l ∀电泳参数 }{s ° ows °¬±~tss °
至溴酚蓝迁移至 ≥⁄≥2°∞凝胶底部边缘 ∀
凝胶染色与脱色 }考马斯亮蓝染色液染色 y «o
考马斯亮蓝脱色液脱色 tu «∀
凝胶扫描分析及统计处理 }扫描凝胶 o分析电泳
图谱 ∀差异蛋白质点标准化量以 cξ ? σ表示 o统计
分析采用 τ检验 ∀
肽质量指纹谱测定 }切下凝胶差异蛋白质点 o脱
色 o胶内酶切 o检测肽质量指纹谱 ∀
数据库检索鉴定蛋白质 }输入拟查询的物种 !肽
质量指纹谱数据及其他参数 o在数据库查寻与其相
匹配的蛋白质 ∀检索数据库为 «·³}rrººº q°¤·µ¬¬2
¶¦¬¨±¦¨ q¦²°∀
3 结果
311 四物汤对 ƒ≤增殖的影响 s1ss{ ∗ t °ª#
°pt的四物汤对 ƒ≤的增殖均有显著的促进作
用 o其中 s1svt °ª#°pt时作用最强k表 tl ∀
表 t 不同含量四物汤对 ƒ≤增殖率的影响 kcξ ? σ, ν {l
四物汤r°ª#°pt Α 增殖率r h
细胞对照 s qyvv ? s qst{ p
空白对照 s qt{{ ? s qsts p
s qss{ s qzw{ ? s qts|tl ux q{
s qsty s qzyx ? s qsx|ul u| qy
s qsvt s q{yw ? s qszvul xt qz
s qsyv s q{tu ? s qs|sul ws qt
s qtux s qzyx ? s qs{wtl u| qy
s qux s qzxt ? s qsx{tl uy qv
s qx s qzzv ? s qsxtul vt qv
t s qzww ? s qsyutl uw q{
u s qzu| ? s qtsv p
w s qywv ? s qswz p
注 }与对照组比tl Π s qsx oul Π s qstk表 u ov同l
312 四物汤对 ƒ≤细胞周期的影响 用流式细
胞仪检测四物汤对 ƒ≤细胞周期的影响 o并计算
细胞增殖指数k³µ²¯¬©¨µ¤·¬√¨ ¬±§¨¬o°l ∀与对照组相
比 o四物汤组 s2t期细胞显著降低k Π s1sxl o增
殖指数显著升高k Π s1sxlk表 ul ∀
313 四物汤对 ƒ≤蛋白质表达的影响 四物汤
使 ƒ≤tz 种蛋白质的表达发生显著改变 o其中
t ∗ y号 !{号 !ts号 !tu号 !tx ∗ tz号蛋白质表达显
著升高k Π s1sx或 Π s1stl ~z号 !|号 !tt号 !tv
号和 tw号蛋白质表达显著降低k Π s1sx或 Π
s1stlk表 v o图 tl ∀
经质谱鉴定 ot ∗ w号 !y ∗ tw号 !ty号及 tz号
蛋白质分别是整合素连接激酶kl o≤ 2o碱性
成纤维细胞生长因子 k¥ƒƒ l o层黏连蛋白 o
§{vt⁄tz1t1u o
¤¬o异柠檬酸脱氢酶 vk⁄vl o腺
#w{st#
第 vt卷第 tv期
ussy年 z月
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Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
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苷酸激酶 ukul o未知蛋白质 o亲环素 o磷酸丙
糖异构酶 o线粒体外膜电压依赖阴离子通道 t
k∂⁄≤tl o人 ≤≤ 趋化因子 o核蛋白体蛋白质 °u及
×°合酶 ∀
表 u 四物汤对 ƒ≤细胞周期的影响 kcξ ? σ, ν wl h
组别 s2t u2 ≥ °
对照 ws q{s{ ? w q|tw tv qss{ ? y qtzy wy qt{v ? t qwuz x| qt|u ? w q|tv
四物汤 vv qzwx ? u qytztl tx q|wv ? w q|xz xs qvtv ? x qxyw yy quxx ? u qytxtl
表 v 四物汤所致 ƒ≤差异表达蛋白质
蛋白质
序号
标准化量kcξ ? σlr h
对照组 四物汤组 注册号 分值 等电点
相对分
子质量
肽段
匹配
序列覆
盖率r h 蛋白质名称
t s qu{u ? s qsuz s qwuz ? s qszttl ª¬¿zwu{svt xu { qvs xt u{| {rws uu 整合素连接激酶
u s qsu{ ? s qssx s qsws ? s qssytl ª¬¿vwx{sy zt x qvv uu |yx zrvu vs ≤ 2
v s qtss ? s qsuv s qtyx ? s qsvvtl ª¬¿wuytxxv xw { q{z ts u{v xrvs vu 碱性成纤维细胞生长因子
w s qtuv ? s qstz s qtzw ? s qstttl ª¬¿wv{sxy w{ y qss vwu xxs tzrvt { 层黏连蛋白
x s qszv ? s qstv s qt|w ? s qss{ul p p p p p p p
y s qs{t ? s qstu s qtzw ? s qsuvtl ª¬¿uwwtu{u{ y| { qy| ww tu{ ttruu vt §{vt⁄tz qt qu
z s qtsv ? s qssy s qsyv ? s qstttl ª¬¿usyvt|yz xw { qv| t{ ttz wrts u|
¤¬
{ s qsuv ? s qssw s qsy{ ? s qsuttl ª¬¿xsvtzzz zt y qwz v| xyy {ruu uw 异柠檬酸脱氢酶
| s qszx ? s qss| s qsuy ? s qstvtl ª¬¿uyyyx{|t xv { q|w uu uxt zru{ xs 腺苷酸激酶 u
ts s qtwu ? s qswy s quzy ? s qstttl ª¬¿tu{swuux zy x qwx x| wvt t{ryu wu 未知蛋白质
tt s qtz{ ? s qsuz s qszz ? s qstwtl ª¬¿yyz|wv| |x z qzw tz |ys ttrvt xs 亲环素
tu s qtwz ? s qssv s qvsy ? s qswztl ª¬¿tvysyy tuu z qts uy ys| turvu xx 磷酸丙糖异构酶
tv s qut{ ? s qsvx s qswu ? s qstxtl ª¬¿wxsz{z| zu { qyu vs zxw |rwx wz 线粒体外膜电压依赖阴离子通
tw s qsxy ? s qssu s qsvv ? s qssuul ª¬¿tstusyst ys | q|t { xzt xruw zs 道 t人 ≤≤趋化因子
tx s qsy{ ? s qsts s qtw{ ? s qsustl p p p p p p p
ty s qtxu ? s qsw| s qvv{ ? s qsuutl ª¬¿wxsyyzt zx w qwu tt yx{ xrt{ ys 核蛋白体蛋白质 °u
tz s qtvz ? s qssy s qvuv ? s qsxztl ª¬¿wzxz{ts {y | qty x| ztw turvw u{ ×°合酶
图 t ƒ≤蛋白质双向电泳图谱
q对照组 ~
q四物汤组 ~左侧横向箭头表示第一向等电聚焦电
泳的方向 o°胶条的 ³梯度由左向右为 v ∗ ts ~左侧纵向箭头
表示第二向 ≥⁄≥2聚丙稀酰胺凝胶电泳的方向 o分子质量由上向
下逐渐减小 ~图中数字是差异蛋白质的编号
4 讨论
本研究结果表明 o四物汤促进 ƒ≤增殖 o促进
ƒ≤由 s2t期进入 ≥期 ~显著提高 ƒ≤增殖指
数 o调节多种蛋白质的表达 ∀
是一种能将整合素和生长因子受体与其下
游分子偶联起来的细胞内受动器≈v ∀在调节细胞生
长 !分化和迁移中发挥作用 ∀人类 ≤ 是鸡 √2¦µ®
癌基因产物的同源物 o是一种适配器蛋白 ∀ ≤ 参
与细胞信号转导 o与细胞的增殖 !分化有关≈w ∀本研
究显示 o四物汤显著升高和 ≤ 2t的表达 o提示
四物汤能调节 ƒ≤的信号转导 o促进骨髓基质细
胞的生存 o间接发挥促进骨髓造血细胞增殖 !分化的
作用 ∀
层黏连蛋白是整合素的配体之一 o通过与细胞
间的相互作用可直接或间接控制细胞的活动 o如黏
附 !分化 o增殖或凋亡以及基因表达等 ∀本研究显
示 o四物汤能使 ƒ≤的层黏连蛋白表达升高 o提示
四物汤能促进骨髓基质细胞合成及分泌细胞外基
质 o通过整合素等信号分子 o直接或间接调节造血细
胞的活动 ∀
骨髓细胞外基质的 ¥ƒƒ主要来源于骨髓成纤
维细胞 o在造血调控中起重要作用≈x ∀¥ƒƒ能刺激
基质细胞增殖 o改善造血微环境而间接刺激骨髓造
血 o还直接作用于各期造血细胞 o与其他细胞因子协
同作用 o促进早期造血祖细胞增殖 o诱导定向祖细胞
形成 2≤ƒ≥和
ƒ2∞∀此外 o¥ƒƒ还拮抗造血负
调控因子 ׃2Β对髓系祖细胞的抑制作用≈y ∀四物
汤能上调 ¥ƒƒ在 ƒ≤的表达 ∀
单核细胞趋化蛋白 t ∗ x !巨噬细胞炎性蛋白
tΑ∗ tΧ和 °vΑo°vΒ等均属于 ≤≤ 趋化因子 ∀多
#x{st#
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种趋化因子与造血调控有关 o如抑制造血干r祖细胞
增殖 o使造血干细胞停留在 s期 ~动员骨髓造血干
细胞进入外周血等 ∀本研究显示 o四物汤使 ƒ≤
的 ≤≤趋化因子表达显著减少 o减弱了这种造血负
调控作用 ∀
¤¬表达相对增多时
¤¬r
¤¬二聚体增加 o促进
细胞凋亡发生 ∀ ∂⁄≤ 是一种线粒体微孔形成蛋
白 o参与了细胞凋亡过程 o被认为形成了转运腺苷使
之通过线粒体外膜的主要通道 ∀细胞凋亡时 o
¦¯ u
家族蛋白质结合于 ∂⁄≤以调节线粒体膜电位和细
胞色素 ≤的释放 ∀ u位于线粒体内膜 o可能在细
胞凋亡中发挥作用 ∀已知在细胞凋亡时 o不但 u种
线粒体蛋白质 ) ) ) 细胞色素 ≤ 和凋亡诱导因子由
线粒体释放到胞液 ou与细胞色素 ≤ 也一起由线
粒体进入胞液≈z o但 u在细胞凋亡中的作用尚未
完全阐明 ∀本研究显示 o四物汤使
¤¬o∂⁄≤t 和
u在 ƒ≤表达显著减少 o从而可抵抗 ƒ≤的凋
亡 o间接发挥促进造血的作用 ∀
⁄v位于线粒体 o催化异柠檬酸氧化脱羧生成
Α2酮戊二酸 o是三羧酸循环的关键酶之一 ∀线粒体
×°合酶是在细胞氧化磷酸化过程中 o利用横跨线
粒体内膜的质子电化学梯度来催化 ×°合成的酶 ∀
本研究显示 o四物汤能显著上调 ⁄v和 ×°合酶
在 ƒ≤的表达 o因而四物汤可促进 ƒ≤能源物质
的氧化分解 o改善骨髓基质细胞的能量代谢 ∀
可见 o四物汤除了直接作用于骨髓造血细胞外 o
还能促进骨髓基质细胞的增殖 o作用于多个蛋白质
靶点 o从多个层次发挥直接和间接的补血作用 ∀
≈参考文献
≈t 郭 平 o马增春 o梁乾德 o等 q四物汤对放射线致血虚证小鼠
骨髓蛋白质表达的影响 q中国中药杂志 oussw ou|k|l }{|v q
≈u 郭 平 o梁乾德 o胡剑江 o等 q四物汤对放射线致血虚证小鼠
骨髓 ∞° 和 2≤≥ƒ基因表达的影响 q中国中药杂志 oussx ovs
ktxl }ttzv q
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Εφφεχτσ οφ Σιωυ Τανγ ον προτειν εξπρεσσιον οφ ΗΦΧΛ
°¬±ªtou o • ≥«¨ ±ª2 ¬´t
(t . Ινστιτυτε οφ Ραδιατιον Μεδιχινε , Αχαδεµψ οφ Μιλιταρψ Μεδιχαλ Σχιενχεσ, Βειϕινγ tss{xs , Χηινα ;
u . Σηανδονγ Υνιϖερσιτψ οφ Χηινεσε Μεδιχινε , ϑιναν uxsstw , Χηινα)
[ Αβστραχτ] Οβϕεχτιϖε : ײ¬±√ ¶¨·¬ª¤·¨·«¨ ©¨©¨¦·¶²© ≥¬º∏פ±ª²± ƒ≤³µ²¯¬©¨µ¤·¬²± ¤±§³µ²·¨¬± ¬¨³µ¨¶¶¬²± ²©¥²±¨ °¤µµ²º ¶·µ²°¤¯
¦¨¯¯¶¤±§·²§¬¶¦∏¶¶°²¯ ¦¨∏¯¤µ° ¦¨«¤±¬¶° ²© ±¨µ¬¦«¬±ª¥¯²²§©∏±¦·¬²±¶²©≥¬º∏פ±ªq Μετηοδ : ×× o©¯²º ¦¼·²° ·¨µ¼ ¤±§³µ²·¨²°¬¦¶º µ¨¨ ∏¶¨§
µ¨¶³¨¦·¬√¨¯¼·² ° ¤¨¶∏µ¨ ·«¨ ©¨©¨¦·²©≥¬º∏פ±ª²± ƒ≤³µ²¯¬©¨µ¤·¬²±o¦¨¯¯ ¦¼¦¯¨¤±§³µ²·¨¬± ¬¨³µ¨¶¶¬²±qΡεσυλτ : ≥¬º∏פ±ª¦¤± ³µ²°²·¨ ƒ2
≤³µ²¯¬©¨µ¤·¬²±o¬±¦µ¨¤¶¨ ³µ²¯¬©¨µ¤·¬√¨¬±§¨¬o∏³2µ¨ª∏¯¤·¨ tu ®¬±§¶²©³µ²·¨¬±¶¤±§§²º±2µ¨ª∏¯¤·¨ x ®¬±§¶²©³µ²·¨¬±¶²© ƒ≤q Χονχλυσιον :
׫µ²∏ª«³µ²°²·¬±ª ƒ≤³µ²¯¬©¨µ¤·¬²± ¤±§¤¦·¬±ª²± °∏¯·¬³¯¨³µ²·¨¬±·¤µª¨·¶o·«¨ ¥¯²²§ ±¨µ¬¦«¬±ª©∏±¦·¬²± ²©≥¬º∏פ±ªº¤¶ ¬¨¨µ·¨§¬±§¬µ¨¦·¯¼q
[ Κεψ ωορδσ] ≥¬º∏פ±ª~¥²±¨ °¤µµ²º ¶·µ²°¤¯ ¦¨¯¯¶~¦¨¯¯ ³µ²¯¬©¨µ¤·¬²±~³µ²·¨²°¬¦¶
≈责任编辑 刘
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第 vt卷第 tv期
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