全 文 ：四物汤对辐射致血虚证小鼠血清蛋白质表达的影响
马增春 o高 月 o谭洪玲 o王升启
k军事医学科学院 放射医学研究所 o北京 tss{xsl
≈摘要  目的 }用蛋白质组技术考察四物汤对血虚证小鼠血清蛋白的影响 o在分子水平上探讨四物汤补血的
作用机理 ∀方法 }ys≤²Χ射线全身照射小鼠造成血虚证模型 ~二向电泳 !图象分析 !质谱鉴定等蛋白质组学技术测定
四物汤对血虚证小鼠血清中有影响的蛋白 ∀结果 }四物汤可使血虚证小鼠血清中 tu 个下调和 w 个上调的蛋白质
有所恢复 o进一步质谱鉴定其中 w 个蛋白质可能是 ⁄‘„ 依赖蛋白激酶k⁄‘„2§¨ ³¨ ±§¨ ±·³µ²·¨¬± ®¬±¤¶¨ ¦¤·¤¯¼·¬¦¶∏¥2
∏±¬·o°|zvtvl o肌细胞增强蛋白k§¼¶·µ²³«¬±o °ttxvtl o马达蛋白k ŽŒƒtv„ o ±|∞± • zl o肌动蛋白结合蛋白k§¼¶2
·²±¬± o ±|± ÷usl ∀它们的功能是参与 ⁄‘„ 双链损伤的修复 o与 „°2t 结合将 y2磷酸甘露糖受体从高尔基体转运到
胞浆膜上 o将细胞骨架铆定在胞浆膜上等 ∀结论 }四物汤可能通过对血虚证小鼠血清中蛋白的影响而促进骨髓造
血 !减轻辐射引起的损伤 ∀
≈关键词  四物汤 ~辐射 ~血清 ~蛋白质组
≈中图分类号  • u{x qx ≈文献标识码  „ ≈文章编号  tsst2xvsukussvltt2tsxs2sw
ys≤²Χ射线照射制成的小鼠血虚证 o其发生发展
的分子机制为 }骨髓细胞在损伤早期凋亡 o细胞周期
紊乱 o结果造成骨髓中干祖细胞的数量减少 o进而引
起外周血象下降≈t  ∀补血复方四物汤提前给药可预
防射线诱发的骨髓细胞凋亡 o四物汤治疗给药可促
进骨髓细胞增殖 o增加骨髓中造血干祖细胞数量 o增
加外周血中的白细胞 !红细胞和血小板等≈u  ∀
蛋白质组是指由一个基因组 !一种生物或一种
细胞r组织表达的所有蛋白质≈v  ∀蛋白质组研究的
技术路线主要是高通量双向电泳进行蛋白质的分
离 o再用专业计算机软件进行图象分析 o然后通过质
谱技术及蛋白质数据库信息对凝胶上的蛋白质进行
分析和鉴定 ∀蛋白质组在药物作用靶标 !安全性评
价 !耐药性机制 !疾病动物模型研制和中医药现代化
等方面有新颖而重要的应用 o中药作用的整体观与
蛋白质组学的思路有相似之处 o中药具有多组分 !多
靶点和多途径的作用特点 o分析用药前后的蛋白表
达差异 o可在分子水平上探讨其作用机制 ∀本实验
观察了四物汤对射线诱发血虚证小鼠血清蛋白改变
的影响 o旨在探讨该药治疗血虚证的分子作用机理 ∀
≈收稿日期  ussu2tu2t{
≈基金项目  国家自然科学基金资助项目kvsszt|tvl ~北京市
科技项目k‹stsutsuusttvl
≈通讯作者  王升启 ר¯ } kstsl yy|vuutt ƒ¤¬} kstsl
yy|vuutt ∞2°¤¬¯}≥´º¤±ªƒ ±¬¦q¥°¬q¤¦q¦±
1 材料
1 q1 动物 ≤xz…ry小鼠 vs 只 oy ∗ {周龄 o体重
kus ? ul ªo雌性 ~由军事医学科学院实验动物中心
提供 o常规饲养 ∀
1 q2 主要试剂与仪器 尿素k∏µ¨¤l o≤ ‹ „°≥ o°«¤µ2
°¤¯¼·¨ v ∗ ts o ×µ¬¶2¥¤¶¨ oŒ°Š 缓冲液 !丙烯酰胺 o甲
叉双丙烯酰胺 o过硫酸胺 !四甲基乙二胺k×∞ ∞⁄l o
≥⁄≥ o甘油 o琼脂糖 !甘氨酸 !溴酚蓝等二向电泳试剂
均购自 „ ° µ¨¶«¤° ³«¤µ°¤¦¬¤公司 ∀
核酸酶k¥¬¥²±∏¦¯¨ ¤¶¨l购自 ≥¬ª°¤公司 o蛋白质
酶抑制剂 !胰酶购自 • ²¦«¨ 公司 ∀蛋白质定量标准
购自 °¬¨µ¦¨ 公司 ∀
考马斯亮蓝 •2uxs o考马斯亮蓝 Š2uxs 购自
„  • ∞≥≤ ’ 公司 ∀三氟乙酸k׃„l 购自 ƒ ∏¯®¤公
司 o乙腈k„≤‘l 购自 ƒ¬¶«¨µ公司 ∀其它试剂均为国
产分析纯 ∀
„ ° µ¨¶«¤° ³«¤µ°¤¦¬¤公司蛋白质学研究配套仪
器 }Œ°Š³«²µ等电聚焦仪 o∞··¤± ⁄„×¶¬¬二向垂直
电泳仪 o ∏¯·¬×¨°³ ¶ 温控循环水浴 o°µ²¦¨¶¶²µ°¯ ∏¶
…¤¶¨ ˜±¬·全自动染色仪 oŒ°¤ª¨ ≥¦¤±±¨ µ扫描仪 oŒ°2
¤ª¨ °¤¶·¨µu⁄ ∞¯¬·¨ 图象分析软件 oŒ°¤ª¨ °¤¶·¨µu⁄
⁄¤·¤¥¤¶¨ 数据库软件 ∀
质谱仪为 …µ∏®¨ µ公司 • ∞ƒ∞÷ ¶基质辅助激
光解吸r电离飞行时间质谱k  „⁄Œ2× ’ƒ2  ≥l ∀
核酸蛋白分析仪 ⁄˜yws 来自美国 …¨ ¦®° ±¨
#sxst#
第 u{卷第 tt期
ussv年 tt月
中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
∂ ²¯ qu{ oŒ¶¶∏¨ tt
‘²√¨°¥¨µoussv
¦²∏¯·¨µ∀
1 q3 四物汤的组成及制备 四物汤由熟地 • ¤§¬¬
• «¨°¤±±¬¤ Š¯ ∏·¬±²¶¤ ¬¥²¶¦«o当归 • ¤§¬¬ „±ª¨ ¬¯¦¤¨
≥¬±¨ ±¶¬¶o白芍 • ¤§¬¬ °¤¨ ²±¬¤¨ ¤¯¥¤o川芎 • «¬½²°¤
¬ª∏¶·¬¦¬≤«∏¤±¬¬²±ª组成 o全部药物购自北京同仁
堂中药厂 o由植物化学研究室马白平教授鉴定 ∀按
5太平惠民和剂局方6规定的剂量称取组成 o熟地 tx
ª!当归 ts ª!白芍 ts ª!川芎 y ªo共计 wt ª#§p t ∀按
5中药药理研究方法学6≈w 计算小鼠的等效剂量为
ts ª#®ªp t#§p t ∀经水煎 !过滤 !浓缩 !配制成 tss h
药液k即每毫升药液含生药 t ªl o制备完毕后置 w ε
保存备用 ∀
1 q4 模型制作 小鼠常规饲养数天适应环境后 o采
用ys≤²Χ射线全身 t次照射 o照射剂量为 v qx Š¼ o剂
量率为 t qvt Š¼#°¬±p t ∀
1 q5 实验动物分组 实验分正常组 !模型组 !药物
组kts ª#®ªp t#§p tl ∀每组 ts 只小鼠 o模型制作后
连续灌胃 z §o模型组和正常组则给予等体积的生
理盐水 ∀
2 方法
2 q1 样品制备 从小鼠股静脉取血 ow ε 放置 vs
°¬±后 o离心ktu sss µ#°¬±p t otx °¬±l o合并上清 ∀
2 q2 蛋白质含量测定 将蛋白质定量标准梯度稀
释后用考马斯亮蓝 Š2uxs染色 o测定 x|x ±°处的吸
收度 o做标准曲线 ∀血清稀释 ts 倍后测定含量 ∀
2 q3 一向等电聚焦 分别取正常 !模型 !药物组小
鼠血清 ty qzx ot| qzw oty qut ˏo含蛋白总量为 t
°ªo采用胶内泡涨方法 o样品和泡涨液k{ °²¯ #pt
尿素 !u h ≤ ‹ „°≥ ous °°²¯#pt ⁄× × os qx h Œ°Š
缓冲液 !痕量溴酚蓝l共 wxs ˏ ∀Œ°Š 胶条的保护
膜 o胶面向下 o先将 Œ°Š 胶条尖端朝标准型胶条槽
的尖端方向放入胶条槽中 o慢慢下压胶条 o并前后移
动 o避免生成气泡 o最后放下 Œ°Š 胶平端 o使溶胀液
浸湿整个胶条 o从 Œ°Š 胶条两侧加入 Œ°°²¥¬¯¬±¨
⁄µ¼≥·µ¬³覆盖油 o盖上盖子 ∀将胶条槽放置于等电
聚焦上 o注意电极接触良好 o设置等电聚焦参数 }vs
∂ otu «~xss ∂ ot «~t sss ∂ ot «~{ sss ∂ ots «∀
一向等电聚焦结束时参数为 }v{ Λ„ oz{ sss ∂ «µ≥ ∀
2 q4 Œ°Š胶条的平衡 Œ°Š胶条平衡 u次 o每次 tx
°¬±∀平衡缓冲液包括 y °²¯#pt尿素和 vs h甘油 o
会减少电内渗 o有利于蛋白质从第一向转移到第二
向的转移 ∀第 u次平衡步骤中加入 uys °°²¯ #pt
碘乙酰胺 o以除去多余的 ⁄× × ∀
2 q5 ≥⁄≥胶的配置 配置浓度为 tu qx h的丙烯酰
胺凝胶 ∀
2 q6 Œ°Š胶条的转移 平衡后的胶条用去离子水
润洗后 o将胶条的边缘置于滤纸上几分钟 o以除去多
余的平衡缓冲液 ∀将 Œ°Š胶条小心的放置于第二向
制好的 ≥⁄≥胶上 o并轻压使 Œ°Š胶条与 ≥⁄≥胶充分
结合 o注意胶面之间不能有气泡 o用 s qx h的琼脂糖
封顶 o进行二向电泳 o二向电泳参数为 }tus Λ„ ows
°¬±ot{s Λ„到溴酚蓝染料迁移到胶的底部边缘结
束电泳 ∀
2 q7 ≥⁄≥胶的染色 考马斯亮蓝染色液ks qt h考
马斯亮蓝 !xs h甲醇 !ts h冰醋酸 !ws h水l染色 y «o
考马斯亮蓝脱色液kux h乙醇 !{ h冰醋酸 !yz h水l
脱色 tu «∀
2 q8 凝胶扫描分析 用 Œ°¤ª¨ ≥¦¤±±¨ µ扫描仪扫描
凝胶 o用 Œ°¤ª¨ °¤¶·¨µu⁄ ∞¯¬·¨ w qst图象分析软件 o
Œ°¤ª¨ °¤¶·¨µu⁄ ⁄¤·¤¥¤¶¨ 数据库软件分析电泳结
果 ∀
2 q9 差异蛋白质从凝胶的酶切与提取 选取 u⁄胶
上存在明显差异点 o用刀片沿斑点染色边缘切下蛋
白点置于 t qx °∞³管中 o用含 xs h 乙腈和 ux
°°²¯#pt碳酸氢铵溶液脱色 o胶片真空离心干燥 ∀
加 w ˏ胰酶 ovz ε 保温 t{ «o加入 x h三氟乙酸 tus
ˏ于 ws ε 保温 t «o吸出上清 o加入 u qx h 三氟乙
酸和 xs h 乙腈溶液 tus ˏ于 vs ε 保温 t «o合并
上清液冷冻干燥 ∀
2 q10 制备肽质量指纹谱 用 x ˏ三氟乙酸溶解
样品 o取 t ˏ点靶 o另取 t ˏΑ2腈基2w2羟基肉桂酸
溶于 s qt h三氟乙酸2xs h乙腈的饱和溶液作基质 o
室温干燥 ∀质谱仪采用激光波长 vvz ±° o反射检
测 ∀
2 q11 数据库检索初步鉴定蛋白质 数据库检索程
序根据输入的蛋白质等电点 !分子量范围及肽质量
指纹谱数据和其他一些参数在数据库中寻找与这些
参数相匹配的蛋白质 ∀检索数据库为 }«··³}rr
ººº q¨ ¬³¤¶¼ q¦«r·²²¯¶r³¨ ³·¬§¨ ±·q«·°¯ o«··³}rrª¯²¥2
¤¯¶¨µ√ µ¨q³µ²·¨²°¬¦¶q¦²° q¦±∀
3 结果
3 q1 小鼠血清中蛋白浓度的测定 正常 !模型 !药
物组小鼠血清中蛋白质浓度分别为 x| qzu oxs qyw o
yt qy{ ª#pt ∀
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3 q2 小鼠血清二向电泳 图 t为小鼠血清二向电
泳图谱 o其中 ¤o¥o¦的一向等电聚焦 ³‹ 梯度为 v ∗
ts o§o¨ o©的一向等电聚焦 ³‹ 梯度为 w ∗ z o所有一
向等电聚焦胶条的长度为 uw ¦° ∀每个 ³‹ 梯度均
重复 v 次实验 o³‹ 梯度为 v ∗ ts 的参考胶检测到
xwv 个蛋白质点 o³‹ 梯度为 w ∗ z 的参考胶检测到
xsw个蛋白质点 ∀血清蛋白质多分布在 ³‹ 为 w ∗ z
内 o³‹ 大于 z 的蛋白质很少且产生横向拖尾 ∀
图 t 小鼠血清二向电泳图谱k ν € vl
¤o§q正常组 ¥o¨ q模型组 ¦q©q药物组
3 q3 凝胶图象分析 用 Œ°¤ª¨ °¤¶·¨µu ⁄ ∞¯¬·¨ w qst
图象分析软件 !Œ°¤ª¨ °¤¶·¨µu ⁄ ⁄¤·¤¥¤¶¨ 数据库软
件分析电泳结果 ∀差异点在模型组小鼠血清二向电
泳图谱中以数字标出 o相对模型组比值大于 u 或小
于 s qx 的蛋白质点 o其水平的变化可能有意义 o四物
汤可使血虚证小鼠血清中 tu 个下调和 w 个上调的
蛋白质恢复到一定水平 ∀实验中每个 ³‹ 梯度均重
复 v次实验 o表 t是其中 t次电泳的数据 o其它电泳
图谱也有相似的变化趋势 ∀
3 q4 差异蛋白质的鉴定 选取 t ox ots ott otu otv o
tw oty 号 { 个差异蛋白质点酶切后 o做肽质量指纹
谱 o然后进行数据库检索 ∀其中 x otv otw oty号可能
是 ⁄‘„ 依赖蛋白激酶k⁄‘„2§¨ ³¨ ±§¨ ±·³µ²·¨¬± ®¬2
±¤¶¨ ¦¤·¤¯¼·¬¦¶∏¥∏±¬·o °|zvtvl o肌细胞增强蛋白
k§¼¶·µ²³«¬±o °ttxvt l o 马 达 蛋 白 k ŽŒƒtv„ o
±|∞± • zl o肌动蛋白结合蛋白k °¬¦µ²·∏¥∏¯ 2¨¤¦·¬±
¦µ²¶¶¯¬±®¬±ª©¤¦·²µt o±|± ÷usl ∀它们的功能是参与
⁄‘„ 双链损伤的修复 o与 „°2t 结合将 y2磷酸甘露
糖受体从高尔基体转运到胞浆膜上 o将细胞骨架铆
定在胞浆膜上等 ∀血清中含有大量的白蛋白 o且血
清中蛋白质浓度分布在 tsp v ∗ tsp uw的宽范围内 o含
量丰富的白蛋白可能改变其他蛋白质的电泳行为 o
因超载而溢出跑到其他处 o使得二向电泳胶上离白
蛋白较远的蛋白质点也可能被白蛋白污染 ot ots o
tt otu号差异点可能混有白蛋白 o仅通过肽质指纹
图谱不能确证是哪种蛋白质 ∀
表 t 四物汤对血虚证小鼠血清蛋白的影响
蛋白点 等电点
分子量
r®⁄
正常组
r模型组
药物组
r模型组
t x qyu xt qwy u qtt{ t qxxz
u x q|v xs q{t u qz{y v qsxu
v x q{| wy qvx t quuu v qtx|
w x q{t wx qxu t q|ts u qutu
x y qsu wt q{| t qvw| x qttw
y w qzx v| qv{ s qyxt s qvv{
z w q{{ v{ qyv s qvz{ s qyst
{ x qst v{ qtt s qvtw s qu||
| x qty v{ qsx s qz|{ s qw{{
ts y qtt v{ q|z u qy{x t q{yu
tt x quv uz qzx t qy{x x qtw{
tu x qt{ uu qwv t qzxw v q|{{
tv x qtu tx qzw t q||w v q{|z
tw w q|{ tw qtv w qszv v qvut
tx w q{z tu qtz u qvws v qy|s
ty x qu{ { qsu t qx|u u qvzw
4 分析与讨论
四物汤出自5太平惠民和剂局方6 o在临床广为
应用 ∀实验研究表明 }四物汤能改善微循环 o抑制血
栓形成 o增强免疫 o对抗化学药物毒性 o抗辐射 ∀四
物汤可增加血虚大鼠或急性失血小鼠血液中的有形
成分≈x  ∀
研究者从整体 !细胞水平进行了大量研究 o使四
物汤作用机制的研究有了一定的研究基础≈y  ∀但由
于中药多组分 !多途径 !多靶点的作用特点 o同时缺
乏反映中医药特色的研究思路和技术支撑 o致使中
药研究长期徘徊 o难以取得突破 ∀以功能基因组和
蛋白质组学为核心的后基因组时代将为中医药学现
代化缔造新的绝好契机≈z  ∀本实验观察了四物汤对
射线诱发血虚证小鼠血清蛋白质改变的影响 o旨在
探讨该药治疗血虚证的分子作用机理 ∀
#uxst#
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研究结果表明四物汤可使血虚证小鼠血清中下
降的 ⁄‘„ 依赖蛋白激酶 o肌细胞增强蛋白k§¼¶2
·µ²³«¬±l o马达蛋白k ŽŒƒtv„l o肌动蛋白结合蛋白
k§¼¶·²±¬±l有所恢复 ∀ ⁄‘„ 依赖蛋白激酶是丝氨酸
r苏氨酸激酶 o功能是参与 ⁄‘„ 双链损伤的修复 o
• ‘„转录的拼接与调节 o⁄‘„ 依赖蛋白激酶必须
结合在 ⁄‘„ 上才能表达自身发挥作用的催化亚
基≈{  ∀ys≤²Χ射线照射可引起 ⁄‘„ 双链损伤 o四物
汤治疗给药可使 ⁄‘„ 依赖蛋白激酶水平升高而促
进 ⁄‘„损伤修复 ∀马达蛋白的功能是与 „°2t结合
将 y2磷酸甘露糖受体从高尔基体转运到胞浆膜上 o
马达蛋白的减少将使 y2磷酸甘露糖受体不能到达胞
浆膜上≈z  o四物汤治疗给药可使马达蛋白水平升高 ∀
肌细胞增强蛋白的功能是将细胞骨架铆定在胞浆膜
上≈{  o四物汤使血虚证小鼠血清中降低的肌细胞增
强蛋白水平升高 o一定程度上减轻了辐射损伤 ∀
肌动蛋白结合蛋白的改变将引起神经系统的紊
乱 o其主要表达在脑 !骨骼 !心肌等部位≈|  o四物汤使
血虚证小鼠血清中降低的肌动蛋白结合蛋白的水平
升高 o一定程度上减轻了辐射损伤 ∀四物汤可能通
过对血虚证小鼠血清中的蛋白影响而促进骨髓造
血 !减轻辐射引起的损伤 ∀
≈参考文献 
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鼠造血细胞作用的研究 q中国实验方剂学杂志 ousst ozkvl }
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·¨²°¨ • ¶¨¨¤µ¦«} ≤²°³¯¨° ±¨·¤µ¬·¼ ¤±§ ¬°¬·¤·¬²±¶ º¬·« • ¶¨³¨ ¦·
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≈z  ¬±·¤ ’ o • ²±ª  o Ž²½¤® ≤ „ o ·¨¤¯ q¦⁄‘„ ≤ ²¯±¬±ªo≥ 2¨
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·µ²³«²µ¨¶¬¶ku2⁄∞l o¦²°³∏·¨µ2¤¶¶¬¶·¨§¬°¤ª¨ ¤±¤¯¼¶¬¶o¤±§ °¤¶¶¶³¨¦·µ²° ·¨µ¼ º µ¨¨ ∏¶¨§·² §¨·¨¦·µ¨ª∏¯¤·¨§³µ²·¨¬± ¥¼ ≥¬2 • ∏2פ±ªq
Ρεσυλτ : tu ²¯º µ¨¤±§w «¬ª«¨µ³µ²·¨¬±¬± ¶¨µ¤¦²∏¯§¥¨ µ¨¦²√ µ¨¨§¥¼ ≥¬2 • ∏2פ±ªow ³µ²·¨¬± °¬ª«·¥¨ ⁄‘„2§¨ ³¨ ±§¨ ±·³µ²·¨¬± ®¬±¤¶¨
¦¤·¤¯¼·¬¦¶∏¥∏±¬·o⁄¼¶·µ²³«¬±oŽŒƒtv„ o§¼¶·²±¬±q× «¨ ¼ ³¯¤¼ ¤³¤µ·¬± ⁄‘„ §²∏¥¯ 2¨¶·µ¤±§¨ §¥µ¨¤®µ¨³¤¬µoµ¨¦²°¥¬±¤·¬²± ¤±§ °²§∏2
¤¯·¬²± ²©·µ¤±¶¦µ¬³·¬²±o·µ¤±¶³²µ·¤·¬²± ²© °¤±±²¶¨2y2³«²¶³«¤·¨ µ¨¦¨³·²µo ·¨¦qΧονχλυσιον : ≥¬2 • ∏2פ±ª¦¤± µ¨ª∏¯¤·¨ ¶¨µ∏° ³µ²·¨¬±¬±
¥¯²²§§¨©¬¦¬¨±·°¬¦¨ oµ¨¶∏¯·¬±ª¬±¬°³µ²√¬±ª «¨ °¤·²³²¬¨¶¬¶¤±§¯¨ ¶¶¨±¬±ª¬µµ¤§¬¤·¨§¬±­∏µ¼ q
[ Κεψ ωορδσ] ≥¬2 • ∏2פ±ª~¬µµ¤§¬¤·¬²±~¶¨µ¤~³µ²·¨²°¬¦¶
≈责任编辑 方文贤 
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