全 文 ：°• ‘„差异显示法比较独角莲作用肝癌细胞
≥ ≤2zzut前后的基因表达
王顺启 o倪 虹 o程 华 o王广良 o王同顺 o陈 力 3
k南开大学 生命科学学院 分子细胞遗传学研究室 o天津 vsssztl
≈摘要  目的 }研究独角莲根茎水提取物k„∞²×Š∞l作用肝癌细胞 ≥  ≤2zzut后引起的细胞基因表达变化 ∀方
法 }利用 °• ‘„差异显示技术 o以人肝癌细胞系 ≥ ≤2zzut细胞为研究对象 o筛选 „∞²×Š∞作用后表达改变的基因
片段 ∀结果 }经测序和鉴定 o发现 t个基因在加入 „∞²×Š∞后表达上升 ot个基因表达下降 ∀结论 }°• ‘„差异显示
可以用于中草药对细胞的作用机制研究 ∀
≈关键词  独角莲根茎水提取物 ~°• ‘„差异显示 ~肝癌细胞 ≥ ≤2zzut
≈中图分类号  • u{x1x ≈文献标识码  „ ≈文章编号  tsst2xvsukusswlts2s|zw2sw
≈收稿日期  ussw2sv2sv
≈基金项目  天津市科委重点基金资助项目kssv{svwttl
≈通讯作者  3陈力 oר¯ }ksuuluvxssus{ oƒ¤¬}ksuuluvw|zsts o∞2
°¤¬¯ }¯¬¦«¨ ±ty ƒ ¼¨²∏1¦²°
独角莲在我国传统中医治疗中广泛用于治疗多
种恶性肿瘤疾病 o有较好的临床疗效 o近年来对独角
莲的研究逐步增多≈t2z  ~动物模型实验也显示独角莲
可明显抑制肿瘤生长≈{ o|  ~细胞学实验发现 o独角莲
能较强抑制肝癌细胞系 ≥ ≤2zzut细胞的生长 o同
时 ≥ ≤2zzut细胞的生长被阻滞在 ≥期 o并能诱导
≥ ≤2zzut细胞凋亡的发生≈ts  ∀
本实验采用 °• ‘„差异显示k§¬©©¨µ¨±·¬¤¯ §¬¶³¯¤¼o
⁄⁄• × °≤• l技术≈tt  o对独角莲水提取物作用肝癌细
胞系 ≥ ≤2zzut后所引起的基因表达变化进行了
检测 ∀
1 材料与方法
111 肝癌细胞及其处理
实验用细胞材料肝癌细胞系 ≥ ≤2zzut购于
天津市肿瘤医院 ∀细胞培养用 ⁄∞ k⁄∏¯¥¨¦¦²χ¶
°²§¬©¬¨§∞¤ª¯ χ¨¶ °¨ §¬∏°l培养液 o含 ts h 胎牛血清
kׅ⁄公司l otss °ª#pt链霉素 ot1s ≅ tsx ˜#pt青
霉素 ~于 vz ε ox h ≤’u o湿润空气中进行细胞培养 ∀
细胞以 u ≅ tsx ∗ v ≅ tsx个r°密度接种于 zx ¦°u的
细胞培养瓶kuz °细胞悬液r瓶l o预培养 tu «后 o
对照组细胞每瓶加入 v1s °灭菌双蒸水 o加药组细
胞每瓶加入 v1s °vs ª#pt的独角莲水提取物k·«¨
¤´ ∏¨²∏¶ ¬¨·µ¤¦·©µ²° §µ¬¨§³²º§¨µ¨§µ«¬½²°¨ ¶²© Τψπηονι2
υµ γιγαντευµ ∞±ª¯1 o„∞²×Š∞o独角莲处理见文献
≈tv  ∀再培养 vy «后 o提取两组细胞的 • ‘„ ∀
112 引物设计
所有引物均由上海生工生物工程技术服务有限
公司合成 ~引物及其序列见表 t ∀
表 t 引物及序列
引物名称 序列
Š„°⁄‹ ≥¨ ±¶¨ xχ2„≤≤ „≤„ Š×≤ ≤„× Š≤≤ „×≤ „≤2vχ
„±·¬p¶¨±¶¨ xχ2≤≤„ ≤≤„ ≤≤≤ ×Š× ×Š≤ ×Š× „2vχ
vχ端锚定引物 …svuz xχ2„„Š ≤×× ××× ××× ×׊2vχ
…svu| xχ2„„Š ≤×× ××× ××× ××≤2vχ
xχ端随机引物 …svsu xχ2׊Š „×× ŠŠ× ≤2vχ
…svus xχ2Š„× ≤„„ ×≤Š ≤2vχ
tv引物 ≥¨ ±¶¨ xχ2„≤„ŠŠ„„„≤„Š≤ׄ׊„≤≤„2vχ
„±·¬p¶¨±¶¨ xχ2≤Š×׊ׄ„„„≤Š„≤ŠŠ≤≤„Š2vχ
‘∞• 2uzsu ≥¨ ±¶¨ xχ2×≤≤ ׊„ ׄ≤ ×≤≤ ≤≤× ≤2vχ
„±·¬p¶¨±¶¨ xχ2„≤„ ×׊ ≤׊ ≤ׄ ≤×× ≤ׄ2vχ
‘∞• 2u|us ≥¨ ±¶¨ xχ2×≤× „≤„ Š≤≤ ׊„ Š„≤ ≤≤„ ×≤≤2vχ
„±·¬p¶¨±¶¨ xχ2≤„„ ≤≤„ „„Š ≤„× ≤≤„ „Š× ≤„× ×2vχ
113 • ‘„提取
按 וŒ½²¯ 试剂kŒ±√¬·µ²ª¨±公司l提取细胞 • ‘„
的方法 o提取 „∞²×Š∞作用肝癌细胞 ≥ ≤2zzut vy
«以及对照组 ≥ ≤2zzut细胞的 • ‘„ o略有改动 ∀
用 u h的琼脂糖凝胶电泳检测 • ‘„的完整性 ~紫外
分光光度计检测 • ‘„质量 ∀
114 总 • ‘„的反转录
取 u Λª • ‘„ 加入 xs ³°²¯ 锚定引物 o按照 2
∂ 反转录酶kŠ¬¥¦²公司l的说明书进行 o略有改
动 ∀
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第 u|卷第 ts期
ussw年 ts月
中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
∂²¯1u| oŒ¶¶∏¨ ts
’¦·²¥¨µoussw
115 ⁄⁄• ×2°≤• 反应
以反转录产物为模板进行 °≤• o反应体系 us
ˏ}ws Λ°²¯ §‘×° ots ³°²¯ 端锚定引物 ots ³°²¯ 端随
机引物 o¦⁄‘„ t ˏot ˜ פ´ °¯ ∏¶⁄‘„ 酶 ∀反应条
件 }|x ε ov °¬±~ws个循环 }|w ε 变性 vs ¶ows ε 退
火 t °¬±ozu ε 延伸 t °¬±~最后 zu ε 再延伸 ts °¬±∀
116 差异条带的回收 !克隆与测序
11611 回收与扩增 将 x ˏ°≤• 产物经 y h非变
性聚丙烯酰胺凝胶电泳k°„Š∞l o用银染法显色≈tv  o
比较独角莲作用组同对照组的差异条带 ∀重复有差
异锚定引物和随机引物的组合 v次 o无菌条件下回
收差异条带 o加入 vx ˏ灭菌双蒸水 ovz ε 温浴过
夜 o取上清作为模板 o用相同的引物和 °≤• 条件进
行 u次 °≤• 扩增 ∀
11612 克隆与检测 把 °≤• 产物直接与 ³˜≤° ×
√¨ ¦·²µ连接 ow ε 过夜 ∀转化入 ⁄‹xΑ感受态细胞 ∀
挑选阳性克隆培养 o离心收集菌体 o沸水浴裂解 x
°¬±o冰浴 o离心以上清为底物 ~以 tv为引物进行
°≤• 扩增检测插入片断大小 ∀反应条件 }|x ε v
°¬±~vx个循环 }|w ε 变性 vs ¶oxw ε 退火 t °¬±ozu
ε 延伸 t °¬±~最后 zu ε 再延伸 ts °¬±∀
11613 测序 把转化有所需片段的质粒的 ⁄‹xΑ菌
液 o送至上海生工生物工程技术服务有限公司进行
测序 ∀
117 ‘²µ·«¨µ±杂交
11711 探针制备 测序结果在 ‘≤…Œ网站k«·³}rr
ººº1±¦¥¬1±¯ °1±¬«1ª²√r…„≥×rl用 …¯¤¶·进行核苷酸
序列的同源性分析 ∀根据同源性分析结果 o设计合
成两对引物 ‘∞• 2uzsu和 ‘∞• 2u|us ~并扩增三磷酸
甘油醛脱氢酶kŠ„°⁄‹l作为内标探针 ∀以相应锚定
引物反转录 • ‘„的产物为底物进行 °≤• 扩增 ∀按
照 •¤±§²° °µ¬°¨ µ⁄‘„ ¤¥¨ ¬¯±ª Ž¬·kפŽ¤•¤公司l的
操作方法对探针用≈Α2°vu  §≤×°标记 ∀
11712 转膜 • ‘„转移到尼龙膜参照5分子克隆实
验指南6的方法进行≈tw  ∀
11713 杂交 杂交流程参照文献≈tv 的方法进行 ∀
2 结果
211 • ‘„的提取
肝癌细胞系 ≥ ≤2zzut细胞经 „∞²×Š∞作用前
后提取的 • ‘„ o用 u h的琼脂糖凝胶电泳检测 • ‘„
的完整性k图 tl ou{ ≥与 t{ ≥能够达到 u比 t ox ≥比
较弱 o°• ‘„比较完整 ∀用紫外分光光度计测定 uys
±°及 u{s ±°处的吸收 oΑuys ±°与 Αu{s ±°比较 o比
值为 u1s o纯度良好 ∀
图 t • ‘„的琼脂糖凝胶电泳
t1 独角莲作用肝癌细胞 ≥ ≤2zzut vy «的 • ‘„ ~
u1对照组肝癌细胞 ≥ ≤2zzut的 • ‘„
212 °„Š∞后银染结果
≥ ≤2zzut细胞经 „∞²×Š∞作用前后显示出差
异表达条带k图 ul o从 °„Š∞胶上共回收 u条差异
¦⁄‘„条带 o大小在 tss ∗ wss ¥³∀差异条带回收扩
增k图 vl显示片段大小基本一致 o⁄‘„ 测序与胶上
产物大小也一致 ∀
图 u 聚丙烯酰胺凝胶电泳k°„Š∞l
1 ¤µ®¨µ~„1 引物 …svsu2…svuz 组合的扩增 o差异带记为
∞≥×uzsu ~…1∞≥×uzsu的 u次 °≤• 扩增 ~≤1 引物 …svus2…svu|组合
的扩增 o差异带记为 ∞≥×u|us ~⁄1∞≥×u|us的 u次 °≤• 扩增 ~t ow1
对照组 ~u ox1 独角莲作用 vy «组k箭头所示为差异带及其 u次扩
增产物l
213 °≤• 产物克隆与测序结果
用 tv引物进行 °≤• 鉴定具有插入片断的克
隆k如图 vl ~对阳性克隆进行测序 ∀差异片段
∞≥×uzsu的引物组合为 …svsu2…svuz o序列长 tvy ¥³o
其序列如下 }xχ2׊Š„×׊Š×≤׊≤≤„Š×„„„×ׄ„Š×
„Š≤×ׄ×׊„Š„ׄ„≤ׄ„≤„Š≤ׄ„„ׄׄŠ≤׊ׄŠ
׊×××≤≤׊„≤׊ׄׄ××≤ׄ׊„××ׄ„ׄ„„„×ׄ×
≤≤„Š„≤ׄŠ×ׄׄ×׊≤≤„„„„„„„„„„Š≤××2vχ 网
上 同 源 性 分 析 k «·³}rrººº1±¦¥¬1±¯ °1±¬«1ª²√r
…„≥×rl后用 ⁄‘„¶¶¬¶·软件分析 o片段 ∞≥×uzsu 与
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ussw年 ts月
中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
∂²¯1u| oŒ¶¶∏¨ ts
’¦·²¥¨µoussw
ts 号染色体上 • °tt2tz|‹t{ 区 域上的 ¦⁄‘„
ƒwvuzw≈ty 同源性高达 |y h ∀
图 v 用 tv引物对插入片进行 °≤• 扩增
t1∞≥×uzsu插入后的 °≤• 扩增 ~u1∞≥×u|us插入后的 °≤• 扩增
差异片段 ∞≥×u|us的引物组合为 …svus2…svu| o
序列长 v|x ¥³o其序列如下 }xχ2„„Š≤××××××××××≤„
׊≤׊≤׊ŠŠ×׊Š×„Š„Š„Š≤„Š×≤ׄ≤„Š≤≤׊„Š„
≤≤≤„×≤≤≤ׄŠŠ×„„Š×„„≤׊„„×׊„ŠŠ××׊×≤××
ŠŠ≤ׄ„„Š×ׄ„Š„≤ׄ„≤„„≤≤„Š≤׊Š×≤×ׄ„×××
≤×≤„×ׄ≤≤„×≤„Š„Š×Š≤×≤„Š×„„×≤„ׄׄ„Š×׊
׊≤Š„×׊„×≤„ׄŠ„„×≤≤„ׄ„„׊≤Š„×׊„×≤„„
×≤Š≤ׄׄ„≤„„≤„„„„„׊×≤„„Š„„„≤Š„×××ׄ×
ׄ„„„„Š„×׊ׄŠ„„Š≤„„Š„≤„„„„ׄ„׊„≤×׊
Š„׊≤××׊Š×׊„Š×Š„××ׄ≤„„„××ׄ„ׄŠ≤×≤≤
×××ׄŠ„≤×××≤„„„ׄ„„„≤≤„ׄ×≤×××׊×ׄׄ„
Š„„≤≤≤„„„„ׄ׊ŠŠ≤×≤„≤≤ׄŠ„„„„„„„„„„Š
≤××2vχ
网上同源性分析后用 ⁄‘„¶¶¬¶·软件分析 o片段
∞≥×u|us为一新发现序列 ∀前半段与 ÷ 号染色体上
的 …„≤ Š≥‹…2x|stx部分序列同源性较高 o后半段
与肺尖支原体k Μψχοπλασµα πυλµονισl的序列同源性
较高 ∀ ∞≥×uzsu 和 ∞≥×u|us 的序列已经提交 Š¨ ±2
…¤±®o序列号分别为 }≤Žzuxvsy o≤Žzuxvsz ∀
214 差异片段的鉴定
根据 213两条片段的序列及其比对合成引物 o
片段 ∞≥×uzsu以 ¦⁄‘„ ƒwvuzw的序列为模板设计
并合成引物 ‘∞• 2uzsu o产物长 wu{ ¥³~片段 ∞≥×u|us
以 ∞≥×u|us的序列设计并合成引物 ‘∞• 2u|us o产物
长uxv ¥³∀以 v2磷酸甘油醛脱氢酶kŠ„°⁄‹l为内
参 o用 ‘²µ·«¨µ±杂交鉴定基因的差异表达k图 wl ∀二
者在 „∞²×Š∞作用前后的表达差异与 ⁄⁄ • × °≤• 结
果一致 ∀
3 讨论
°• ‘„差异显示是由 ¬¤±ª和 °¤µ§¨¨建立起来
的一种检测基因表达改变简便而灵敏的方法≈tt  ∀
该技术经过多方面的改进和优化 o可以用于比较细
胞在不同状态下的 °• ‘„表达情况 o确定新基因 !发
现特定反应中的基因表达改变≈tx  ∀在本实验中 o独
角莲作用肝癌细胞 ≥ ≤2zzut vy «o利用 °•  „差
异表达技术第一轮用 v个锚定引物 ouy个随机引物
的 z{个组合得到差异片段 uu个 ~由于该技术具有
比较高的假阳性k可高达 zs h l o所以对差异片段的
引物组合重复 u次 o有效的降低了假阳性的出现 o最
后得到两个稳定的差异片段 ~‘²µ·«¨µ±杂交检测表明
这两个差异片段确实是差异表达的基因 ∀
图 w ‘²µ·«¨µ±杂交
t ou1探针为 Š„°⁄‹ ~v ow1 探针为 ‘∞• 2u|us的 °≤• 产物 ~x oy1探
针为 ‘∞• 2uzsu的 °≤• 产物 ~t ov ox1 对照组肝癌细胞 ≥ ≤2zzut
• ‘„ ~u ow oy1 独角莲作用肝癌细胞 ≥ ≤2zzut vy «的 • ‘„
检出差异片段 ∞≥×uzsu同 ts号染色体上 • °tt2
tz|‹t{区域上的 ¦⁄‘„ ƒwvuzw≈ty 高度同源k同源
性 |y h l ∀ ‘²µ·«¨µ±杂交时 o因为 ∞≥×uzsu序列仅有
tvy ¥³o为了得到较强的杂交信号 o所以采用提高探
针长度的方法 o即以 ¦⁄‘„ ƒwvuzw为模板设计引
物 ‘∞• 2uzsu o扩增出 wu{ ¥³的产物 ∀ ‘²µ·«¨µ±杂交
结果显示 o独角莲作用后该基因的表达上调 ∀
ƒwvuzw是肝癌细胞 ≥ ≤2zzut受独角莲诱导后
的高表达基因 o关于该基因的功能还需要更深入的
研究 ∀
本实验发现的另一个差异序列 ∞≥×u|us是一个
新的基因片段 ∀该片段的 tx ∗ tzy ¥³与人类基因多
条染色体上的序列完全相同 o全长同源性仅 yz h ~
该片段 ust ∗ v{t ¥³与支原体上的一个基因片段有
{z h同源性 o全长同源性 zv h ∀ ∞≥×u|us可能是一
个新基因的一部分 o其全长序列还有待进一步的研
究 o推测其功能应该同独角莲作用 ≥ ≤2zzut后的
某些基因表达受抑相关 ∀ °• ‘„ 差异表达和 ‘²µ·«2
µ¨±杂交结果一致 o从而表明 ∞≥×u|us在加入独角莲
后表达受到明显抑制 ∀
≈参考文献 
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白求恩医科大学学报 ot||x outkwl }vyw1
#yz|#
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Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
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’¦·²¥¨µoussw
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≈tx  ≥·∏µ·¨√¤±·1 „³³¯¬¦¤·¬²±¶²©§¬©©¨µ¨±·¬¤¯2§¬¶³¯¤¼ µ¨√ µ¨¶¨ ·µ¤±¶¦µ¬³·¬²±2
°≤• ·² °²¯ ¦¨∏¯¤µ³¤·«²ª¨ ±¨ ¶¬¶¤±§° §¨¬¦¤¯ °¼¦²¯²ª¼1 Χλιν Μιχροβιολ
Ρεϖousss otvkvl }ws{1
≈ty  ’·¤ × o ≥∏½∏®¬ ≠ o ‘¬¶«¬®¤º¤ × o ετ αλ1 ≤²°³¯ ·¨¨ ¶¨ ∏´¨ ±¦¬±ª ¤±§
¦«¤µ¤¦·¨µ¬½¤·¬²± ²©ut ouwv ©∏¯ 2¯¯ ±¨ª·««∏°¤± ¦⁄‘„¶1 Νατυρε Γενετ2
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ΣΜΜΧ2zzut τρεατεδ ωιτη Τψπηονιυµ γιγαντευµ εξτραχτ βψ µ ΡΝΑ διφφερεντιαλ δισπλαψ
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( Μολεχυλαρ Χψτογενετιχσ Λαβ , Νανκαι Υνιϖερσιτψ, Τιανϕιν vssszt , Χηινα)
[ Αρστραχτ] Οβϕεχτιϖε : ײ¶¦µ¨ ±¨ ¤±§¬§¨±·¬©¼·«¨ §¬©©¨µ¨±·¬¤¯ ¼¯ ¬¨³µ¨¶¶¨§ª¨ ±¨ ¶¬± «¨ ³¤·²¦¨¯¯∏¯¤µ¦¤µ¦¬±²°¤¦¨¯¯¶≥ ≤2zzut µ¨¶³²±¶2
¬±ª·²·«¨ ¤´ ∏¨²∏¶ ¬¨·µ¤¦·©µ²° §µ¬¨§³²º§¨µ¨§µ«¬½²° ¶¨²© Τψπηονιυµ γιγαντευµk„∞²×Š∞l1 Μετηοδ : ׫¨ µ¨¶³²±¶¨ ²©«¨ ³¤·²¦¨¯¯∏¯¤µ¦¤µ¦¬±²2
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zzut º µ¨¨ ·µ¨¤·¨§¥¼ „∞²×Š∞©²µvy «²∏µ¶ot ª¨ ±¨ ¬¨³µ¨¶¶¬²± º¤¶∏³ªµ¤§¨ ¤±§t ª¨ ±¨ ¬¨³µ¨¶¶¬²± º¤¶§²º±ªµ¤§¨ ¬±§∏¦¨§¥¼ „∞²×Š∞1 Χον2
χλυσιον : ׫¨ µ¨¶¨¤µ¦««¤¶³µ²√¬§¨§¬°³²µ·¤±·¦¯∏¨¶©²µ·«¨ °²¯ ¦¨∏¯¤µ° ¦¨«¤±¬¶° ²©«²º «¨ ³¤·²¦¤µ¦¬±²°¤¦¨¯¯¶µ¨¶³²±¶¨¬±ª·² Τ1 γιγαντευµ1
[ Κεψ ωορδσ] „∞²×Š∞ k·«¨ ¤´ ∏¨²∏¶ ¬¨·µ¤¦·©µ²° §µ¬¨§µ«¬½²° ¶¨²© Τψπηονιυµ γιγαντευµl ~°• ‘„ §¬©©¨µ¨±·¬¤¯ §¬¶³¯¤¼~‹ ³¨¤·²¦¨¯¯∏¯¤µ
≤¤µ¦¬±²°¤¦¨¯¯¶≥ ≤2zzut ≈责任编辑 方文贤 
红花注射液对大鼠局灶性脑缺血后梗死体积和
神经元凋亡相关蛋白 ¥¦¯2u o¦¤¶³¤¶¨2v表达的影响
罗 嘉t o方治平t 3 o周黎明t o来松涛u
kt1四川大学 华西医学中心 基础与法医学院 药理教研室 o四川 成都 ytsswt ~
u1河南省洛阳市急救中心 o河南 洛阳 wztsssl
≈摘要  目的 }探讨红花注射液对神经元凋亡相关蛋白 ¥¦¯2u o≤¤¶³¤¶¨2v表达的影响 ∀方法 }将 ≥⁄大鼠随机分
为缺血对照组 !红花大 !中 !小剂量组 o采用大鼠大脑中动脉栓塞模型以及 ××≤ 染色和免疫组织化学染色方法 o在不
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第 u|卷第 ts期
ussw年 ts月
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Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
∂²¯1u| oŒ¶¶∏¨ ts
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