全 文 :° 差异显示法比较独角莲作用肝癌细胞
≥ ≤2zzut前后的基因表达
王顺启 o倪 虹 o程 华 o王广良 o王同顺 o陈 力 3
k南开大学 生命科学学院 分子细胞遗传学研究室 o天津 vsssztl
≈摘要 目的 }研究独角莲根茎水提取物k∞²×∞l作用肝癌细胞 ≥ ≤2zzut后引起的细胞基因表达变化 ∀方
法 }利用 ° 差异显示技术 o以人肝癌细胞系 ≥ ≤2zzut细胞为研究对象 o筛选 ∞²×∞作用后表达改变的基因
片段 ∀结果 }经测序和鉴定 o发现 t个基因在加入 ∞²×∞后表达上升 ot个基因表达下降 ∀结论 }° 差异显示
可以用于中草药对细胞的作用机制研究 ∀
≈关键词 独角莲根茎水提取物 ~° 差异显示 ~肝癌细胞 ≥ ≤2zzut
≈中图分类号 u{x1x ≈文献标识码 ≈文章编号 tsst2xvsukusswlts2s|zw2sw
≈收稿日期 ussw2sv2sv
≈基金项目 天津市科委重点基金资助项目kssv{svwttl
≈通讯作者 3陈力 oר¯ }ksuuluvxssus{ oƒ¤¬}ksuuluvw|zsts o∞2
°¤¬¯ }¯¬¦«¨ ±ty ¼¨²∏1¦²°
独角莲在我国传统中医治疗中广泛用于治疗多
种恶性肿瘤疾病 o有较好的临床疗效 o近年来对独角
莲的研究逐步增多≈t2z ~动物模型实验也显示独角莲
可明显抑制肿瘤生长≈{ o| ~细胞学实验发现 o独角莲
能较强抑制肝癌细胞系 ≥ ≤2zzut细胞的生长 o同
时 ≥ ≤2zzut细胞的生长被阻滞在 ≥期 o并能诱导
≥ ≤2zzut细胞凋亡的发生≈ts ∀
本实验采用 ° 差异显示k§¬©©¨µ¨±·¬¤¯ §¬¶³¯¤¼o
⁄⁄ × °≤ l技术≈tt o对独角莲水提取物作用肝癌细
胞系 ≥ ≤2zzut后所引起的基因表达变化进行了
检测 ∀
1 材料与方法
111 肝癌细胞及其处理
实验用细胞材料肝癌细胞系 ≥ ≤2zzut购于
天津市肿瘤医院 ∀细胞培养用 ⁄∞ k⁄∏¯¥¨¦¦²χ¶
°²§¬©¬¨§∞¤ª¯ χ¨¶ °¨ §¬∏°l培养液 o含 ts h 胎牛血清
k×
⁄公司l otss °ª#pt链霉素 ot1s ≅ tsx #pt青
霉素 ~于 vz ε ox h ≤u o湿润空气中进行细胞培养 ∀
细胞以 u ≅ tsx ∗ v ≅ tsx个r°密度接种于 zx ¦°u的
细胞培养瓶kuz °细胞悬液r瓶l o预培养 tu «后 o
对照组细胞每瓶加入 v1s °灭菌双蒸水 o加药组细
胞每瓶加入 v1s °vs ª#pt的独角莲水提取物k·«¨
¤´ ∏¨²∏¶ ¬¨·µ¤¦·©µ²° §µ¬¨§³²º§¨µ¨§µ«¬½²°¨ ¶²© Τψπηονι2
υµ γιγαντευµ ∞±ª¯1 o∞²×∞o独角莲处理见文献
≈tv ∀再培养 vy «后 o提取两组细胞的 ∀
112 引物设计
所有引物均由上海生工生物工程技术服务有限
公司合成 ~引物及其序列见表 t ∀
表 t 引物及序列
引物名称 序列
°⁄ ≥¨ ±¶¨ xχ2≤≤ ≤ ×≤ ≤× ≤≤ ×≤ ≤2vχ
±·¬p¶¨±¶¨ xχ2≤≤ ≤≤ ≤≤≤ ×× ×≤ ×× 2vχ
vχ端锚定引物
svuz xχ2 ≤×× ××× ××× ××2vχ
svu| xχ2 ≤×× ××× ××× ××≤2vχ
xχ端随机引物
svsu xχ2× ×× × ≤2vχ
svus xχ2× ≤ ×≤ ≤2vχ
tv引物 ≥¨ ±¶¨ xχ2≤≤≤××≤≤2vχ
±·¬p¶¨±¶¨ xχ2≤×××≤≤≤≤2vχ
∞• 2uzsu ≥¨ ±¶¨ xχ2×≤≤ × ×≤ ×≤≤ ≤≤× ≤2vχ
±·¬p¶¨±¶¨ xχ2≤ ×× ≤× ≤× ≤×× ≤×2vχ
∞• 2u|us ≥¨ ±¶¨ xχ2×≤× ≤ ≤≤ × ≤ ≤≤ ×≤≤2vχ
±·¬p¶¨±¶¨ xχ2≤ ≤≤ ≤× ≤≤ × ≤× ×2vχ
113 提取
按 ×½²¯ 试剂k±√¬·µ²ª¨±公司l提取细胞
的方法 o提取 ∞²×∞作用肝癌细胞 ≥ ≤2zzut vy
«以及对照组 ≥ ≤2zzut细胞的 o略有改动 ∀
用 u h的琼脂糖凝胶电泳检测 的完整性 ~紫外
分光光度计检测 质量 ∀
114 总 的反转录
取 u Λª 加入 xs ³°²¯ 锚定引物 o按照 2
∂ 反转录酶k¬¥¦²公司l的说明书进行 o略有改
动 ∀
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第 u|卷第 ts期
ussw年 ts月
中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
∂²¯1u| o¶¶∏¨ ts
¦·²¥¨µoussw
115 ⁄⁄ ×2°≤ 反应
以反转录产物为模板进行 °≤ o反应体系 us
Λ}ws Λ°²¯ §×° ots ³°²¯ 端锚定引物 ots ³°²¯ 端随
机引物 o¦⁄ t Λot פ´ °¯ ∏¶⁄ 酶 ∀反应条
件 }|x ε ov °¬±~ws个循环 }|w ε 变性 vs ¶ows ε 退
火 t °¬±ozu ε 延伸 t °¬±~最后 zu ε 再延伸 ts °¬±∀
116 差异条带的回收 !克隆与测序
11611 回收与扩增 将 x Λ°≤ 产物经 y h非变
性聚丙烯酰胺凝胶电泳k°∞l o用银染法显色≈tv o
比较独角莲作用组同对照组的差异条带 ∀重复有差
异锚定引物和随机引物的组合 v次 o无菌条件下回
收差异条带 o加入 vx Λ灭菌双蒸水 ovz ε 温浴过
夜 o取上清作为模板 o用相同的引物和 °≤ 条件进
行 u次 °≤ 扩增 ∀
11612 克隆与检测 把 °≤ 产物直接与 ³≤° ×
√¨ ¦·²µ连接 ow ε 过夜 ∀转化入 ⁄xΑ感受态细胞 ∀
挑选阳性克隆培养 o离心收集菌体 o沸水浴裂解 x
°¬±o冰浴 o离心以上清为底物 ~以 tv为引物进行
°≤ 扩增检测插入片断大小 ∀反应条件 }|x ε v
°¬±~vx个循环 }|w ε 变性 vs ¶oxw ε 退火 t °¬±ozu
ε 延伸 t °¬±~最后 zu ε 再延伸 ts °¬±∀
11613 测序 把转化有所需片段的质粒的 ⁄xΑ菌
液 o送至上海生工生物工程技术服务有限公司进行
测序 ∀
117 ²µ·«¨µ±杂交
11711 探针制备 测序结果在 ≤
网站k«·³}rr
ººº1±¦¥¬1±¯ °1±¬«1ª²√r
≥×rl用
¯¤¶·进行核苷酸
序列的同源性分析 ∀根据同源性分析结果 o设计合
成两对引物 ∞• 2uzsu和 ∞• 2u|us ~并扩增三磷酸
甘油醛脱氢酶k°⁄l作为内标探针 ∀以相应锚定
引物反转录 的产物为底物进行 °≤ 扩增 ∀按
照 ¤±§²° °µ¬°¨ µ⁄ ¤¥¨ ¬¯±ª ¬·kפ¤¤公司l的
操作方法对探针用≈Α2°vu §≤×°标记 ∀
11712 转膜 转移到尼龙膜参照5分子克隆实
验指南6的方法进行≈tw ∀
11713 杂交 杂交流程参照文献≈tv 的方法进行 ∀
2 结果
211 的提取
肝癌细胞系 ≥ ≤2zzut细胞经 ∞²×∞作用前
后提取的 o用 u h的琼脂糖凝胶电泳检测
的完整性k图 tl ou{ ≥与 t{ ≥能够达到 u比 t ox ≥比
较弱 o° 比较完整 ∀用紫外分光光度计测定 uys
±°及 u{s ±°处的吸收 oΑuys ±°与 Αu{s ±°比较 o比
值为 u1s o纯度良好 ∀
图 t 的琼脂糖凝胶电泳
t1 独角莲作用肝癌细胞 ≥ ≤2zzut vy «的 ~
u1对照组肝癌细胞 ≥ ≤2zzut的
212 °∞后银染结果
≥ ≤2zzut细胞经 ∞²×∞作用前后显示出差
异表达条带k图 ul o从 °∞胶上共回收 u条差异
¦⁄条带 o大小在 tss ∗ wss ¥³∀差异条带回收扩
增k图 vl显示片段大小基本一致 o⁄ 测序与胶上
产物大小也一致 ∀
图 u 聚丙烯酰胺凝胶电泳k°∞l
1 ¤µ®¨µ~1 引物
svsu2
svuz 组合的扩增 o差异带记为
∞≥×uzsu ~
1∞≥×uzsu的 u次 °≤ 扩增 ~≤1 引物
svus2
svu|组合
的扩增 o差异带记为 ∞≥×u|us ~⁄1∞≥×u|us的 u次 °≤ 扩增 ~t ow1
对照组 ~u ox1 独角莲作用 vy «组k箭头所示为差异带及其 u次扩
增产物l
213 °≤ 产物克隆与测序结果
用 tv引物进行 °≤ 鉴定具有插入片断的克
隆k如图 vl ~对阳性克隆进行测序 ∀差异片段
∞≥×uzsu的引物组合为
svsu2
svuz o序列长 tvy ¥³o
其序列如下 }xχ2××××≤×≤≤××××
≤×××××≤×≤≤×××≤××
××××≤≤×≤×××××≤×××××××××
≤≤≤××××××≤≤≤××2vχ 网
上 同 源 性 分 析 k «·³}rrººº1±¦¥¬1±¯ °1±¬«1ª²√r
≥×rl后用 ⁄¶¶¬¶·软件分析 o片段 ∞≥×uzsu 与
#xz|#
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ussw年 ts月
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Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
∂²¯1u| o¶¶∏¨ ts
¦·²¥¨µoussw
ts 号染色体上 °tt2tz|t{ 区 域上的 ¦⁄
ƒwvuzw≈ty 同源性高达 |y h ∀
图 v 用 tv引物对插入片进行 °≤ 扩增
t1∞≥×uzsu插入后的 °≤ 扩增 ~u1∞≥×u|us插入后的 °≤ 扩增
差异片段 ∞≥×u|us的引物组合为
svus2
svu| o
序列长 v|x ¥³o其序列如下 }xχ2≤××××××××××≤
×≤×≤××××≤×≤×≤≤≤×
≤≤≤×≤≤≤×××≤×××××××≤××
≤×××≤×≤≤≤≤××≤×××××
≤×≤××≤≤×≤×≤×≤××≤××××
×≤×××≤××≤≤××≤×××≤
×≤≤××≤≤××≤≤×××××
××××≤≤××≤××
×≤×××××××××≤××××≤×≤≤
××××≤×××≤×≤≤××≤×××××××
≤≤≤××≤×≤≤≤×
≤××2vχ
网上同源性分析后用 ⁄¶¶¬¶·软件分析 o片段
∞≥×u|us为一新发现序列 ∀前半段与 ÷ 号染色体上
的
≤ ≥
2x|stx部分序列同源性较高 o后半段
与肺尖支原体k Μψχοπλασµα πυλµονισl的序列同源性
较高 ∀ ∞≥×uzsu 和 ∞≥×u|us 的序列已经提交 ¨ ±2
¤±®o序列号分别为 }≤zuxvsy o≤zuxvsz ∀
214 差异片段的鉴定
根据 213两条片段的序列及其比对合成引物 o
片段 ∞≥×uzsu以 ¦⁄ ƒwvuzw的序列为模板设计
并合成引物 ∞• 2uzsu o产物长 wu{ ¥³~片段 ∞≥×u|us
以 ∞≥×u|us的序列设计并合成引物 ∞• 2u|us o产物
长uxv ¥³∀以 v2磷酸甘油醛脱氢酶k°⁄l为内
参 o用 ²µ·«¨µ±杂交鉴定基因的差异表达k图 wl ∀二
者在 ∞²×∞作用前后的表达差异与 ⁄⁄ × °≤ 结
果一致 ∀
3 讨论
° 差异显示是由 ¬¤±ª和 °¤µ§¨¨建立起来
的一种检测基因表达改变简便而灵敏的方法≈tt ∀
该技术经过多方面的改进和优化 o可以用于比较细
胞在不同状态下的 ° 表达情况 o确定新基因 !发
现特定反应中的基因表达改变≈tx ∀在本实验中 o独
角莲作用肝癌细胞 ≥ ≤2zzut vy «o利用 ° 差
异表达技术第一轮用 v个锚定引物 ouy个随机引物
的 z{个组合得到差异片段 uu个 ~由于该技术具有
比较高的假阳性k可高达 zs h l o所以对差异片段的
引物组合重复 u次 o有效的降低了假阳性的出现 o最
后得到两个稳定的差异片段 ~²µ·«¨µ±杂交检测表明
这两个差异片段确实是差异表达的基因 ∀
图 w ²µ·«¨µ±杂交
t ou1探针为 °⁄ ~v ow1 探针为 ∞• 2u|us的 °≤ 产物 ~x oy1探
针为 ∞• 2uzsu的 °≤ 产物 ~t ov ox1 对照组肝癌细胞 ≥ ≤2zzut
~u ow oy1 独角莲作用肝癌细胞 ≥ ≤2zzut vy «的
检出差异片段 ∞≥×uzsu同 ts号染色体上 °tt2
tz|t{区域上的 ¦⁄ ƒwvuzw≈ty 高度同源k同源
性 |y h l ∀ ²µ·«¨µ±杂交时 o因为 ∞≥×uzsu序列仅有
tvy ¥³o为了得到较强的杂交信号 o所以采用提高探
针长度的方法 o即以 ¦⁄ ƒwvuzw为模板设计引
物 ∞• 2uzsu o扩增出 wu{ ¥³的产物 ∀ ²µ·«¨µ±杂交
结果显示 o独角莲作用后该基因的表达上调 ∀
ƒwvuzw是肝癌细胞 ≥ ≤2zzut受独角莲诱导后
的高表达基因 o关于该基因的功能还需要更深入的
研究 ∀
本实验发现的另一个差异序列 ∞≥×u|us是一个
新的基因片段 ∀该片段的 tx ∗ tzy ¥³与人类基因多
条染色体上的序列完全相同 o全长同源性仅 yz h ~
该片段 ust ∗ v{t ¥³与支原体上的一个基因片段有
{z h同源性 o全长同源性 zv h ∀ ∞≥×u|us可能是一
个新基因的一部分 o其全长序列还有待进一步的研
究 o推测其功能应该同独角莲作用 ≥ ≤2zzut后的
某些基因表达受抑相关 ∀ ° 差异表达和 ²µ·«2
µ¨±杂交结果一致 o从而表明 ∞≥×u|us在加入独角莲
后表达受到明显抑制 ∀
≈参考文献
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#yz|#
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Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
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°≤ ·² °²¯ ¦¨∏¯¤µ³¤·«²ª¨ ±¨ ¶¬¶¤±§° §¨¬¦¤¯ °¼¦²¯²ª¼1 Χλιν Μιχροβιολ
Ρεϖousss otvkvl }ws{1
≈ty ·¤ × o ≥∏½∏®¬ ≠ o ¬¶«¬®¤º¤ × o ετ αλ1 ≤²°³¯ ·¨¨ ¶¨ ∏´¨ ±¦¬±ª ¤±§
¦«¤µ¤¦·¨µ¬½¤·¬²± ²©ut ouwv ©∏¯ 2¯¯ ±¨ª·««∏°¤± ¦⁄¶1 Νατυρε Γενετ2
ιχσoussv ovyktl }ws1
∆ετεχτιον οφ διφφερεντιαλλψεξπρεσσεδ γενεσιν ηεπατοχελλυλαρχαρχινοµα χελλσ
ΣΜΜΧ2zzut τρεατεδ ωιτη Τψπηονιυµ γιγαντευµ εξτραχτ βψ µ ΡΝΑ διφφερεντιαλ δισπλαψ
• ≥«∏±2 ¬´o ²±ªo≤∞ ∏¤o • ∏¤±ª2¯¬¤±ªo • ײ±ª2¶«∏±o≤∞¬
( Μολεχυλαρ Χψτογενετιχσ Λαβ , Νανκαι Υνιϖερσιτψ, Τιανϕιν vssszt , Χηινα)
[ Αρστραχτ] Οβϕεχτιϖε : ײ¶¦µ¨ ±¨ ¤±§¬§¨±·¬©¼·«¨ §¬©©¨µ¨±·¬¤¯ ¼¯ ¬¨³µ¨¶¶¨§ª¨ ±¨ ¶¬± «¨ ³¤·²¦¨¯¯∏¯¤µ¦¤µ¦¬±²°¤¦¨¯¯¶≥ ≤2zzut µ¨¶³²±¶2
¬±ª·²·«¨ ¤´ ∏¨²∏¶ ¬¨·µ¤¦·©µ²° §µ¬¨§³²º§¨µ¨§µ«¬½²° ¶¨²© Τψπηονιυµ γιγαντευµk∞²×∞l1 Μετηοδ : ׫¨ µ¨¶³²±¶¨ ²©«¨ ³¤·²¦¨¯¯∏¯¤µ¦¤µ¦¬±²2
°¤¦¨¯¯¶≥ ≤2zzut·² ∞²×∞ º¤¶ ¬¨³¯²µ¨§º¬·«·«¨ ·¨¦«±¬´∏¨ ²© ° §¬©©¨µ¨±·¬¤¯ §¬¶³¯¤¼1 Ρεσυλτ : ©·¨µ«¨ ³¤·²¦¤µ¦¬±²°¤¦¨¯¯¶≥ ≤2
zzut º µ¨¨ ·µ¨¤·¨§¥¼ ∞²×∞©²µvy «²∏µ¶ot ª¨ ±¨ ¬¨³µ¨¶¶¬²± º¤¶∏³ªµ¤§¨ ¤±§t ª¨ ±¨ ¬¨³µ¨¶¶¬²± º¤¶§²º±ªµ¤§¨ ¬±§∏¦¨§¥¼ ∞²×∞1 Χον2
χλυσιον : ׫¨ µ¨¶¨¤µ¦««¤¶³µ²√¬§¨§¬°³²µ·¤±·¦¯∏¨¶©²µ·«¨ °²¯ ¦¨∏¯¤µ° ¦¨«¤±¬¶° ²©«²º «¨ ³¤·²¦¤µ¦¬±²°¤¦¨¯¯¶µ¨¶³²±¶¨¬±ª·² Τ1 γιγαντευµ1
[ Κεψ ωορδσ] ∞²×∞ k·«¨ ¤´ ∏¨²∏¶ ¬¨·µ¤¦·©µ²° §µ¬¨§µ«¬½²° ¶¨²© Τψπηονιυµ γιγαντευµl ~° §¬©©¨µ¨±·¬¤¯ §¬¶³¯¤¼~ ³¨¤·²¦¨¯¯∏¯¤µ
≤¤µ¦¬±²°¤¦¨¯¯¶≥ ≤2zzut ≈责任编辑 方文贤
红花注射液对大鼠局灶性脑缺血后梗死体积和
神经元凋亡相关蛋白 ¥¦¯2u o¦¤¶³¤¶¨2v表达的影响
罗 嘉t o方治平t 3 o周黎明t o来松涛u
kt1四川大学 华西医学中心 基础与法医学院 药理教研室 o四川 成都 ytsswt ~
u1河南省洛阳市急救中心 o河南 洛阳 wztsssl
≈摘要 目的 }探讨红花注射液对神经元凋亡相关蛋白 ¥¦¯2u o≤¤¶³¤¶¨2v表达的影响 ∀方法 }将 ≥⁄大鼠随机分
为缺血对照组 !红花大 !中 !小剂量组 o采用大鼠大脑中动脉栓塞模型以及 ××≤ 染色和免疫组织化学染色方法 o在不
#zz|#
第 u|卷第 ts期
ussw年 ts月
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Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
∂²¯1u| o¶¶∏¨ ts
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