全 文 ：mRNA差异显示法筛选黄花石蒜中
加兰他敏合成相关基因
〔摘要〕 目的 筛选和克隆黄花石蒜加兰他敏相关基因。方法 采用 mRNA 差异显示法（mRNA differential display
PCR，DD-PCR）， 对 7 月份黄花石蒜产加兰他敏含量最高的部位花蕊和含量最低的部位花葶进行基因表达差异的研
究，筛选其差异片段，再对差异片段进行回收、克隆、测序及序列分析和同源性比较。 结果 黄花石蒜花蕊和花葶中存
在明显的基因表达差异，发现差异条带 44 条，经序列分析和同源性比较，确认其中 2 个条带与黄花石蒜加兰他敏合成
相关，另一条可能与加兰他敏运输代谢调控有关。 结论 通过 DD-PCR 得到的 3 个同源序列为研究黄花石蒜中加兰他
敏的合成途径提供了有力依据。
〔关键词〕 黄花石蒜；加兰他敏；mRNA 差异显示技术；生物信息学
〔中图分类号〕R284 〔文献标识码〕B 〔文章编号〕doi:10.3969/j.issn.1674－070X.2012.07.010.034.03
Screening of the gene related to galantamine biosynthesis
of Lycoris aurea Herb. by mRNA differential display
TANG Jin-feng， LU Yao-bang， GUI Lui-zi
(TCM Uniwersity of Hunan, Changsha, Hunan 410208, China)
〔Abstract〕 Objective To isolate and clone the gene related to galantamine biosynthesis of Lycoris
aurea Herb. Methods The specially expression cDNA fragments of the gene related to galantamine
biosynthesis were screened by differential display polymerase chain reaction(DD-PCR) after extract-
ing the total RNA from the pistils tissues and the scape tissues of the Lycoris aurea
Herb cropped in July which had differential contents of the galantamine. Then these fragments
were separately cloned to plasmid PMD19 -T and subsequently underwent sequence analysis
and homogenous comparison. Results 44 differential display bands were found in gene expression
between the pistils tissues and the scape tissues of the Lycoris aurea Herb. According to the se-
quence analysis and homologenous comparison， two of them were confirmed to related
with galantamine biosynthesis， one of them was possible related with galantamine transport regula-
tion. Conclusion The three homologous sequences of Lycoris aurea screened by DD-PCR provide
strong basis of galantamine synthetic pathways.
〔Key words〕 Lycoris aurea Herb; galantamine; mRNA DD-PCR; bioinformatics
唐金凤，鲁耀邦 *，桂柳姿
（湖南中医药大学药学院，中药药性与药效三级科研实验室，省中药现代化研究实验室，湖南 长沙 410208）
〔收稿日期〕2012－02－27
〔基金项目〕湖南省自然科学基金资助项目(10JJ2024)；湖南省教育厅科研基金资助项目(07A052)。
〔作者简介〕唐金凤(1985-)，女，湖南衡阳人，在读硕士研究生，主要从事中药质量与资源研究工作。
〔通讯作者〕* 鲁耀邦，男，教授，硕士研究生导师，E-mail:luyb414@sina.com。
·中药分析·
2012 年 7 月第 32 卷第 7 期
Jul． 2012 Vol． 32 No． 7
湖 南 中 医 药 大 学 学 报
Journal of TCM Univ． of Hunan34
黄花石蒜（Lycoris aurea Herb.）系石蒜属植物，
内含生物碱、多糖、黄酮、氨基酸及凝集素等化学成
分[1-3]，其中加兰他敏含量比石蒜属其他植物高[4]。 加
兰他敏是治疗阿尔茨海默氏病（AD）的首选药物之
一。临床研究表明，加兰他敏可明显改善 AD患者的
认知能力且毒副作用小， 其作为治疗轻度至中重度
AD 的药物已在欧盟国家上市 [5-7]。 通过相关文献研
究发现： 七月份的黄花石蒜花中加兰他敏的含量花
中含量最高，茎（花葶）含量最少 [8]，另有文献表明花
中花蕊部分加兰他敏含量最高 [9]，提示黄花石蒜不
同部位中生物活性物质加兰他敏合成相关关键酶基
因及加兰他敏生物合成代谢途径存在差异。 目前加
兰他敏生物合成代谢途径尚不明确， 本实验以此为
立题依据 ， 借助近年来检测基因的一种高效方
法—mRNA差异显示技术（DD-PCR）[10]，研究黄花石
蒜的花蕊与花葶的差异表达， 并对其克隆进行生物
信息学分析， 为黄花石蒜中加兰他敏合成代谢提供
可靠的理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
黄花石蒜采自于湖南衡山， 经湖南中医药大学
中药鉴定教研室潘清平教授鉴定为石蒜科石蒜属植
物 Lycoris aurea Herb.。
1.2 主要试剂
RNA 提取试剂盒购自 TIANGEN 公司；26 条随
机引物和 3 条锚定引物购自上海生物工程有限公
司 ； 反 转 录 酶 M -MLV，RNasin Inhibitor 购 自
Promega 公司；QIAEX Gel Extraction Kit 购自美国
QIAGEN 公司 ； PMD19-T Vector 购自 TaKaRa 公
司。
1.3 方法
1.3.1 黄花石蒜花蕊与花葶总 RNA 的提取 参照
TIANGEN植物总 RNA提取试剂盒的说明书进行操
作[11]。
1.3.2 cDNA合成 参照 M-MLV试剂说明书操作，
反转录所用的锚定引物与 PCR 所用的锚定引物一
致，最后将合成的 cDNA保存于-20 ℃。
1.3.3 差异显示 PCR 用 3 种锚定引物与 26 种随
机引物的不同组合， 分别以花蕊和花葶的反转录产
物为底物进行 156个 PCR反应[11]。
1.3.4 差异显示片段的聚丙烯酰胺凝胶电泳
（PAGE） PCR产物在 6%PAGE胶上电泳， 将 PCR
产物与 6×loading buffer 以 4∶1 比例混匀， 上样，以
8V/cm的恒定电压电泳至溴酚蓝移出胶外， 二甲苯
氰 FF离胶底部 1.5 cm 处， 停止电泳。 对凝胶进行
染色参照梁宏伟等 [12]改良的银染方法，于 26 ℃ 60
r/min震荡箱中振摇显影。用 GIS-1000B Tanon 凝胶
成像系统观察照相并保存图片。
1.3.5 PAGE 电泳差异显示片段的回收及回收片段
的第二次 PCR 反应 参照王永成等 [13]的方法略有
改进，用无菌水清洗胶若干次，将差异条带用消毒后
的手术刀片切下并编号；用无菌水清洗条带 2次，每
次 200 μL；用灭菌的 Tip 头将胶碾碎；加入 30 μL
无菌水， 用封口膜将管口封严； 沸水中煮 8 min；
4 ℃ 12 000 r/min 离心 2 min， 取 3～4 μL 上清液
进行第二次 PCR，第二次 PCR 反应体系与条件同第
一次 PCR 反应。 通过 1.2%琼脂糖凝胶电泳检测目
的条带。
1.3.6 回收片段的克隆 （1）回收片段二次 PCR 产
物的纯化： 参考 QIAGEN 的琼脂糖凝胶 DNA 回收
试剂盒说明书中具体步骤进行。 （2） 纯化产物的连
接反应：参照 TaKaRa 公司的 PMD19-T Vector 说明
书进行操作。（3）克隆：参照陶杰等[14]的方法进行。将
克隆所得的阳性菌液送上海博尚公司进行测序。
1.3.7 差异显示片段序列比对及分析 在 GenBank
数据库 （网址为 ：http://www.ncbi.nlm.nih.gov）中 ，将
所测序列通过 BLASTN 软件及 BLASTX 软件进行
分析，寻找与其它蛋白序列的同源性。
2 结果
2.1 mRNA 差异显示 PCR
以随机引物与锚定引物配对， 扩增 cDNA，用
6%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离差异条带， 如图 1 所
示。
M:100 bp Marker；1、3、5、7：花蕊组织；2、4、6、8：花葶组织；白
色箭头：差异条带
图 1 6%聚丙烯酰胺凝胶电泳图
唐金凤，等 mRNA 差异显示法筛选黄花石蒜中加兰他敏合成相关基因第 7 期 35
2.2 差异条带的第二次扩增及凝胶回收
从 6%聚丙烯酰胺凝胶中回收差异条带， 并进
行第二次 PCR 扩增，经 1.2%琼脂糖凝胶电泳，证实
其为单一条带，如图 2 所示。 通过 QIAGEN 公司提
供的普通琼脂糖凝胶电泳 DNA 回收试剂盒回收差
异条带用于克隆。
2.3 差异条带克隆及转化子的鉴定
将回收的差异 DNA 条带连接至 PMD19-T 载
体中，转化后，将菌落进行 PCR，经 1.2%琼脂糖凝
胶电泳，证实重组质粒中含有插入的目的基因片段
（如图3）。
2.4 差异条带的序列分析及同源性比较
本试验最终得到 44 条差异条带，通过 BLASTN
数据库及 BLASTX 数据库进行同源性比较，发现其
中 C290115 与快速碱化因子前体、C270614-2 与脱
乙酰酶组蛋白 14、C271212-2 与 I 类热休克蛋白有
较高的同源性。 BLASTN及 BLASTX比对如表 1。
A 图中 M:100 bp Marker，115:C290115；B 图中 M:100 bp Mark-
er，614:C270614-2；C 图中 M:100bpMarker，1212:C271212-2
图 2 差异条带琼脂糖凝胶回收电泳图
A 图中 M:100 bp Marker，115: 回收片段二次 PCR 产物 ，c115:
C290115 菌落 PCR 产物 ;B 图中 M:100 bp Marker，614:C270614-2
菌落 PCR产物，1212:C271212-2 菌落 PCR产物
图 3 目的基因的鉴定电泳图
表 1 差异片段在 GenBank 中 Blastn 及 Blastx 分析
差异片段
C290115
C290614-2
C291212-2
片段大小（bp）
574
754
737
同源蛋白/基因
RALF precursor
histone deacetylase 14
17.5 kDa class I HSP mRNA
物种
烟草 Nicotiana tabacum
葡萄 Vitis vinifera
落花生 Arachis hypogaea
比对分值
168
222
105
相似程度（%）
184/244(72)
333/392(85)
79/93(85)
E-Value
3e-38
9e-68
3e-19
3 讨论
目前， 对黄花石蒜的研究主要致力于愈伤组织
培养[15-17]和化学成分 [1-3]及植物组织中加兰他敏的定
位方面 [18]，而未见加兰他敏生物合成代谢途径方面
的研究报道。 本试验旨在从基因转录水平研究加兰
他敏生物合成代谢途径。 我国 20世纪 60年代开始
石蒜碱高含量植物的寻找工作， 对石蒜属植物鳞茎
中加兰他敏的含量测定的结果表明， 黄花石蒜为石
蒜属植物中加兰他敏的含量最高的物种之一 [19] 。 7
月份黄花石蒜花中加兰他敏含量最高，根次之，鳞茎
和茎（花葶）中含量最少 [8]，此结果与李子璇等 [9]发现
结果一致， 说明这个时期同一生存条件下石蒜中的
加兰他敏主要富集于生殖器官， 尤其花蕊中；8月份
的黄花石蒜不同部位中加兰他敏主要集中在鳞茎
中，须根、叶、花、花苔中则含量较少[21]，说明这一时期
下鳞茎是加兰他敏的主要储存部位。 本试验通过比
较 7月份的黄花石蒜花蕊和花葶的基因转录水平上
存在差异， 筛选出的三个同源序列中其中快速碱化
因子前体基因和脱乙酰酶组蛋白 14 基因同源序列
可能与加兰他敏的生物合成代谢途径有关， 其功能
的验证有待后续实验的进行。 在黄花石蒜的花蕊中
还克隆出热休克蛋白基因， 推测其可能因外界气温
的变化而调控加兰他敏的代谢及运输， 此结果有待
进一步研究。差异显示 DD-PCR克隆出的 44个差异
条带中，大部分为未知，有待进一步验证及分析。
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（本文编辑 杨 瑛）
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声效果比回流好。
提取时间考察：取海金子（花垣 8月）叶粉末（过
一号筛），4 份， 每份 0.5 g， 分别超声 20、30、45、
60 min 放冷，其他提取和测定条件相同。 测得样品
含量，结果 30 min 样品可提取完全。
3.3 结果分析
芦丁结构鉴定中，由于有中检所对照品提供，采
用液相色谱结合薄层色谱进行鉴别， 比照样品与对
照品的保留时间与 Rf值确定该化合物为芦丁；而柽
柳素－3－O芸香糖苷无法定对照品，故选用波谱技术
进行结构鉴定。
从表 4中可以看出海金子叶、茎皮、果实中柽柳
素-3-O-芸香糖苷和芦丁含量差异显著， 两个化合
物叶含量最高； 不同采集时间海金子柽柳素-3-O-
芸香糖苷和芦丁含量差异显著， 其中柽柳素-3-O-
芸香糖苷 8月含量较低， 芦丁 3月含量较低。 本文
采用 HPLC 测定几个不同采集时间海金子叶、茎皮、
果实中柽柳素-3-O-芸香糖苷和芦丁的含量， 为海
金子的开发利用提供了实验依据。
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（本文编辑 杨 瑛）
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彭一波，等 海金子中柽柳素-3-O-芸香糖苷和芦丁的分离及含量测定第 7 期 49