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Molecular Mechanism of Wendan Tang in Prevention of Lipid Metabolism Disorder in Adult Rats

温胆汤对高脂血症大鼠脂质代谢的影响



全 文 :温胆汤对高脂血症大鼠脂质代谢的影响
淳 泽t ov o李佳楠t o陈东辉u o罗 霞u o程耀锋t o杨志荣t
kt q四川大学 生命科学学院 o四川 成都 ytssyw ~u q四川省中药研究所 o四川 成都 ytsswt ~
v q中国科学院 成都生物研究所 o四川 成都 ytsswtl
≈摘要  目的 }探讨温胆汤对高脂血症大鼠低密度脂蛋白受体基因表达的影响 ∀方法 }在建立大鼠高脂血症
模型基础上 o观察温胆汤对大鼠血脂水平 !总脂解酶k„l !脂蛋白脂酶k°l和肝脂酶k‹l活性以及肝脏低密度
脂蛋白受体k⁄• l基因表达的影响 ∀结果 }温胆汤能显著抑制高脂模型大鼠血清总胆固醇k× ≤l !血清总甘油三
酯k× Šl浓度 o提高 °和 „ 活性 o但对 ‹活性无明显影响 ~逆转录聚合酶链反应k• ×2°≤ • l实验显示高脂模型
大鼠肝脏 ⁄• °• ‘„表达降低 o温胆汤能显著上调高脂血症大鼠肝脏 ⁄• °• ‘„ 水平 ∀结论 }温胆汤可能通
过调节大鼠肝脏 ⁄• 转录水平预防脂质代谢紊乱 ∀
≈关键词  温胆汤 ~血清总胆固醇 ~血清总甘油三酯 ~低密度脂蛋白受体 ~反转录聚合酶链反应
≈中图分类号  • u{x qx ≈文献标识码  „ ≈文章编号  tsst2xvsukussvltu2tt{v2sw
高脂血症是临床多发病 !常见病 o也是动脉粥样
硬化 !冠心病的主要危险因素之一 o近来医学界对其
治疗极为重视≈t  ∀人血中 zs h的胆固醇由低密度
脂蛋白k⁄l和极低密度脂蛋白k∂ ⁄l携带 ∀循
环中约 zx h ⁄由肝脏清除 o其中 |s h是由低密
度脂蛋白受体k⁄• l途径清除的 ∀ Š²¯§¶·¨¬± 和
…µ²º±也证实家族性高脂血症与 ⁄• 密切相关 o
⁄• 是体内清除胆固醇的主要途径≈u  ∀本实验选
用 ≥⁄大鼠高脂造模加药物干预 o旨从分子水平观
察温胆汤对高脂血症大鼠低密度脂蛋白受体基因表
达的影响 o以期探讨该药的降脂作用机理 ∀
1 材料与方法
1 q1 药物
温胆汤源于5三因极一病证方论6 o由半夏 y ªo
竹茹 y ªo枳实 y ªo陈皮 | ªo茯苓 x ªo甘草 v ª组成 ∀
药材洗净后以 ts倍量水煎 t qx «o倒出水煎液 o再以
x倍水煎 t «o合并水煎液于水浴挥发浓缩成每毫升
u ª生药 ow ε 保存备用 ∀
脂肪乳 }胆固醇 ts ªo丙二醇 us °o三号胆盐 u
ªo山梨醇甲酯 us °o丙赛优 t ªo化猪油 us ª搅拌
混匀后加水至 tss °ow ε 保存备用 ∀
1 q2 动物分组及处理
≥⁄大鼠 uw只 o雌雄各半 o体重 uss ∗ vss ªk购
≈收稿日期  ussv2sy2vs
≈通讯作者  淳泽 ר¯ }ksu{l{xwtu|wv
自四川省中药研究所l ∀实验时将动物随机分为正
常 o高脂血症模型 o温胆汤 v个组 o后 u组给予脂肪
乳 o温胆汤组用药液灌胃 ws ª#®ªp t o模型组和空白
组用生理盐水灌胃 us °#®ªp t o每日 t次 o连续 ut
§out §后禁食给水 ty «o股静脉采血后处死 o每组随
机选取 x只取肝脏 uss ªo液氮冻存供 ⁄• °• ‘„
测定用 ∀
1 q3 试剂和材料
× ≤试剂盒k批号 susxtyl !× Š 试剂盒k批号
suswu|l购自中生北控生物科技股份有限公司 ~˜2
‘Œ±2ts 柱式总 • ‘„ 抽提纯化试剂盒 k批号
susxuzl !   ∂ 一步 • ×2°≤ • 试剂盒 k批号
susyttl购自上海生工生物工程技术有限公司 ~
³ ⁄t{2× 载体购自宝生物大连有限公司 k批号
≤Ž{stl ~°≤ • 引物由上海生工生物工程技术有限公
司合成 ~∞q¦²¯¬⁄‹xΑ由本实验室保存 ∀
1 q4 血脂测定
采用股静脉取血法 o将全血室温放置s qx«o
u sss µ#°¬±p t离心 ts °¬±o取上层血清为测试样品 o
按试剂盒说明书操作 o分别测定 × ≤ o× Š指标 ∀
1 q5 „ o°o‹测定
参照徐淑云≈v 药理学实验方法并加以改进≈w  ∀
1 q6 温胆汤对大鼠肝脏 ⁄• 基因表达影响的研
究≈x2z 
1 q6 q1 大鼠肝脏总 °• ‘„提取及纯度鉴定 从液
氮中取出样品 o迅速称取 xs °ªo液氮研磨 o样品在
#w{tt#
第 u{卷第 tu期
ussv年 tu月
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Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
∂ ²¯ qu{ oŒ¶¶∏¨ tu
⁄¨ ¦¨ °¥¨µoussv
液氮中研磨 o在液氮未挥发光前将粉末转移到 t qx
°离心管中 o保证样品未溶解 ∀用 ˜‘Œ±2ts柱式
总 • ‘„ 抽提纯化试剂盒提取大鼠肝脏总 • ‘„ o测
定 • ‘„样品含量及纯度≈{  }Αuys r Αu{s € t q{ p
u qs o说明其纯度满足分子生物学实验的要求 ∀
1 q6 q2 引物设计 在 ‘≤…Œ上查找大鼠 ⁄• 基
因序列 o同时查找选定内标 ¥¨·¤2¤¦·¬±k¥¨·¤2肌动蛋
白l基因序列 o然后用 °µ¬° µ¨°µ¬°¬¨µx 软件设计引
物 }
⁄• 上游引物为 x. „„≤ × „Š „≤ × Š≤ ×
≤≤≤ ≤≤ „ „Š„ ≤ v. k°tl
下游引物为 x. ≤ × Š ≤ Š„ × ŠŠ „× „ ≤ „≤ × ≤ „
≤ × „ ≤ × Š v. k°ul
扩增的 ¦⁄‘„序列片段长度为 vws ¥³~
¥¨·¤2¤¦·¬±上游引物为 x. ≤ „≤ × Š× Š≤≤ ≤ „×
≤ × „ × Š„ ŠŠŠ × × „ ≤ v. k…°tl
下游引物为 x. „„≤ ≤ Š≤ × ≤ „ × × Š ≤≤ Š „× „
Š× Š „× v. k…°ul
扩增的 ¦⁄‘„序列片段长度为 u{s ¥³
1 q6 q3 • ×2°≤ • 及扩增产物序列测定 在 xs ˏ
反应体系中 o °t 和 °u 或 …°t 和 …°u 各为 tss
³°²¯ o§‘×°为 u °°²¯#pt o • ×rפ´ ¬¬为 t ˏo
待测模板 u ˏovz ∗ ws ε ¦⁄‘„合成 vs °¬±o|w ε
预变性 u °¬±~°≤ • 反应 vx个循环 }|w ε 变性 vs ¶o
x{ ε 退火 vs ¶ozu ε 延伸 t °¬±~终延伸 zu ε ts
°¬±∀将扩增产物与 ³ ⁄t{2× 载体连接 o并转化感
受态大肠杆菌 o挑选重组子 o进行初步酶切鉴定后 o
对扩增片段进行序列测定k⁄‘„ 测序分析由上海生
工完成l o以证实扩增片段为目的片段 o而不是非特
异性扩增产物 ∀对全部样品 • ‘„ 用   ∂ 一步
法 • ×2°≤ • 试剂盒进行反应体系用有两对引物的
• ×2°≤ • 扩增 o并对扩增产物进行 u h琼脂糖凝胶电
泳检测ktss ∂ ovs °¬±l ∀紫外灯下照相 o并用 …¤±§2
¶¦¤±及 Œ°¤ª¨·²²¯¶软件对条带吸收度进行分析比较
将得到的数据进行统计学分析 ∀
2 结果
2 q1 温胆汤对高脂血症大鼠血清 × ≤ o× Š的影响
k见表 tl
温胆汤组与模型组比较血清 × ≤k Π  s qstl o
× Šk Π s qsxl水平显著降低 o表明温胆汤能够有效
控制高脂血症大鼠血清脂质水平 ∀
2 q2 温胆汤对高脂血症大鼠 „ o°o‹活性的
影响k见表 ul
结果表明 o高脂饲料喂食大鼠可导致大鼠肝脏
„ o°o‹酶活性降低 o温胆汤可有效升高 „ o
°酶活性 o但对 ‹活性没有显著影响 ∀
表 t 温胆汤对高脂血症大鼠血清脂质
含量的影响k ξ ? σ, ν € {l °°²¯#p t
组别 剂量rª#®ªp t × ≤ × Š
正常组 p t qys ? s qsu s qwz ? s qsuz
模型组 p { qzs ? s qxtvl s q|u ? s qs{{vl
温胆汤组 ws x qsv ? s qutul s qvs ? s qsuutl
注 }与模型组比较 tl Π s qsx ul Π s qst 与正常组比较
vlΠ s qsxk表 u ov同l
表 u 温胆汤对高脂血症大鼠肝脏 „ o°o‹
活性的影响k ξ ? σ, ν € {l °°²¯#Λªp t#«p t
组别
剂量
rª#®ªp t
„ ° ‹
正常组 p vz qzx ? t q{w tv qxv ? t qty uw quu ? t q{t
模型组 p vu qx{ ? s q{svl { q|y ? t quuvl uv qyu ? s q|zvl
温胆汤组 ws v| qzt ? u qtwul tx qwx ? t q{tul uw quy ? u qty
2 q3 温胆汤对大鼠肝脏 ⁄• 基因转录的影响
2 q3 q1 • ×2°≤ • 电泳结果 见图 t ∀从图 t可以看
出 o大鼠肝脏总 • ‘„ 经特定引物扩增后得到
⁄• o基因部分片段大小约为 vws ¥³o¥¨·¤2¤¦·¬±基
因部分片段大小约为 u{s ¥³o与预期长度相同 o说明
扩增到的片段可能为目的片段 ∀
图 t • ×2°≤ • 电泳结果
t q标计 ⁄usss u q…¤·¤2¤¦·¬± °• ‘„ • ×2°≤ • 扩增片段ku{s ¥³l
v q⁄• #°• ‘„ • ×2°≤ • 扩增片段kvws ¥³l
2 q3 q2 重组子鉴定电泳结果 见图 u ∀u ov泳道分
别为转化子 tf k含 ⁄• 基因片段插入的转化子l !
uf k含 ¥¨·¤2¤¦·¬±基因片段插入的转化子l经 ‹¬±§¶
和 …¤°‹ ´双酶切结果 o经双酶切后 o分别得到大小
约为 vws ¥³和 u{s ¥³的片段 o与预期结果相符 ∀w o
x泳道分别为转化子 tf ouf电泳结果 ∀说明转化子
tf和 uf应该分别为含 ⁄• 基因片段和 ¥¨·¤2¤¦·¬±
基因片段的重组质粒 ∀
#x{tt#
第 u{卷第 tu期
ussv年 tu月
中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
∂ ²¯ qu{ oŒ¶¶∏¨ tu
⁄¨ ¦¨ °¥¨µoussv
图 u 酶切电泳结果
t q标计 }⁄usss u q…¤±‹ ´r‹¬±§¯ µ前切 t f v q…¤±‹ ´r‹¬§¯ µ前
切 u f w q重组质粒 t f x q重组质粒 u f
2 q3 q3 测序结果 ⁄• 扩增片段序列 }„„≤ × „
Š„≤ × Š≤ × ≤≤≤≤≤ „„Š„≤ Š× Š≤ × ≤≤≤ × ŠŠ„× Š„
Š× × ≤≤ Š≤ × Š≤≤ „ŠŠ„× ŠŠ≤ „„Š× Š≤ „× ≤ × ≤≤≤
ŠŠ≤ „Š× × × Š× Š× Š× Š„≤≤ „„Š„≤ × ŠŠŠ„× × Š≤
≤ × ŠŠ„× ŠŠ≤ × ≤ × Š„≤ Š„ŠŠ≤≤≤ „≤ × Š× Š≤ ŠŠ≤
≤ „≤≤ „≤ × × Š× ŠŠ≤≤≤ × Š≤ × ≤ „≤ × × ≤≤ Š≤ × Š≤ „„
≤ × ≤≤ × ≤ × × ≤≤ × Š≤ „× ≤≤≤≤ „Š≤≤ × Š× ŠŠŠ≤≤ × Š
≤ Š„≤ ŠŠŠŠ„≤≤ ŠŠŠ„≤ × Š× Š„≤ Š„× ŠŠ≤ × ≤≤ Š
„× Š„Š× ŠŠ≤≤ Š≤ „Š„„≤ × Š≤ ŠŠŠŠ≤≤ Š„„Š„
≤ „≤ ŠŠ≤≤ Š≤ × Š„ŠŠ× ŠŠ× ≤ „Š≤ „Š≤≤≤≤ × Š≤ × ≤
≤ × ≤≤≤ × ≤ Š„Š× × ≤≤ „≤ × Š× ŠŠ≤ „Š× „Š× Š„Š
¥¨·¤2¤¦·¬±扩增片段序列 }≤ „≤ × Š× Š≤≤≤ „
× ≤ × „× Š„ŠŠŠ× × „≤ Š≤ Š≤ × ≤≤≤ × ≤ „× Š≤≤ „× ≤
≤ × Š≤ Š× ≤ × ŠŠ„≤≤ × ŠŠ≤ × ŠŠ≤≤ ŠŠŠ„≤≤ × Š„≤
„Š„≤ × „≤ Š× ≤ „× Š„„Š„× ≤≤ × Š„≤≤ Š„Š≤ Š× Š
Š≤ × „≤ „Š≤ × × ≤ „≤≤ „≤≤ „≤ „Š≤ × Š„Š„ŠŠŠ„„
„× ≤ Š× Š≤ Š× Š„≤ „× × „× „Š„Š„„Š≤ × Š× Š≤ × „
× Š„× Š≤≤≤ × „Š„≤ × × ≤ Š„Š≤ „„Š„Š„× ŠŠ≤≤ „
≤ × Š≤≤ Š≤ „× ≤≤ × ≤ × × ≤≤ × ≤ Š≤ × ŠŠ„Š„„Š„Š≤
× „× Š„Š≤ × Š≤≤ × Š„≤ ŠŠ× ≤ „ŠŠ× ≤ „× ≤ „≤ × „×
≤ ŠŠ≤„„× Š„Š≤ ŠŠ×
与原序列对比结果显示 o⁄• 扩增片段测序
结果与 ‘≤…Œ上报道的完全相同 o¥¨·¤2¤¦·¬± 扩增片
段的测序结果有一个碱基与 ‘≤…Œ上报道的不同 ∀
该差异可能为测序过程中引入的错误 o因此可以认
为扩增到的片段为目的基因 ∀
2 q3 q4 ⁄• 基因表达差异结果 见图 v ∀
从图 v可以看出 o双引物扩增出的条带大小与
预期结果相同k§¯µ基因扩增片段小 vws ³o¥¨·¤2
¤¦·¬±基因扩增片段大小为 u{s ¥³l ∀
图 v 酶切鉴定电泳结果
t q标记 ⁄usss u ov q温胆汤组 w ox q高脂模型组 y oz q正常对照组
表 v ⁄• 条带吸收度r¥¨·¤2¤¦·¬±条带吸收度值k ξ ? σ, ν € xl
组别 比值 统计结果
正常对照组 s qxytu s qx{v| s qxxwz s qx|yv s qxzu{ s qxzvu ? s qsvz
高脂模型组 s qvw{w s qvz{{ s qwsu| s qwsv| s qv{zw s qv{zy ? s qsxtvl
温胆汤组 s qxwx{ s qxvut s qxs{{ s qxt|y s qxuy| s qxut| ? s qsw{tl
§¯µ基因扩增条带吸收度与 ¥¨·¤2¤¦·¬±基因扩增条
带吸收度的比值见表 v ∀
从表 v可以看出正常对照组和温胆汤组 ⁄•
°• ‘„水平显著高于高脂模型组k Π s qsxl o提示
温胆汤能防止大鼠肝 ⁄• 基因表达下降 ∀
3 讨论
祖国医学认为 o高脂血症属于中医/痰湿 !浊阻0
范畴 o其发病机理为脾虚 !运化功能失常 !津液运行
不利 o湿聚为痰 o痰浊滞留体内 o酿成本病 ∀高脂膳
食会引起肝脏总脂解酶 !脂蛋白脂酶和肝脂酶活性
的降低 o造成代谢紊乱 o引发高脂血症 ∀本实验结果
表明 o温胆汤能有效降低高脂血症大鼠血清甘油三
酯和总胆固醇水平 o并证实这是由于温胆汤提高了
肝脏总脂解酶 !脂蛋白脂酶的活性 o从而加速体内甘
油三酯的清除 ∀为了更进一步探讨温胆汤的调节脂
质代谢的作用机理 o笔者从分子水平观察了温胆汤
对高脂模型大鼠低密度脂蛋白受体基因表达的影
响 ∀研究结果表明 o高脂模型大鼠肝细胞 ⁄• °• 2
‘„表达水平与正常组相比明显降低 o而温胆汤可使
高脂模型大鼠肝细胞的 ⁄• °• ‘„ 表达水平明显
提高 ∀低密度脂蛋白受体结合摄取低密度脂蛋白的
数量随着编码细胞膜上低密度脂蛋白受体数目的增
#y{tt#
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加而随之增多 o最终使血浆低密度脂蛋白的浓度降
低 ∀
肝脏是低密度脂蛋白受体较为密集的器官 ∀肝
脏 ⁄• 表达的变化决定并反映血清胆固醇的代
谢 ∀ ⁄通过携带的 „³²…tss的 „³²∞与肝细胞表
面的 ⁄• 结合 o结果被细胞内吞分解成氨基酸和
游离胆固醇 ∀游离胆固醇可以抑制羟甲戊二酸单酰
辅酶 „k‹  Š2≤²„l还原酶活性以减少细胞内合成
胆固醇≈|  ~或抑制内质网脂酰胆固醇酰基转移酶 o有
利于胆固醇被酯化成胆固醇酯 ~或抑制了通常以膜
蛋白的形式存在于内质网膜上胆固醇调节元件结合
蛋白k≥• ∞…°l前体切割位点 t的活性 o使 ≥• ∞…°前
体不能被切割 o不能与内质网膜解离进入核内与
⁄• 基因 x. 端胆固醇调节元件结合 o从而抑制
≥• ∞2t转录因子活性 o使肝细胞 ⁄• °• ‘„ 水平
降低≈ts  ∀本研究证实高脂模型大鼠肝脏细胞 ⁄•
的 °• ‘„ 表达明显受到抑制 o说明胆固醇调节
⁄• 表达的负反馈机制在起作用 ∀温胆汤调节
⁄• 表达很可能是其通过某种途径改变了肝细胞
内胆固醇的分布 o其确切机制还不清楚 o仍有待进一
步的研究 ∀
≈参考文献 
≈t   ¤¯®²±¨ ±  qƒ¤¬¯∏µ¨ ²© ׫¼µ²¬§ ‹²µ°²±¨ ¶·² ¤¬±·¤¬±·«¨ ‘²µ2
°¤¯ ¬³²³µ²·¨¬± °¤··¨µ± ¬± • ¤·¶¤©·¨µ • ¨°²√¤¯ ²©·«¨ °¬¦·∏¬·¤µ¼
Š¯ ¤±§q „·«¨ µ²¶¦¯ µ¨²¶¬¶ot|{| ov{ }tut q
≈u  …µ²º±  ≥ o Š²¯§¶·¨¬±  q „ • ¦¨¨³·²µ2° §¨¬¤·¨§ °¤·«º¤¼ ©²µ
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≈ts  ≥²µ¦¬2׫²°¤¶  o ‹ ±¨§µ¬¦®¶ ≤ o Ž¨¤µ²¶  • q ‹ ³¨Šu ≤¨¯¯
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Μολεχυλαρ Μεχηανισµ οφ Ωενδαν Τανγ ιν Πρεϖεντιον
οφ Λιπιδ Μεταβολισµ ∆ισορδερ ιν Αδυλτ Ρατσ
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¤§∏¯·µ¤·¶q Μετηοδ : ’±·«¨ ¥¤¶¬¶²©«¼³¨ µ¯¬³¬§¨ °¬¤µ¤·°²§¨ ¶¯o·µ¬ª¯¼¦¨µ¬§¨¶k× Šl o·²·¤¯ ¦«²¯ ¶¨·¨µ²¯ k× ≤l ¬± ¶¨µ∏° o¤¦·¬√¬·¬¨¶²© ¬¯2
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ª¤·¨§ut §¤¼¶¤©·¨µ·«¨ ©¨ §¨¬±ª²©¤·«¨µ²ª¨ ±¬¦§¬¨·qΡεσυλτ : • ±¨§¤± פ±ª¶¬ª±¬©¬¦¤±·¯¼ µ¨§∏¦¨§·«¨ ¶¨µ∏° × Š o× ≤ ¤±§¬±¦µ¨¤¶¨§·«¨
¤¦·¬√¬·¼ ²©°¤±§„ o¥∏·¦¤∏¶¨§±²¦«¤±ª¬± ‹q ׫¨ µ¨¶∏¯·²© • ×2°≤ • ·¨¶·¶«²º §¨·«¤·«¬ª«©¤·¤±§«¬ª«¦«²¯ ¶¨·¨µ²¯ ©¨ §¨¬±ª
¦²∏¯§¶¬ª±¬©¬¦¤±·¯¼¬±§∏¦¨ ·«¨ µ¨§∏¦·¬²± ²©⁄• °• ‘„ ¯¨ √¨¯¶o º«¬¯¨ • ±¨§¤± פ±ª¦²∏¯§¬±¦µ¨¤¶¨ «¨ ³¤·¬¦⁄• §¨ ±¶¬·¼ qΧονχλυ2
σιον : • ±¨§¤± פ±ª¦¤± ³µ¨√ ±¨·§¬¶²µ§¨µ²© ¬¯³¬§ ° ·¨¤¥²¯¬¶° ¥¼ µ¨ª∏¯¤·¬±ª × ≤ o × Š o⁄2¦·«µ²∏ª«∏³µ¨ª¤∏¯¤·¬²± ²© ⁄• ·µ¤±2
¶¦µ¬³·¬²± ¯¨ √¨¯ ¤±§¬°³µ²√¬±ª¤±·¬²¬¬§¤±·¤¥¬¯¬·¼ q
[ Κεψ ωορδσ] • ±¨§¤± פ±ª~·²·¤¯ ¦«²¯ ¶¨·¨µ²¯ k× ≤l ~·µ¬ª¯¼¦¨µ¬§¨¶k× Šl ~⁄• ~ • ×2°≤ •
≈责任编辑 古云侠 
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第 u{卷第 tu期
ussv年 tu月
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Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
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