全 文 :温胆汤对高脂血症大鼠脂质代谢的影响
淳 泽t ov o李佳楠t o陈东辉u o罗 霞u o程耀锋t o杨志荣t
kt q四川大学 生命科学学院 o四川 成都 ytssyw ~u q四川省中药研究所 o四川 成都 ytsswt ~
v q中国科学院 成都生物研究所 o四川 成都 ytsswtl
≈摘要 目的 }探讨温胆汤对高脂血症大鼠低密度脂蛋白受体基因表达的影响 ∀方法 }在建立大鼠高脂血症
模型基础上 o观察温胆汤对大鼠血脂水平 !总脂解酶kl !脂蛋白脂酶k°l和肝脂酶kl活性以及肝脏低密度
脂蛋白受体k⁄ l基因表达的影响 ∀结果 }温胆汤能显著抑制高脂模型大鼠血清总胆固醇k× ≤l !血清总甘油三
酯k× l浓度 o提高 °和 活性 o但对 活性无明显影响 ~逆转录聚合酶链反应k ×2°≤ l实验显示高脂模型
大鼠肝脏 ⁄ ° 表达降低 o温胆汤能显著上调高脂血症大鼠肝脏 ⁄ ° 水平 ∀结论 }温胆汤可能通
过调节大鼠肝脏 ⁄ 转录水平预防脂质代谢紊乱 ∀
≈关键词 温胆汤 ~血清总胆固醇 ~血清总甘油三酯 ~低密度脂蛋白受体 ~反转录聚合酶链反应
≈中图分类号 u{x qx ≈文献标识码 ≈文章编号 tsst2xvsukussvltu2tt{v2sw
高脂血症是临床多发病 !常见病 o也是动脉粥样
硬化 !冠心病的主要危险因素之一 o近来医学界对其
治疗极为重视≈t ∀人血中 zs h的胆固醇由低密度
脂蛋白k⁄l和极低密度脂蛋白k∂ ⁄l携带 ∀循
环中约 zx h ⁄由肝脏清除 o其中 |s h是由低密
度脂蛋白受体k⁄ l途径清除的 ∀ ²¯§¶·¨¬± 和
µ²º±也证实家族性高脂血症与 ⁄ 密切相关 o
⁄ 是体内清除胆固醇的主要途径≈u ∀本实验选
用 ≥⁄大鼠高脂造模加药物干预 o旨从分子水平观
察温胆汤对高脂血症大鼠低密度脂蛋白受体基因表
达的影响 o以期探讨该药的降脂作用机理 ∀
1 材料与方法
1 q1 药物
温胆汤源于5三因极一病证方论6 o由半夏 y ªo
竹茹 y ªo枳实 y ªo陈皮 | ªo茯苓 x ªo甘草 v ª组成 ∀
药材洗净后以 ts倍量水煎 t qx «o倒出水煎液 o再以
x倍水煎 t «o合并水煎液于水浴挥发浓缩成每毫升
u ª生药 ow ε 保存备用 ∀
脂肪乳 }胆固醇 ts ªo丙二醇 us °o三号胆盐 u
ªo山梨醇甲酯 us °o丙赛优 t ªo化猪油 us ª搅拌
混匀后加水至 tss °ow ε 保存备用 ∀
1 q2 动物分组及处理
≥⁄大鼠 uw只 o雌雄各半 o体重 uss ∗ vss ªk购
≈收稿日期 ussv2sy2vs
≈通讯作者 淳泽 ר¯ }ksu{l{xwtu|wv
自四川省中药研究所l ∀实验时将动物随机分为正
常 o高脂血症模型 o温胆汤 v个组 o后 u组给予脂肪
乳 o温胆汤组用药液灌胃 ws ª#®ªp t o模型组和空白
组用生理盐水灌胃 us °#®ªp t o每日 t次 o连续 ut
§out §后禁食给水 ty «o股静脉采血后处死 o每组随
机选取 x只取肝脏 uss ªo液氮冻存供 ⁄ °
测定用 ∀
1 q3 试剂和材料
× ≤试剂盒k批号 susxtyl !× 试剂盒k批号
suswu|l购自中生北控生物科技股份有限公司 ~2
±2ts 柱式总 抽提纯化试剂盒 k批号
susxuzl ! ∂ 一步 ×2°≤ 试剂盒 k批号
susyttl购自上海生工生物工程技术有限公司 ~
³ ⁄t{2× 载体购自宝生物大连有限公司 k批号
≤{stl ~°≤ 引物由上海生工生物工程技术有限公
司合成 ~∞q¦²¯¬⁄xΑ由本实验室保存 ∀
1 q4 血脂测定
采用股静脉取血法 o将全血室温放置s qx«o
u sss µ#°¬±p t离心 ts °¬±o取上层血清为测试样品 o
按试剂盒说明书操作 o分别测定 × ≤ o× 指标 ∀
1 q5 o°o测定
参照徐淑云≈v 药理学实验方法并加以改进≈w ∀
1 q6 温胆汤对大鼠肝脏 ⁄ 基因表达影响的研
究≈x2z
1 q6 q1 大鼠肝脏总 ° 提取及纯度鉴定 从液
氮中取出样品 o迅速称取 xs °ªo液氮研磨 o样品在
#w{tt#
第 u{卷第 tu期
ussv年 tu月
中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
∂ ²¯ qu{ o¶¶∏¨ tu
⁄¨ ¦¨ °¥¨µoussv
液氮中研磨 o在液氮未挥发光前将粉末转移到 t qx
°离心管中 o保证样品未溶解 ∀用 ±2ts柱式
总 抽提纯化试剂盒提取大鼠肝脏总 o测
定 样品含量及纯度≈{ }Αuys r Αu{s t q{ p
u qs o说明其纯度满足分子生物学实验的要求 ∀
1 q6 q2 引物设计 在 ≤
上查找大鼠 ⁄ 基
因序列 o同时查找选定内标 ¥¨·¤2¤¦·¬±k¥¨·¤2肌动蛋
白l基因序列 o然后用 °µ¬° µ¨°µ¬°¬¨µx 软件设计引
物 }
⁄ 上游引物为 x. ≤ × ≤ × ≤ ×
≤≤≤ ≤≤ ≤ v. k°tl
下游引物为 x. ≤ × ≤ × × ≤ ≤ × ≤
≤ × ≤ × v. k°ul
扩增的 ¦⁄序列片段长度为 vws ¥³~
¥¨·¤2¤¦·¬±上游引物为 x. ≤ ≤ × × ≤≤ ≤ ×
≤ × × × × ≤ v. k
°tl
下游引物为 x. ≤ ≤ ≤ × ≤ × × ≤≤ ×
× × v. k
°ul
扩增的 ¦⁄序列片段长度为 u{s ¥³
1 q6 q3 ×2°≤ 及扩增产物序列测定 在 xs Λ
反应体系中 o °t 和 °u 或
°t 和
°u 各为 tss
³°²¯ o§×°为 u °°²¯#pt o ×rפ´ ¬¬为 t Λo
待测模板 u Λovz ∗ ws ε ¦⁄合成 vs °¬±o|w ε
预变性 u °¬±~°≤ 反应 vx个循环 }|w ε 变性 vs ¶o
x{ ε 退火 vs ¶ozu ε 延伸 t °¬±~终延伸 zu ε ts
°¬±∀将扩增产物与 ³ ⁄t{2× 载体连接 o并转化感
受态大肠杆菌 o挑选重组子 o进行初步酶切鉴定后 o
对扩增片段进行序列测定k⁄ 测序分析由上海生
工完成l o以证实扩增片段为目的片段 o而不是非特
异性扩增产物 ∀对全部样品 用 ∂ 一步
法 ×2°≤ 试剂盒进行反应体系用有两对引物的
×2°≤ 扩增 o并对扩增产物进行 u h琼脂糖凝胶电
泳检测ktss ∂ ovs °¬±l ∀紫外灯下照相 o并用
¤±§2
¶¦¤±及 °¤ª¨·²²¯¶软件对条带吸收度进行分析比较
将得到的数据进行统计学分析 ∀
2 结果
2 q1 温胆汤对高脂血症大鼠血清 × ≤ o× 的影响
k见表 tl
温胆汤组与模型组比较血清 × ≤k Π s qstl o
× k Π s qsxl水平显著降低 o表明温胆汤能够有效
控制高脂血症大鼠血清脂质水平 ∀
2 q2 温胆汤对高脂血症大鼠 o°o活性的
影响k见表 ul
结果表明 o高脂饲料喂食大鼠可导致大鼠肝脏
o°o酶活性降低 o温胆汤可有效升高 o
°酶活性 o但对 活性没有显著影响 ∀
表 t 温胆汤对高脂血症大鼠血清脂质
含量的影响k ξ ? σ, ν {l °°²¯#p t
组别 剂量rª#®ªp t × ≤ ×
正常组 p t qys ? s qsu s qwz ? s qsuz
模型组 p { qzs ? s qxtvl s q|u ? s qs{{vl
温胆汤组 ws x qsv ? s qutul s qvs ? s qsuutl
注 }与模型组比较 tl Π s qsx ul Π s qst 与正常组比较
vlΠ s qsxk表 u ov同l
表 u 温胆汤对高脂血症大鼠肝脏 o°o
活性的影响k ξ ? σ, ν {l °°²¯#Λªp t#«p t
组别
剂量
rª#®ªp t
°
正常组 p vz qzx ? t q{w tv qxv ? t qty uw quu ? t q{t
模型组 p vu qx{ ? s q{svl { q|y ? t quuvl uv qyu ? s q|zvl
温胆汤组 ws v| qzt ? u qtwul tx qwx ? t q{tul uw quy ? u qty
2 q3 温胆汤对大鼠肝脏 ⁄ 基因转录的影响
2 q3 q1 ×2°≤ 电泳结果 见图 t ∀从图 t可以看
出 o大鼠肝脏总 经特定引物扩增后得到
⁄ o基因部分片段大小约为 vws ¥³o¥¨·¤2¤¦·¬±基
因部分片段大小约为 u{s ¥³o与预期长度相同 o说明
扩增到的片段可能为目的片段 ∀
图 t ×2°≤ 电泳结果
t q标计 ⁄usss u q
¤·¤2¤¦·¬± ° ×2°≤ 扩增片段ku{s ¥³l
v q⁄ #° ×2°≤ 扩增片段kvws ¥³l
2 q3 q2 重组子鉴定电泳结果 见图 u ∀u ov泳道分
别为转化子 tf k含 ⁄ 基因片段插入的转化子l !
uf k含 ¥¨·¤2¤¦·¬±基因片段插入的转化子l经 ¬±§¶
和
¤° ´双酶切结果 o经双酶切后 o分别得到大小
约为 vws ¥³和 u{s ¥³的片段 o与预期结果相符 ∀w o
x泳道分别为转化子 tf ouf电泳结果 ∀说明转化子
tf和 uf应该分别为含 ⁄ 基因片段和 ¥¨·¤2¤¦·¬±
基因片段的重组质粒 ∀
#x{tt#
第 u{卷第 tu期
ussv年 tu月
中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
∂ ²¯ qu{ o¶¶∏¨ tu
⁄¨ ¦¨ °¥¨µoussv
图 u 酶切电泳结果
t q标计 }⁄usss u q
¤± ´r¬±§¯ µ前切 t f v q
¤± ´r¬§¯ µ前
切 u f w q重组质粒 t f x q重组质粒 u f
2 q3 q3 测序结果 ⁄ 扩增片段序列 }≤ ×
≤ × ≤ × ≤≤≤≤≤ ≤ × ≤ × ≤≤≤ × ×
× × ≤≤ ≤ × ≤≤ × ≤ × ≤ × ≤ × ≤≤≤
≤ × × × × × × ≤≤ ≤ × × × ≤
≤ × × ≤ × ≤ × ≤ ≤≤≤ ≤ × × ≤ ≤
≤ ≤≤ ≤ × × × ≤≤≤ × ≤ × ≤ ≤ × × ≤≤ ≤ × ≤
≤ × ≤≤ × ≤ × × ≤≤ × ≤ × ≤≤≤≤ ≤≤ × × ≤≤ ×
≤ ≤ ≤≤ ≤ × × ≤ × ≤ × ≤≤
× × ≤≤ ≤ ≤ × ≤ ≤≤
≤ ≤ ≤≤ ≤ × × × ≤ ≤ ≤≤≤≤ × ≤ × ≤
≤ × ≤≤≤ × ≤ × × ≤≤ ≤ × × ≤ × ×
¥¨·¤2¤¦·¬±扩增片段序列 }≤ ≤ × × ≤≤≤
× ≤ × × × × ≤ ≤ ≤ × ≤≤≤ × ≤ × ≤≤ × ≤
≤ × ≤ × ≤ × ≤≤ × ≤ × ≤≤ ≤≤ × ≤
≤ × ≤ × ≤ × × ≤≤ × ≤≤ ≤ ×
≤ × ≤ ≤ × × ≤ ≤≤ ≤≤ ≤ ≤ ×
× ≤ × ≤ × ≤ × × × ≤ × × ≤ ×
× × ≤≤≤ × ≤ × × ≤ ≤ × ≤≤
≤ × ≤≤ ≤ × ≤≤ × ≤ × × ≤≤ × ≤ ≤ × ≤
× × ≤ × ≤≤ × ≤ × ≤ × ≤ × ≤ ≤ × ×
≤ ≤× ≤ ×
与原序列对比结果显示 o⁄ 扩增片段测序
结果与 ≤
上报道的完全相同 o¥¨·¤2¤¦·¬± 扩增片
段的测序结果有一个碱基与 ≤
上报道的不同 ∀
该差异可能为测序过程中引入的错误 o因此可以认
为扩增到的片段为目的基因 ∀
2 q3 q4 ⁄ 基因表达差异结果 见图 v ∀
从图 v可以看出 o双引物扩增出的条带大小与
预期结果相同k§¯µ基因扩增片段小 vws ³o¥¨·¤2
¤¦·¬±基因扩增片段大小为 u{s ¥³l ∀
图 v 酶切鉴定电泳结果
t q标记 ⁄usss u ov q温胆汤组 w ox q高脂模型组 y oz q正常对照组
表 v ⁄ 条带吸收度r¥¨·¤2¤¦·¬±条带吸收度值k ξ ? σ, ν xl
组别 比值 统计结果
正常对照组 s qxytu s qx{v| s qxxwz s qx|yv s qxzu{ s qxzvu ? s qsvz
高脂模型组 s qvw{w s qvz{{ s qwsu| s qwsv| s qv{zw s qv{zy ? s qsxtvl
温胆汤组 s qxwx{ s qxvut s qxs{{ s qxt|y s qxuy| s qxut| ? s qsw{tl
§¯µ基因扩增条带吸收度与 ¥¨·¤2¤¦·¬±基因扩增条
带吸收度的比值见表 v ∀
从表 v可以看出正常对照组和温胆汤组 ⁄
° 水平显著高于高脂模型组k Π s qsxl o提示
温胆汤能防止大鼠肝 ⁄ 基因表达下降 ∀
3 讨论
祖国医学认为 o高脂血症属于中医/痰湿 !浊阻0
范畴 o其发病机理为脾虚 !运化功能失常 !津液运行
不利 o湿聚为痰 o痰浊滞留体内 o酿成本病 ∀高脂膳
食会引起肝脏总脂解酶 !脂蛋白脂酶和肝脂酶活性
的降低 o造成代谢紊乱 o引发高脂血症 ∀本实验结果
表明 o温胆汤能有效降低高脂血症大鼠血清甘油三
酯和总胆固醇水平 o并证实这是由于温胆汤提高了
肝脏总脂解酶 !脂蛋白脂酶的活性 o从而加速体内甘
油三酯的清除 ∀为了更进一步探讨温胆汤的调节脂
质代谢的作用机理 o笔者从分子水平观察了温胆汤
对高脂模型大鼠低密度脂蛋白受体基因表达的影
响 ∀研究结果表明 o高脂模型大鼠肝细胞 ⁄ ° 2
表达水平与正常组相比明显降低 o而温胆汤可使
高脂模型大鼠肝细胞的 ⁄ ° 表达水平明显
提高 ∀低密度脂蛋白受体结合摄取低密度脂蛋白的
数量随着编码细胞膜上低密度脂蛋白受体数目的增
#y{tt#
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∂ ²¯ qu{ o¶¶∏¨ tu
⁄¨ ¦¨ °¥¨µoussv
加而随之增多 o最终使血浆低密度脂蛋白的浓度降
低 ∀
肝脏是低密度脂蛋白受体较为密集的器官 ∀肝
脏 ⁄ 表达的变化决定并反映血清胆固醇的代
谢 ∀ ⁄通过携带的 ³²
tss的 ³²∞与肝细胞表
面的 ⁄ 结合 o结果被细胞内吞分解成氨基酸和
游离胆固醇 ∀游离胆固醇可以抑制羟甲戊二酸单酰
辅酶 k 2≤²l还原酶活性以减少细胞内合成
胆固醇≈| ~或抑制内质网脂酰胆固醇酰基转移酶 o有
利于胆固醇被酯化成胆固醇酯 ~或抑制了通常以膜
蛋白的形式存在于内质网膜上胆固醇调节元件结合
蛋白k≥ ∞
°l前体切割位点 t的活性 o使 ≥ ∞
°前
体不能被切割 o不能与内质网膜解离进入核内与
⁄ 基因 x. 端胆固醇调节元件结合 o从而抑制
≥ ∞2t转录因子活性 o使肝细胞 ⁄ ° 水平
降低≈ts ∀本研究证实高脂模型大鼠肝脏细胞 ⁄
的 ° 表达明显受到抑制 o说明胆固醇调节
⁄ 表达的负反馈机制在起作用 ∀温胆汤调节
⁄ 表达很可能是其通过某种途径改变了肝细胞
内胆固醇的分布 o其确切机制还不清楚 o仍有待进一
步的研究 ∀
≈参考文献
≈t ¤¯®²±¨ ± qƒ¤¬¯∏µ¨ ²© ׫¼µ²¬§ ²µ°²±¨ ¶·² ¤¬±·¤¬±·«¨ ²µ2
°¤¯ ¬³²³µ²·¨¬± °¤··¨µ± ¬± ¤·¶¤©·¨µ ¨°²√¤¯ ²©·«¨ °¬¦·∏¬·¤µ¼
¯ ¤±§q ·«¨ µ²¶¦¯ µ¨²¶¬¶ot|{| ov{ }tut q
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µ²º± ≥ o ²¯§¶·¨¬± q ¦¨¨³·²µ2° §¨¬¤·¨§ °¤·«º¤¼ ©²µ
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≤«²¯ ¶¨·¨µ²¯ ²° ²¨¶·¤¶¬¶q≥¦¬¨±¦¨ ot|{y ouvu }vw q
≈ts ≥²µ¦¬2׫²°¤¶ o ±¨§µ¬¦®¶ ≤ o ¨¤µ²¶ • q ³¨u ≤¨¯¯
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¤±§ ∞ ¬± ¶¨³²±¶¨ ·² ⁄²¦²¶¤¥¨ ¬¤¨ ±²¬¦ ¦¬§¤±§ ≤«²¯ ¶¨·¨µ²¯ q
¬³¬§ ¶¨ot||u ovvk{l }ttwz q
Μολεχυλαρ Μεχηανισµ οφ Ωενδαν Τανγ ιν Πρεϖεντιον
οφ Λιπιδ Μεταβολισµ ∆ισορδερ ιν Αδυλτ Ρατσ
≤ «¨ t o¬¤2¯ ¤±t o ≤ ∞ ⁄²±ª2«∏¬u o ÷¬¤u o ≠ «¬2µ²±ªt
kt q≥¬¦«∏¤± ±¬√ µ¨¶¬·¼ o≤«¨ ±ª§∏ytssyw o≥¬¦«∏¤±o≤«¬±¤~
u q≥¬¦«∏¤± ±¶·¬·∏·¨ ²© ≤«¬±¨ ¶¨ ¤·¨µ¬¤ §¨¬¦¤o≤«¨ ±ª§∏oytsswt o≥¬¦«∏¤±o≤«¬±¤~
v q≤«¨ ±ª§∏±¶·¬·∏·¨ ²©
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[ Αβστραχτ] Οβϕεχτιϖε: ײ ¨¯∏¦¬§¤·¨ ·«¨ °²¯ ¦¨∏¯¤µ ° ¦¨«¤±¬¶° ²© • ±¨§¤± פ±ª¬± ³µ¨√ ±¨·¬²± ²© ¬¯³¬§ ° ·¨¤¥²¯¬¶° §¬¶²µ§¨µ¬±
¤§∏¯·µ¤·¶q Μετηοδ : ±·«¨ ¥¤¶¬¶²©«¼³¨ µ¯¬³¬§¨ °¬¤µ¤·°²§¨ ¶¯o·µ¬ª¯¼¦¨µ¬§¨¶k× l o·²·¤¯ ¦«²¯ ¶¨·¨µ²¯ k× ≤l ¬± ¶¨µ∏° o¤¦·¬√¬·¬¨¶²© ¬¯2
³¤¶¨ kl o ¬¯³²³µ²·¨¬± ¬¯³¤¶¨ k°l o«¨ ³¤·¬¦¯¬³¤¶¨ kl¬± ¬¯√ µ¨o³¤µ·¶²©«¨ °²ªµ¤° ¤±§«¨ ³¤·¬¦⁄ ° ¯¨ √¨¯¶º µ¨¨ ¬±√ ¶¨·¬2
ª¤·¨§ut §¤¼¶¤©·¨µ·«¨ ©¨ §¨¬±ª²©¤·«¨µ²ª¨ ±¬¦§¬¨·qΡεσυλτ : • ±¨§¤± פ±ª¶¬ª±¬©¬¦¤±·¯¼ µ¨§∏¦¨§·«¨ ¶¨µ∏° × o× ≤ ¤±§¬±¦µ¨¤¶¨§·«¨
¤¦·¬√¬·¼ ²©°¤±§ o¥∏·¦¤∏¶¨§±²¦«¤±ª¬± q ׫¨ µ¨¶∏¯·²© ×2°≤ ·¨¶·¶«²º §¨·«¤·«¬ª«©¤·¤±§«¬ª«¦«²¯ ¶¨·¨µ²¯ ©¨ §¨¬±ª
¦²∏¯§¶¬ª±¬©¬¦¤±·¯¼¬±§∏¦¨ ·«¨ µ¨§∏¦·¬²± ²©⁄ ° ¯¨ √¨¯¶o º«¬¯¨ • ±¨§¤± פ±ª¦²∏¯§¬±¦µ¨¤¶¨ «¨ ³¤·¬¦⁄ §¨ ±¶¬·¼ qΧονχλυ2
σιον : • ±¨§¤± פ±ª¦¤± ³µ¨√ ±¨·§¬¶²µ§¨µ²© ¬¯³¬§ ° ·¨¤¥²¯¬¶° ¥¼ µ¨ª∏¯¤·¬±ª × ≤ o × o⁄2¦·«µ²∏ª«∏³µ¨ª¤∏¯¤·¬²± ²© ⁄ ·µ¤±2
¶¦µ¬³·¬²± ¯¨ √¨¯ ¤±§¬°³µ²√¬±ª¤±·¬²¬¬§¤±·¤¥¬¯¬·¼ q
[ Κεψ ωορδσ] • ±¨§¤± פ±ª~·²·¤¯ ¦«²¯ ¶¨·¨µ²¯ k× ≤l ~·µ¬ª¯¼¦¨µ¬§¨¶k× l ~⁄ ~ ×2°≤
≈责任编辑 古云侠
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