全 文 ：≈收稿日期  ussw2sy2tx
≈通讯作者  3 池岛乔 oר¯ }ksuwluv{wwwyv o∞2°¤¬¯}¬®¨­¬°¤·ƒ
√¬³1¶¬±¤1¦²°
土槿皮乙酸体外诱导 „vzx2≥u细胞凋亡
龚显峰t ou o王敏伟u o田代真一v o小野寺敏v o池岛乔t 3
kt1 沈阳药科大学 中日医药研究所 o辽宁 沈阳 ottssty ~
u1 沈阳药科大学 Š°中心 o辽宁 沈阳 ottssty ~
v1 昭和药科大学 病态科学教研室 o东京 t|w2{xwv o日本l
≈摘要  目的 }研究土槿皮乙酸k³¶¨∏§²¯¤µ¬¦¤¦¬§ …l诱导 „vzx2≥u细胞凋亡的作用 o探讨其抗癌作用机制 ∀方
法 }采用噻唑蓝k××l法 !形态学观察 !⁄‘„凝胶电泳及 • ¶¨·¨µ± ¥¯²·检测法 ∀结果 }土槿皮乙酸可剂量2时间依赖性
的诱导 „vzx2≥u细胞凋亡 ox Λ°²¯#pt土槿皮乙酸处理 vy «的细胞 o‹²¨ ¦«¶·vvux{荧光染色后有明显的凋亡小体出
现 ~凝胶电泳法显示有明显的 ⁄‘„ ¤¯§§¨µ出现 ∀细胞内抑制凋亡蛋白 …¦¯2u o…¦¯2¬和 ¦¤¶³¤¶¨ 激活的 ⁄‘„酶抑制物
kŒ≤„⁄l表达量时间依赖性地减少 o而促凋亡蛋白 …¤¬表达量增加 ∀结论 }土槿皮乙酸对 „vzx2≥u细胞的杀伤作用主
要通过诱导细胞凋亡 o降低 …¦¯2u o…¦¯2¬和 Œ≤„⁄蛋白的表达 o增加 …¤¬蛋白表达为其诱发 „vzx2≥u细胞凋亡的机制
之一 ∀
≈关键词  土槿皮乙酸 ~„vzx2≥u细胞 ~凋亡
≈中图分类号  • u{x1x ≈文献标识码  „ ≈文章编号  tsst2xvsukussxlst2ssxx2sv
土荆皮是松科植物金钱松 Πσευδολαριξ καεµπφερι
Š²µ§1的根皮 o土槿皮乙酸k³¶¨∏§²¯¤µ¬¦¤¦¬§…l为其主
要有效成分 ∀近年的研究表明土槿皮乙酸有抗真
菌≈t  !抗生育≈u2w  !抗癌作用≈x2z  ∀作者应用 ××法 !
荧光染色法 !⁄‘„ 电泳 !蛋白质电泳观察土槿皮乙
酸体外抑制 „vzx2≥u细胞增殖作用 o为探讨土槿皮
乙酸的抗癌作用提供实验依据 ∀
1 材料与方法
111 药物与试剂 土槿皮乙酸购自中国药品生物
制品检定所k北京l o分子量 }wvu1x o批号 s{{s2||st ∀
• °Œ2tyws培养基k‹¼¦¯²±¨ l o胎牛血清k北京元亨圣
马生物试剂公司l o甲基噻唑蓝 ×× k „°µ¨¶¦²l o
‹²¨ ¦«¶·vvux{ k≥¬ª°¤l ∀ …¤¬和 ¦¤¶³¤¶¨ 激活的 ⁄‘„
酶抑制物kŒ≤„⁄l多克隆抗兔抗体 !…¦¯2u和 …¦¯2¬多
克隆抗鼠抗体 !辣根过氧化酶标记的羊抗兔 !羊抗鼠
二抗均购于 ≥¤±·¤ ≤µ∏½ …¬²·¨¦«±²¯²ª¼公司 ∀
112 细胞系及细胞培养 „vzx2≥u细胞株购于美国
„°¨ µ¬¦¤± ×¼³¨ ≤∏¯·∏µ¨ ≤²¯¯¨ ¦·¬²± k „×≤≤ o f ≤• o
t{zu o⁄o˜≥„l ∀细胞单层接种在含 ts h 胎牛血
清 ou °°²¯#pt谷氨酰胺的 • °Œ2tyws培养液中 o在
饱和湿度 o温度为 vz ε o≤’u浓度为 x h的培养箱中
培养 ∀
113 细胞生长抑制 x ≅ tsw#°pt „vzx2≥u细胞 o
接种于 |y孔培养板 o每孔 tss ˏ∀培养 tu «o分别
加入土槿皮乙酸 o浓度为 s1{ ∗ tss Λ°²¯ #pt o培养
tu ouw ovy ow{ «o每孔加入 ×× tx ˏkx ª#ptl o继续
培养 w «后 o弃上清 o每孔加入 txs ˏ二甲基亚砜溶
解 o酶标仪 w|u ±°检测 o绘制时效及量效曲线 ∀
114 细胞形态学变化观察 将细胞接种于培养瓶
中 o至细胞进入对数生长期后 o加入浓度为 s ox Λ°²¯
#pt的土槿皮乙酸 o培养 vy «o收集细胞用 °…≥洗 t
次 ou xss µ#°¬±pt室温离心 x °¬±o以 tss ˏv1z h多
聚甲醛重悬细胞 o固定 vs °¬±∀u xss µ#°¬±pt离心 x
°¬±o弃上清 o以 °…≥洗 t次 o加入 tss ˏ°…≥重悬细
胞 o取 ts ˏ细胞悬液 o加入 u ˏ‹²¨ ¦«¶·vvux{kt
°°²¯#ptl使其终浓度为 tyz Λ°²¯#pt ovz ε 染色
ts °¬±o荧光显微镜下观察 ∀
115 ⁄‘„提取和 ⁄‘„梯状化分析 收集 t ≅ tsy个
以上细胞 ou xssµ#°¬±pt离心 ts °¬±o以 °…≥洗 u次 o
tss ˏ细胞裂解液kts °°²¯#pt ×µ¬¶2‹≤¯ ³‹ z1w ots
°°²¯#pt ∞⁄ׄ o s1x h ×µ¬·²± ÷2tsslw ε 裂解 ts
°¬±oty sss µ#°¬±pt离心 us °¬±o收集上清 o加入 us
°ª#°pt • ‘¤¶¨ „ u ˏovz ε 温育 t «o再加入 us °ª
#°pt °µ²·¨¬±¤¶¨ Žu ˏovz ε 温育 t «o最后加入 x
xx
第 vs卷第 t期
ussx年 t月
中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
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¤±∏¤µ¼oussx
°²¯#pt ‘¤≤¯ us ˏ!异丙醇 tus ˏop us ε 过夜 ∀
ty sss µ#°¬±pt离心 us °¬±o收集沉淀 o以 ×µ¬¶2∞⁄ׄ
缓冲液k³‹ z1xl溶解 ∀提出的 ⁄‘„ 用 u h 琼脂糖
凝胶在 tss ∂ 下电泳 t «o以 s1x Λª#°pt溴化乙锭
染色 tx °¬±o以蒸馏水洗 vs °¬±o凝胶自动成像系统
拍照 ∀
116 • ¶¨·¨µ± ¥¯²·分析蛋白质的表达 收集 x ≅ tsy
个以上细胞 ou xss µ#°¬±pt离心 ts °¬±o°…≥洗 u次 o
tss ˏ细胞裂解液kxs °°²¯#pt ‹∞°∞≥ ot h ×µ¬·²±2
tss otss °°²¯ #pt ‘¤ƒ ot °°²¯ #pt ∞⁄ׄ ot °°²¯ #
pt ∞Š×„ ou °°²¯#pt正钒酸钠 ot °°²¯#pt °≥ƒ o
ts °ª#°pt °¨ ³¶·¤·¬± „l于冰上裂解 t «oty sss µ#
°¬±pt离心 x °¬±o收集上清 ∀加入 us ˏ上样缓冲液
kuxs °°²¯ #pt ×µ¬¶2‹≤¯ ³‹y1{ ots h ≥⁄≥ oxs h 甘
油 os1x h 溴酚蓝 ox h 二巯基乙醇l o沸水中煮 v
°¬±o使蛋白变性 ∀每个点样孔加样 tx ˏ样品液 o
tu h ≥⁄≥2聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白质 ∀凝胶上的
蛋白带转移到硝酸纤维素膜上 o封闭液封闭膜上的
蛋白结合位点 u «∀加入抗 …¤¬o…¦¯2u o…¦¯2¬和 Œ2
≤„⁄的抗体k一抗l及辣根酶标记的二抗 o显色 ∀
2 结果
211 土槿皮乙酸对 „vzx2≥u细胞的生长抑制作用
不同浓度土槿皮乙酸ks1{ ∗ tss Λ°²¯#ptl作用于
细胞后不同时间 o对 „vzx2≥u细胞的细胞毒作用呈
明显的时间和剂量依赖性k图 tl ∀
图 t 土槿皮乙酸对 „vzx2≥u细胞的生长
抑制作用kcξ ? σ, ν € vl
212 土槿皮乙酸诱导细胞死亡的形态学变化 荧
光显微镜下观察 o正常细胞全部蓝染 o细胞壁完整
k见图 u„l o土槿皮乙酸 x Λ°²¯ #pt作用细胞 vy «
后 o细胞内有凋亡小体形成 k见图 u…箭头所示l o是
细胞发生凋亡的典型形态 ∀
213 细胞凋亡的 ⁄‘„ 片段化分析 图 v所示 o不
同剂量的土槿皮乙酸作用 vy «后 o可诱导 „vzx2≥u
细胞发生明显的 ⁄‘„梯状片段化 o即诱导细胞发生
凋亡 ∀
图 u 土槿皮乙酸诱导 „vzx2≥u细胞凋亡的形态学变化
„1对照 ~…1 土槿皮乙酸kx Λ°²¯#ptl作用 vy «
图 v 土槿皮乙酸诱导 „vzx2≥u细胞 ⁄‘„梯状片段化
1 标示物kuss ∗ usss ¥³l ~¤2 1¨土槿皮乙酸ks ot1u ou1x o
x ots Λ°²¯#ptl处理 vy «
214 土槿皮乙酸对蛋白表达的影响 在 x Λ°²¯ #
pt土槿皮乙酸作用不同时间后 o…¦¯2u o…¦¯2¬和 Œ2
≤„⁄的表达下降 o而 …¤¬的表达增加 k图 w ox l ∀
图 w 土槿皮乙酸对 …¦¯2u o…¦¯2¬和 …¤¬蛋白表达的影响
图 x 土槿皮乙酸对 Œ≤„⁄蛋白表达的影响
3 讨论
细胞凋亡是受特定基因调控的主动性细胞自我
消亡的过程 o具有独特的形态和生化特征 o包括细胞
体积缩小 o连接消失 o核质浓缩 o核膜核仁破碎 o⁄‘„
降解成为约 t{s ∗ uss ¥³片段 o胞膜有小泡状形成 o
最终形成凋亡小体≈{  ∀
…¦¯2u家族主要包括 …¦¯2u o…¤¬o…¦¯2¬等≈|  ∀其
中 …¦¯2u及 …¦¯2¬抑制细胞凋亡 o而 …¤¬则促进凋
亡≈ts  ∀…¦¯2u家族内部成员之间可形成同源或异源
二聚体 o这种二聚体反应可以调节细胞的死亡和存
活 ∀ …¦¯2ur…¤¬的比例可决定细胞的命运 o其比例增
yx
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Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
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高 o细胞不易发生凋亡 o而比例降低则导致细胞凋
亡 ∀ „vzx2≥u细胞经土槿皮乙酸处理后 o…¤¬蛋白表
达增加 o…¦¯2u o…¦¯2¬的表达减少 o…¦¯2ur…¤¬的比例
降低 o细胞发生凋亡 ∀
在正常细胞中 o¦¤¶³¤¶¨ 激活的 ⁄‘„ 酶k¦¤¶³¤¶¨
¤¦·¬√¤·¨§⁄‘¤¶¨ o≤„⁄l以非活性形式与其抑制物 Œ2
≤„⁄结合形成复合物≈tt  ∀细胞凋亡时 o激活 ¦¤¶2
³¤¶¨ o活化的 ¦¤¶³¤¶¨ 可裂解 Œ≤„⁄而释放 ≤„⁄o≤„⁄
进入细胞核内发挥 ⁄‘„酶的作用 ∀本实验表明 o在
土槿皮乙酸的作用下 oŒ≤„⁄的蛋白表达随作用时间
的延长而减少 o说明土槿皮乙酸诱导 „vzx2≥u细胞
死亡过程中有 ¦¤¶³¤¶¨ 参与 ∀
综上所述 o土槿皮乙酸可通过下调 Œ≤„⁄蛋白
的表达和降低 …¦¯2ur…¤¬的比例诱导 „vzx2≥u细胞
凋亡 ∀
≈参考文献 
≈t  ¬∞o≤ ¤¯µ® „  o ‹∏©©²µ§ ≤ ⁄1 „±·¬©∏±ª¤¯ √¨¤¯∏¤·¬²± ²©³¶¨∏§²¯¤µ¬¦
¤¦¬§…o¤ °¤­²µ¦²±¶·¬·∏¨±·²© Πσευδολαριξ καεµπφερι1 ϑ Νατ Προδ o
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§²¯¤µ¬¦¤¦¬§…1 Αχτα Πηαρµ Σιν ot|{u ov kvl }t{{1
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¦¼2·¨µ°¬±¤·¬±ª ©¨©¨¦·¤±§·²¬¬¦¬·¼ ¥¨·º¨¨ ± ³¶¨∏§²¯¤µ¬¦¤¦¬§¶„ ¤±§…1
Αχτα Πηαρµ Σιν ot|{{ o| kxl }wwx1
≈w  «¤±ª ≠ o∏ •  o ≠¤± „ 1 Œ±«¬¥¬·¬²± ²© ²√¤©¨µ·¬¯¬½¤¥¬¯¬·¼ ¥¼
³¶¨∏§²¯¤µ¬¦¤¦¬§…¬± «¤°¶·¨µ1 Αχτα Πηαρµ Σιν ot||s ott ktl }ys1
≈x  °¤± ⁄o¬ o‹∏≤ ± o ετ αλ1 ׫¨ ¦¼·²·²¬¬¦³µ¬±¦¬³¯ ¶¨²© Πσευ2
δολαριξ καεµπφερι } °¶¨∏§²¯¤µ¬¦ „¦¬§2„ ¤±§ … ¤±§ • ¨¯¤·¨§ ⁄¨µ¬√¤2
·¬√ ¶¨1 Πλαντα Μεδ ot||s oxy kwl }v{v1
≈y  张 敏 o买 霞 o陈小义 o等 1土槿皮乙酸体外诱导 Žxyu细胞
凋亡的研究 1 中草药 oussu ovv kyl }xvv1
≈z  姜孟臣 o陈 虹 o张 敏 o等 1 土槿皮乙酸对人黑素瘤细胞增
殖抑制作用研究 1 中草药 oussv ovw kyl }xvu1
≈{  Ž¨µµƒ • o • ¼¯ ¬¯¨ „ ‹ o≤∏µµ¬¨ „ • 1 „³²³·²¶¬¶}¤¥¤¶¬¦¥¬²¯²ª¬¦¤¯
³«¨ ±²°¨ ±²± º¬·« º¬§¨2µ¤±ª¬±ª¬°³¯¬¦¤·¬²±¶¬± ·¬¶¶∏¨ ®¬±¨ ·¬¦¶1 Βρ ϑ
Χανχερot|zu ouy kwl ~uv|1
≈|  ¦⁄²±±¨ ¯¯ × o…¨ «¤° „ o≥¤µ®¬¶¶ oετ αλ1 Œ°³²·¤±¦¨ ²©·«¨ …¦¯2u
©¤°¬¯¼ ¬± ¦¨¯¯ §¨¤·« µ¨ª∏¯¤·¬²±1 Εξπεριεντια o t||y o xu kts2ttl }
tss{1
≈ts  ≠¬± ≤ oŽ∏±§²¶²± ≤  oŽ²µ¶° ¼¨¨ µ≥ o ετ αλ1 …¤¬¶∏³³µ¨¶¶¨¶²©·∏2
°²µª¨ ±¨ ¶¬¶¤±§¶·¬°∏¯¤·¨¶¤³²³·²¶¬¶ ιν ϖιϖο1 Νατυρε o t||z o v{x
kyytzl }yvz1
≈tt  ¤¶¤·²∞±¤µ¬o‹¬§¨®¬≥¤®¤«¬µ¤o‹¬§¨®¬≠²®²¼¤°¤o ετ αλ1 „ ¦¤¶³¤¶¨2
¤¦·¬√¤·¨§⁄‘¤¶¨ ·«¤·§¨ªµ¤§¨¶⁄‘„ §∏µ¬±ª¤³²³·²¶¬¶¤±§¬·¶¬±«¬¥¬·¬²µ
Œ≤„⁄1 Νατυρε ot||{ ov|t kyyyul }wv1
Πσευδολαριχ αχιδ Β ινδυχεσ ηυµαν µελανοµα Αvzx2Σu χελλ αποπτοσισ ιν ϖιτρο
Š’‘Š ÷¬¤±2©¨ ±ªtou o • „‘Š ¬±2º ¬¨u oׄ≥‹Œ• ’ ≥«¬±2¬¦«¬v o ’‘’⁄∞• „ ≥¤·²¶«¬v oŒŽ∞Œ„ פ®¤¶«¬t
(t1 Χηινα2ϑαπαν Ρεσεαρχη Ινστιτυτε οφ Μεδιχαλ ανδ Πηαρµαχευτιχαλ Σχιενχεσ , Σηενψανγ Πηαρµαχευτιχαλ
Υνιϖερσιτψ, Σηενψανγ ttssty , Χηινα ;
u1 ΓΛΠ Χεντερ, Σηενψανγ Πηαρµαχευτιχαλ Υνιϖερσιτψ, Σηενψανγ ttssty , Χηινα ;
v1 ∆επαρτµεντ οφ Χλινιχαλ ανδ Βιοµεδιχαλ Σχιενχεσ , Σηοωα Πηαρµαχευτιχαλ Υνιϖερσιτψ; Τοκψο t|w{xwv , ϑαπαν)
[ Αβστραχτ] Οβϕεχτιϖε : ײ¶·∏§¼·«¨ ° ¦¨«¤±¬¶°¶²©³¶¨∏§²¯¤µ¬¦¤¦¬§…2¬±§∏¦¨§¤³²³·²¶¬¶²± „vzx2≥u ¦¨¯¯¶1 Μετηοδ : ×× o©¯∏²µ¨¶2
¦¨±¦¨ °¬¦µ²¶¦²³¨ ²¥¶¨µ√¤·¬²±o ⁄‘„ ¤ª¤µ²¶¨ ª¨¯ ¨¯ ¦¨·µ²³«²µ¨¶¬¶¤±§ • ¶¨·¨µ± ¥¯²·¤±¤¯¼¶¬¶º µ¨¨ ∏¶¨§1 Ρεσυλτ : °¶¨∏§²¯¤µ¬¦¤¦¬§ … ¬±§∏¦¨¶
„vzx2≥u ¦¨¯¯ ¤³²³·²¶¬¶¬±¤·¬°¨¤±§§²¶¨2§¨ ³¨ ±§¨ ±·°¤±±¨ µ1 „³²³·²·¬¦¥²§¬¨¶¤±§⁄‘„ ¤¯§§¨µº µ¨¨ ²¥¶¨µ√ §¨¬±x Λ°²¯#pt ³¶¨∏§²¯¤µ¬¦¤¦¬§
…2·µ¨¤·¨§ „vzx2≥u ¦¨¯¯¶©²µvy «1 ׫¨ ¬¨³µ¨¶¶¬²± ²©…¦¯2u o…¦¯2¬¤±§Œ≤„⁄ º¤¶µ¨§∏¦¨§·¬°¨§¨ ³¨ ±§¨ ±·¯¼ oº«¨µ¨¤¶·«¨ ¬¨³µ¨¶¶¬²± ²©…¤¬º¤¶
¬±¦µ¨¤¶¨§1 Χονχλυσιον : ׫¨ °¤­²µ¦¤∏¶¨ ²©³¶¨∏§²¯¤µ¬¦¤¦¬§…¬±§∏¦¨§¦¼·²·²¬¬¦¬·¼ ²± „vzx2≥u ¦¨¯¯¶º¤¶¤³²³·²¶¬¶1 ¬·²¦«²±§µ¬¤³µ²·¨¬±¶¤±§
Œ≤„⁄ °¬ª«·¥¨ ¬±√²¯√ §¨¬±·«¨ ¤³²³·²·¬¦³¤·«º¤¼¶²©³¶¨∏§²¯¤µ¬¦¤¦¬§…2·µ¨¤·¨§„vzx2≥u ¦¨¯¯¶1
[ Κεψ ωορδσ] ³¶¨∏§²¯¤µ¬¦¤¦¬§…~„vzx2≥u ¦¨¯¯ ~¤³²³·²¶¬¶ ≈责任编辑 方文贤 
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