全 文 ：2016 年 2 月 第 18 卷 第 2 期 中国现代中药 Mod Chin Med Feb. 2016 Vol. 18 No. 2
·基础研究·
△［基金项目］ 国家自然科学基金(81301416) ;吉林省科技厅重点科技攻关项目(20140204004YY) ;国家博士后基金
(2014M561302)
*［通信作者］ 胡冬华，副教授，研究方向:药物化学和肿瘤分子药理学，Tel: (0431)86045208，E-mail:hudonghua8888@
126. com;于静华，医师，研究方向:肿瘤分子药理学和病毒学，Tel: (0431)88783235，E-mail:yjh-0-2002@
163. com
土槿皮乙酸抗肝癌机制研究
△
钟婷1，薛变变2，王增艳3，王莹2，刘春禹4，于静华5* ，胡冬华1*
(1. 长春中医药大学 药学院 药物化学教研室，吉林 长春 130000;
2. 吉林大学 白求恩第一医院 胃肠内科，吉林 长春 130000;
3. 吉林大学 白求恩第一医院 呼吸内科，吉林 长春 130000;
4. 长春中医药大学 附属医院 针灸科，吉林 长春 130000;
5. 吉林大学 白求恩第一医院 艾滋病与病毒研究所，吉林 长春 130000)
［摘要］ 目的:在细胞水平研究土槿皮乙酸(PAB)抗人肝癌细胞(HepG2)的机制。方法:以 4 μmol·L －1 PAB
分别处理 12、24、36、48 h后，通过细胞计数法确定 PAB的抑制率;通过细胞形态学观察确定 PAB 是否诱导细胞
死亡;划痕实验观察 PAB对肝癌细胞转移的影响;荧光染色法检测 PAB 处理后 HepG2 细胞中微管聚集情况;Ｒeal-
time PCＲ检测 PAB对 P53 基因转录的影响;Western blot 检测相关蛋白表达。结果:PAB 时间依赖性地抑制 HepG2
细胞的生长，并且诱导 HepG2 细胞的死亡;有效降低肝癌细胞的转移;促进细胞骨架蛋白聚集;降低 P53 基因转
录，并调控 P53 蛋白和 P27 蛋白表达。结论:PAB对体外培养的 HepG2 细胞生长有明显的抑制作用，并且通过调控
微管分布来抑制细胞转移。
［关键词］ 土槿皮乙酸;人肝癌 HepG2 细胞;细胞增殖;细胞转移
Anti-tumor Effect of Pseudolaric Acid B on Hepatocellular Carcinoma HepG2 Cell Line
ZHONG Ting1，XUE Bianbian2，WANG Zengyan3，WANG Ying2，LIU Chunyu4，YU Jinghua5* ，HU Donghua1*
(1. Medicinal Chemistry，College of Pharmacy，Changchun University of Chinese Medicine，Changchun 130021，China
2. Department of Gastroenterology，The First Hospital of Jilin University，Changchun 130021，China
3. Department of Internal Medicine，The First Hospital of Jilin University，Changchun 130000，China
4. Acupuncture department，The affiliated hospital to Changchun University of Chinese Medicine，Changchun 130021，China
5. Ｒesearch Institute of virology and AIDS research，The first hospital of Jilin University，Changchun 130021，China)
［Abstract］ Objective:The aim of this study was to investigate the anti-tumour role of pseudolaric acid B(PAB)on
hepatocellular carcinoma HepG2. Methods:Cell counting analysis confirmed the inhibitory ratio of PAB. The morphological
changes were observed by phase contrast microscopy. Scratch test was applied for cell immigration. Phalloidin –
Tetramethylrhodamine B isothiocyanate staining was performed for tubulin polymerization. Ｒeal time PCＲ detected the p53
transcription. Western blot was used for protein expression. Ｒesults:The inhibitory role of PAB was in time dependent
manner. PAB treatment induced the cell death. Cell immigration was inhibited by PAB treatment. Intervening α-tubulin
polymerization was visualized after PAB treatment. Ｒeal-time PCＲ test confirmed that PAB treatment inhibited the transcription
of p53 gene. And western blot analysis found that PAB regulated the expression of P53 and P27 protein. Conclusion:Therefore
PAB had anti-tumor effect on HepG2 through various mechanisms.
［Keywords］ Pseudolaric acid B(PAB) ;hepatocellular carcinoma HepG2;cell proliferation;cell immigration
doi:10． 13313 / j． issn． 1673-4890． 2016． 2． 005
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2016 年 2 月 第 18 卷 第 2 期 中国现代中药 Mod Chin Med Feb. 2016 Vol. 18 No. 2
据报道，肝癌容易复发并且转移率高。目前，
临床上抗肝癌复发与转移的治疗措施主要有放射介
入、全身化疗，由于患者大多有慢性肝病背景，任
何一种放疗、化疗方案都伴有明显的不良反应。所
以中药在抑制肿瘤细胞增殖、稳定瘤体生长、改善
症状体征、减毒增效、预防复发、提高生存质量、
延长生存期等方面具有独特的优势。
土槿皮为松科植物金钱松的干燥根皮或近根树
皮，土槿皮乙酸(Pseudolaric acid B，PAB)是从土槿
皮中分离得到的新型二萜酸化合物。有研究表明土
槿皮乙酸具有抗肿瘤［1-4］、抗血管生成［5］、抗微
管［6-7］等药理作用。本实验探讨土槿皮乙酸的抗肝癌
作用及其作用机制。
1 材料和方法
1. 1 材料
土槿皮乙酸(PAB)购于中国食品药品检定研究
院，应用时用二甲基亚砜(DMSO)溶解，并使 DMSO
的终浓度低于 0. 01%。胎牛血清购自北京元亨圣马生
物试剂公司;DAPI、Phalloidin-Tetramethylrhodamine B
isothiocyanate、二甲基亚砜(DMSO)为 Sigma 公司产
品;Trizol reagent和 Glycogen为 Invitrogen公司产品;
Anchored Oligo(dT)18、2 × ES Ｒeaction Mix、ＲNase-
free Water为北京全式金生物技术(TransGen Biotech)
有限公司产品;SYBＲ GＲEEN(ABI，USA)为 ABI 公
司产品;Histone、P53、Tubulin、P27 抗体及相应的
二抗购自 Santa Cruz Biotec公司(CA，USA) ;DMEM
培养基(Thermo Fisher Scientific，USA)。
1. 2 细胞培养
细胞单层接种在含 10%胎牛血清和 4. 0 mmol·L －1
谷氨酰胺的 DMEM 培养液中，在 37 ℃、5%二氧化
碳培养箱中培养。
2 方法
2. 1 细胞生长的抑制
取对数生长期的 HepG2 细胞接种于直径 3. 5 cm
的培养皿中。随机分为用药组和对照组，用药组培
养液中分别加入用 DMSO 溶解的 4 μmol·L －1 PAB，
对照组(Con)培养液中加入与治疗组等量的 DMSO，
再分别培养 12、24、36、48 h 后，用台盼兰染色后
立即对细胞进行计数，计算药物对肿瘤细胞的抑
制率。
2. 2 细胞形态学变化
将细胞接种于培养皿中，至细胞进入对数生长
期后，加入 4 μmol·L －1 PAB，培养 12、24、36、
48 h后在显微镜下观察细胞形态的变化。
2. 3 细胞骨架的变化
对 HepG2 细胞进行爬片培养，然后换为终浓度
为 4 μmol·L －1的 PAB 培养液培养，并设对照，置
CO2 培养箱中分别孵育 12、24、36、48 h 后，将爬
片好的细胞用 4%多聚甲醛固定细胞 10 min，PBS洗
5 min，0. 8% TritonX-100 穿孔 15 min，PBS洗两次，
加入 5 μg·mL －1的 Phalloidin-Tetramethylrhodamine B
isothiocyanate对其进行细胞骨架染色 40 min，PBS漂
洗多次，每次 5 min，DAPI 染色 15 min，封片剂封
片后在荧光显微镜下观察细胞骨架的变化。
2. 4 Ｒeal-time PCＲ
收集 PAB(4 μmol·L －1)处理 12、24、36、48 h后
的 PAB组和对照组细胞，取 200 μL样品到 1. 5 mL离
心管中，加入 1 mL Trizol，用手振摇 15 s，再在室温
加入 200 μL 三氯甲烷，静置 5 min 后，12 000 g、
4 ℃离心 17 min，离心取上层水相(勿混中层沉淀) ，
加入新离心管中(事先加入 1 μL Glycogen) ，再加入
0. 5 mL 异丙醇(4 ℃ 预冷) ，摇匀， － 20℃ 静置
30 min，12 000 g、4 ℃离心 10 min，弃上清液，加
入 4 ℃预冷的 75%乙醇水溶液 1 mL，7500 g、4 ℃
离心 5 min，弃上清液，待完全干燥 10 min 后加入
30 μL DEPC水溶解得到 mＲNA产物。再根据反转录
试剂盒使用说明书对以上所得的 mＲNA进行反转录，
反应体系的总体积为 20 μL，体系的反应条件为
42 ℃孵育 30 min，85 ℃加热 5 min 失活。最后根据
所得的产物 CDNA 进行定量 PCＲ，体系的总体积为
20 μL，每个样均重复 3 次。以上操作过程中所加试
剂及模板的量均是一致的。P53 基因的引物序列和
扩增产物的长度见表 1，反应中 GAPDH 作为内部
参照。
表 1 基因的引物序列度和产物长度
基因名称 引物序列
P53(5) GTTCCGAGAGCTGAATGAGG
P53(3) TTATGGCGGGAGGTAGACTG
GAPDH(5) GCAAATTCCATGGCACCGT
GAPDH(3) TCGCCCCACTTGATTTTGG
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2. 5 检测相关蛋白的表达
以 PAB 浓度为 4 μmol·L －1分别处理细胞 12、
24、36、48 h后，用胰酶消化收集细胞，置于冰上;
加入细胞裂解液及蛋白酶抑制剂混合液，吹打均匀，
冰上放置 5 min，加入上样 5 ×样品缓冲液混匀后于
沸水浴中煮沸 1 h。再 14 000 r·min －1、离心 5 min
后又混匀，上样，用 western blot法检测目标蛋白。
2. 6 统计分析
如无特殊提示，所有实验结果均得自 3 次独立
实验，采用 t检验进行统计分析。
3 结果
3. 1 PAB抑制 HepG2 细胞增殖
PAB(4 μmol·L －1)作用细胞 12、24、36、48 h
后，对 HepG2 细胞的细胞毒作用呈明显的时间依赖
性(图 1 A、B)。
注:A. 细胞抑制率;B. 细胞数目。
图 1 PAB抑制 HepG2 细胞增殖图
3. 2 PAB对 HepG2 细胞形态的影响
PAB(4 μmol·L －1)处理细胞以后，观察到正常
对照组(Con)细胞形态正常完整，细胞连接紧密，
有较少数细胞死亡;而 PAB 组细胞数目明显减少，
浮起变圆，出现细胞死亡，见图 2。
注:Bar = 15 μm。
图 2 PAB对 HepG2 细胞形态的影响
3. 3 PAB抑制肝癌细胞的转移
PAB作用 12、24、36、48 h 后，对照组细胞间
划痕随着时间的迁移消失，而 PAB 组划痕依然存
在。所以 PAB 抑制肝癌 HepG2 细胞的迁移，见
图 3。
注:表示划痕宽度。
图 3 PAB抑制 HepG2 细胞的转移情况
3. 4 PAB对肝癌细胞 Tubulin的影响
对照组细胞生长密集，细胞呈梭形、三角形、
或不规则形;胞核圆形或椭圆形、核膜完整、界限
清晰;胞质密度高、不透明、胞膜连续;红色的微
管蛋白均匀分布。而经 PAB 处理后的实验组细胞稀
疏、形态不规则;微管蛋白(红色荧光)聚集在胞核
周，并聚集成束状，而细胞周的微管蛋白表达显少
(荧光淡)、透明度高。从 DAPI 细胞核染色可明显
看到，与对照组相比，PAB 处理后实验组的细胞出
现了较多的双核、甚至多核细胞，见图 4。
3. 5 PAB对 P53 基因转录的影响
在 PAB处理 12、24、48 h时，4 μmol·L －1 PAB
上调 P53 基因的 mＲNA水平，但在 36 h 与对照组比
较，PAB下调 P53 基因的 mＲNA水平，见图 5。
3. 6 PAB对 P53 蛋白表达的影响
从蛋白表达可以看到，4 μmol·L －1 PAB 分别作
用不同时间以后，相比于对照组，细胞中的 P53 的
表达在 12、24、36 h减少，但在 48 h时，其蛋白表
达量明显增加。P27 是 P53 蛋白下游蛋白，其与 P53
蛋白具有相同的趋势，见图 6。
4 讨论
迄今为止，对 PAB抗肿瘤机制的研究已有了很
大的进展，但对其抗肿瘤细胞增殖和转移的研究较
少，导致其还未应用于临床。因此，本课题对 PAB
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图 4 PAB对微管的影响
注:* P ＜ 0. 05，＊＊P ＜ 0. 01。
图 5 PAB对 P53 基因转录的影响
图 6 PAB处理 HepG2 细胞后不同时间点
P53 和 P27 蛋白的表达情况
抑制肿瘤增殖、抑制肿瘤细胞转移的作用及其机制
进行了初步探讨，这将为开发 PAB 为抗肿瘤药物奠
定基础。
4. 1 PAB抑制 HepG2 细胞的生长
恶性肿瘤具有无限增殖生长的特征，抑制肿瘤
细胞的快速增殖，一方面可以抑制其生长进程，另
一方面也有效地抑制肿瘤的转移(肿瘤细胞生长到一
定大小后开始转移)［8］。从细胞计数实验中，我们发
现 PAB 有效地抑制肿瘤细胞生长，其抑制率最高达
到了 95%。在 PAB 作用期间，对照组细胞迅速生
长，而 PAB 处理组细胞数目随着处理时间的延长而
减少，说明在 PAB处理过程中有细胞的死亡，而无
限增殖则说明肝癌的恶性度很高。为了验证 PAB 促
进细胞死亡这一点，我们进行了细胞形态学分析，
我们发现从 12 h 开始，PAB处理组细胞浮起变圆并
开始死亡。所以 PAB 通过诱导细胞死亡执行肿瘤抑
制作用。
4. 2 PAB抑制 HepG2 细胞转移
肿瘤细胞转移后会出现癌症细胞扩散的现象，
本来可以手术切除的肿瘤组织，却因为肿瘤细胞的
转移而无法完成，所以在评价抗肿瘤药物的时候，
抑制肿瘤细胞转移是非常重要的指标［8-9］。我们研究
发现对照组细胞转移能力强，而 PAB 可以有效抑制
肝癌细胞的转移，说明 PAB 除了通过抑制细胞增殖
来抑制细胞转移外，还可以直接抑制肿瘤细胞转移。
而肝癌的迅速转移进一步证明肝癌恶性程度高。
4. 3 PAB干预 HepG2 微管功能
微管蛋白是细胞的骨架蛋白，决定着细胞增殖、
细胞转移等细胞机能。在发现 PAB 抑制细胞增殖和
转移后，我们进一步探讨了其对细胞微管蛋白的影
响，以确定 PAB 通过干扰微管功能来影响细胞增殖
和转移。我们发现从 12 h 起，PAB 处理的细胞，微
管分布不均呈纤维状分布，并且随着时间的延长细
胞核出现多核性，所以我们得到这样的假说:PAB
毒害了微管的功能，使其没有力量来完成向两极牵
拉的细胞分裂功能来完成细胞分裂过程，进而导致
多核细胞的形成，这也是其抑制细胞增殖的原因。
同时由于微管毒性作用，细胞微管也没有足够的能
量来完成细胞移动，进而抑制细胞的转移。
4. 4 PAB对 P53 基因转录及 P53 蛋白表达的调控
P53 蛋白是细胞内重要的蛋白，其参与细胞死
亡、细胞周期、细胞转移等方面。本课题观察了
PAB 对其转录和蛋白表达的影响来进一步探讨 PAB
作用机制。我们发现 PAB 处理后增加了 P53 基因的
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2016 年 2 月 第 18 卷 第 2 期 中国现代中药 Mod Chin Med Feb. 2016 Vol. 18 No. 2
转录，尽管在 36 h有所降低。而我们在观察 P53 蛋
白表达的时候却发现在 36 h 前，PAB 处理却降低了
P53 蛋白的表达，在 48 h 时又增加 P53 蛋白表达。
同时我们观测了 P53 下游蛋白 P27 的表达，发现
P27 蛋白的表达趋势和 P53 一致。所以我们推测
PAB处理后，一致努力增加 P53 蛋白的表达，直到
48 h时得以实现。而 PAB处理后 P53 蛋白在转录水
平和蛋白水平的不一致则说明了多个因素参与了
P53 蛋白的表达。PAB从多个角度执行抗肿瘤作用，
是潜在的抗肝癌药物。
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(收稿日期 2015-04-21
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(上接第 150 页)
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