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［文章编号］ 1000-4718(2016)09-1574-05
［收稿日期］2016-04-05 ［修回日期］2016-05-30
* ［基金项目］广东省自然科学基金资助项目(No． 2015A030313128) ;广东省自然科学基金资助项目(No． 2014A030307025) ;
广州市天河区科技计划重点项目(No． 201404KW028) ;深圳市科技计划项目(No． JCYJ20150403151851068)
△ 通讯作者 Tel:020-38274637;E-mail:zslyjohn@ 163． com
土槿皮乙酸诱导脑胶质瘤细胞株 U87
阻滞于 M期并发生凋亡*
何 露1，4， 温创宇3， 王慧慧3， 杨湘玲3， 刘焕亮2，3， 李 中1，4，5△
(中山大学附属第六医院 1神经科，2检验科，3广东省胃肠病学研究所，广东 广州 510655;4中山大学中山
医学院广东省脑功能与脑疾病重点实验室，广东 广州 510080;5中山大学深圳研究院，广东 深圳 518057)
［摘 要］ 目的:通过研究土槿皮乙酸对脑胶质瘤细胞株 U87 增殖与凋亡的影响，探讨土槿皮乙酸对脑胶质
瘤的潜在应用价值。方法:用不同浓度土槿皮乙酸处理 U87 细胞，并于不同时点观察细胞形态改变;采用 MTS 法
对 U87 细胞进行细胞活力测定;采用流式细胞术和 Western blot法检测土槿皮乙酸对细胞周期的影响;采用 Anne-
xin V /PI双染流式细胞术检测细胞凋亡;利用 Western blot法检测 caspase通路相关蛋白(cleaved PAＲP、caspase-3、
procaspase-9 和 caspase-8)的变化情况。结果:土槿皮乙酸明显抑制脑胶质瘤 U87 细胞的活力，能使细胞阻滞于 M
期，并通过 caspase通路诱导细胞发生凋亡。结论:土槿皮乙酸能使脑胶质瘤细胞株 U87 细胞阻滞于 M期，并诱导
其凋亡。
［关键词］ 脑胶质瘤;土槿皮乙酸;细胞周期;细胞活力;细胞凋亡
［中图分类号］ Ｒ739. 4;Ｒ363 ［文献标志码］ A doi:10． 3969 / j． issn． 1000-4718． 2016． 09． 007
Pseudolaric acid B induces glioblastoma cell line U87 mitotic arrest and
apoptosis
HE Lu1，4，WEN Chuang-yu3，WANG Hui-hui3，YANG Xiang-ling3，LIU Huan-liang2，3，
LI Zhong1，4，5
(1Department of Neurology，2Department of Clinical Laboratory，3Guangdong Institute of Gastroenterology，The Sixth Affi-
liated Hospital of Sun Yat-sen University，Guangzhou 510655，China;4Guangdong Provincial Key Laboratory of Brain
Function and Disease，Zhongshan School of Medicine，Sun Yat-sen University，Guangzhou 510080，China;5Shenzhen Ｒe-
search Institute of Sun Yat-sen Univesity，Shenzhen 518057，China． E-mail:zslyjohn@163． com)
［ABSTＲACT］ AIM:To investigate the effects of pseudolaric acid B on the growth and apoptosis of glioblastoma
cell line U87． METHODS:The cell morphological changes were observed under inverted microscope． The cell viability
was evaluated by MTS assay． The cell cycle was analyzed by flow cytometry and Western blot． The cell apoptosis was de-
tected by flow cytometry． The changes of apoptosis-related proteins cleaved PAＲP，caspase-3，procaspase-9 and caspase-8
were determined by Western blot． ＲESULTS:Pseudolaric acid B inhibited the viability of U87 cells，arrested U87 cells in
mitosis． Apoptosis of U87 cells was induced by pseudolaric acid B． The caspase pathway was activated． CONCLUSION:
Pseudolaric acid B induces glioblastoma cell line U87 mitotic arrest and apoptosis．
［KEY WOＲDS］ Glioblastoma;Pseudolaric acid B;Cell cycle;Cell viability;Apoptosis
脑胶质瘤是中枢神经系统(central nervous sys-
tem，CNS)常见的发生于神经外胚层的恶性肿瘤，占
颅内肿瘤的 40%左右［1-2］。脑胶质瘤传统的治疗方
案包括外科手术、放疗和化疗。由于脑胶质瘤具有
强侵袭性的特征，手术过程中很难与正常脑组织区
分，因此手术后的辅助性化疗显得非常重要。目前
临床上的一线化疗药物是替莫唑胺(temozolomide，
TMZ)，该药由于其口服给药方便以及治疗效果较
好，在脑胶质瘤化疗中占有重要的地位，然而其在用
药过程中可产生极大的耐药复发问题及不良反应
·4751· 中国病理生理杂志 Chinese Journal of Pathophysiology 2016，32(9) :1574-1578
(如减少血小板及中性粒细胞、恶心、呕吐和倦怠
等)［3-5］，大大地影响了该药治疗效果，用于治疗脑胶
质瘤的新药研究迫在眉睫。
土槿皮乙酸(pseudolaric acid B，PAB)是从来源
于松科植物金钱松的根皮和近根树皮的土槿皮提取
的重要成分之一，分子式为 C23 H28 O8
［6］。土槿皮乙
酸早期被人们用于抗真菌治疗，近年来越来越多的
研究表明土槿皮乙酸能够有效杀伤包括人肝癌、胃
癌、大肠癌、胰腺癌及大鼠恶性胶质瘤等多种肿瘤细
胞的同时却不损害正常细胞［6-7］。本研究以脑胶质
瘤 U87 细胞株为研究模型，探讨土槿皮乙酸对其增
殖和凋亡的影响，进而探讨土槿皮乙酸治疗脑胶质
瘤的潜在应用价值。
材 料 和 方 法
1 材料
脑胶质瘤 U87 细胞由本实验室保存。DMEM 培
养基和胎牛血清为 Gibco产品;土槿皮乙酸购自辰光
生物有限公司;MTS 试剂为 Promega 产品;碘化丙啶
(propidium iodide，PI)购自 BD。细胞凋亡双染(An-
nexin V /PI)检测试剂盒购自江苏凯基生物科技发展
有限公司;p-histone(Ser10)H3 抗体购自 Signalway
Antibody;抗 caspase-8、procaspase-3、cleaved caspase-3
及 PAＲP的抗体为 CST产品;抗 procaspase-9、β-actin
抗体和 HＲP标记的Ⅱ抗为 Proteintech Group产品。
2 主要方法
2. 1 细胞培养 U87 细胞用含 10%胎牛血清、1 ×
105 U /L 青霉素和 100 mg /L 链霉素的 DMEM 于 37
℃、5% CO2 饱和湿度条件下培养，实验所用的细胞
均处于对数生长期。
2. 2 细胞活力检测 用 MTS 法测细胞活力抑制情
况，设空白对照组、对照组和实验组;取对数生长期
的 U87 细胞接种于 96 孔板，对照组和实验组每孔接
种 100 μL细胞悬液，共 5 000 个细胞，空白对照组加
入 200 μL不含细胞的培养基，待细胞过夜贴壁后实
验组每孔再加入 100 μL含土槿皮乙酸培养基，使加
入终浓度为 0. 1、1、10 及 100 μmol /L，对照组加入
100 μL含血清的培养基，空白对照组不加，每组 6 个
重复孔。不同剂量的土槿皮乙酸作用 72 h后于实验
各孔分别加 MTS试剂 40 μL，37 ℃继续孵育 4 h，于
酶联免疫检测仪测定 490 nm 处各孔的吸光度(A)
值。细胞活力(%)=(A实验组 － A空白对照组)/(A对照组 －
A空白对照组) ，以浓度为横坐标，细胞活力为纵坐标绘制
土槿皮乙酸对 U87 细胞生长活力抑制率柱状图。
2. 3 流式细胞术检测细胞周期 取对数生长期细
胞接种于 6 孔板，每孔接种 2 mL 细胞悬液，共 5 ×
105 个细胞，待细胞过夜贴壁后实验组加入终浓度为
0. 5、1 及 2 μmol /L土槿皮乙酸，对照组不加药，置于
37 ℃、5% CO2 饱和湿度细胞培养箱中培养，24 h 后
收集细胞并用 75%乙醇于 4 ℃固定过夜，过夜后离
心去除固定液并用 PBS 清洗细胞 2 次，清洗后加入
PI工作液 500 μL，室温避光孵育 15 min 后于流式细
胞仪进行细胞周期检测，细胞周期结果用 BD FACS-
Canto II软件进行分析。
2. 4 Annexin V /PI 双标记法流式细胞术测定细胞
凋亡 取对数生长期细胞接种于 6 孔板，每孔接种 2
mL细胞悬液，共 5 × 105 个细胞，待细胞过夜贴壁后
实验组加入终浓度为 0. 5、1 及 2 μmol /L 土槿皮乙
酸，对照组不加药，置于 37 ℃、5% CO2、饱和湿度细
胞培养箱中培养，72 h 后收集细胞，经 PBS 清洗 2 次
后加入 500 μL binding buffer、5 μL Annexin V和 5 μL
PI。室温避光孵育 15 min 后用流式细胞仪检测细胞
凋亡。在双染流式细胞计数仪的散点图上，取右下象
限和右上象限的总和(即 Annexin V阳性细胞群)计为
凋亡细胞。实验完全按照江苏凯基生物科技发展有
限公司提供的试剂说明书进行操作，实验重复 3 次。
2. 5 Western blot法检测蛋白水平 不同浓度的土
槿皮乙酸处理 U87 细胞后收集细胞，PBS清洗细胞 3
次，然后加入蛋白裂解液充分裂解细胞提取蛋白，并
用 BCA蛋白定量法测定蛋白浓度。用 10% ～ 15%
SDS聚丙烯酰胺凝胶将蛋白进行电泳(100 ～ 130 V
恒压电泳约 90 min)，蛋白分离后 100 V恒压转膜约
120 min，5%牛奶室温封闭膜 1 h，用相应的Ⅰ抗 4 ℃
孵育膜过夜，次日将膜清洗后加入 HＲP 标记的Ⅱ抗
室温孵育 1 h，洗涤后 ECL 发光液将膜显色，暗房曝
光，使用 ImageJ软件分析条带灰度值。
3 统计学处理
数据采用均数 ± 标准差(mean ± SD)表示，用
GraphPad Prism 6. 01 软件对数据进行单因素方差分
析，均数间两两比较用 Tukey 检验，以 P ＜ 0. 05 为差
异有统计学意义。
结 果
1 PAB对 U87 细胞活力及细胞形态学的影响
PAB对 U87 细胞的生长有明显抑制作用，用不
同浓度 PAB 处理 U87 细胞，并在不同时点对细胞进
行观察拍照，当作用 24 h 时，1 μmol /L PAB 可明显
抑制 U87 的细胞生长，并使细胞出现由多边形变成
圆形、发生空泡和胞膜破碎等具有死亡特征的形态学
改变。随着时间的推进，在低浓度组也可出现该现象
·5751·
(未呈现)。PAB处理细胞 72 h后用 MTS法检测 PAB
对 U87细胞活力的影响，结果显示 PAB能够明显抑制
U87细胞活力(P ＜0. 05) ，经计算，PAB对 U87 细胞活
力半数抑制率 IC50是 1. 76 μmol /L，见图 1、2。
Figure 1． The effects of PAB on the morphological changes of
U87 cells．
图 1 PAB对 U87 细胞形态的影响
2 PAB能使 U87 细胞阻滞于M期
用不同浓度 PAB处理细胞 24 h，当 PAB 浓度达
1 μmol /L 时，U87 的 G2 /M 期的比例要明显高于对
照组(图 3) ，其中对照组 G2 /M 比例为 24%，而 1
μmol /L PAB 处理组 G2 /M比例则增加至 35. 83%，
Figure 2． The effects of PAB on the viability of U87 cells． Mean
± SD． n = 6． * P ＜ 0. 05 vs 0 μmol /L．
图 2 PAB对 U87 细胞活力的影响
说明 PAB 能使 U87 阻滞于 G2 /M 期，而该比例随着
PAB浓度的增加而增加，呈浓度依赖性。为了辨别
清楚 PAB 阻滞 U87 于 G2 期还是 M 期，我们使用
Western blot法检测经 PAB处理后 U87 细胞中 M 期
标志性蛋白 p-histone H3 的变化，结果如图 4 显示，
与对照组相比，PAB 处理后的 U87 细胞的 p-histone
H3 明显上调(P ＜ 0. 05)，说明 PAB阻滞细胞于 M期
而非 G2 期。
Figure 3． PAB induced G2 /M phase arrest in the U87 cells． Mean ± SD． n = 3．
* P ＜ 0. 05 vs 0 μmol /L．
图 3 PAB诱导 U87 阻滞于 G2 /M期
Figure 4． PAB up-regulated the protein levels of p-histone H3．
Mean ± SD． n = 3． * P ＜ 0. 05 vs 0 μmol /L．
图 4 PABs上调 p-histone H3 的蛋白表达水平
3 PAB对 U87 细胞凋亡的诱导
从图 1 和图 3 结果可以看出，随着处理浓度的
增加，PAB能够诱导 U87 细胞死亡。为了探讨 PAB
是否诱导 U87 细胞发生凋亡，我们采用 Annexin V /
PI双染流式细胞术进行检测。经不同浓度 PAB 处
理 72 h后，当 PAB 浓度达 1 μmol /L 时 U87 细胞的
凋亡率明显升高，其中对照组凋亡率为 6. 45%，而 1
μmol /L PAB 凋亡率则增加至 25． 55%，PAB 诱导
U87 细胞凋亡作用呈剂量依赖性，表明 PAB 可以诱
导 U87 细胞发生凋亡，见图 5。
4 PAB通过 caspase通路诱导 U87 细胞发生凋亡
如图 6 结果显示，用不同浓度 PAB 处理细胞 72
h，当浓度达 1 μmol /L 时，caspase 家族相关蛋白
caspase-3、caspase-9 和 caspase-8 前体减少，caspase-3
和 caspase-8 出现切割带，且作为 caspase 的下游
PAＲP 也出现相应切割带，该结果的变化呈现 PAB
·6751·
浓度依赖性。以上结果说明，PAB 可能是通过 caspase通路诱导 U87 细胞发生凋亡。
Figure 5． PAB induced the apoptosis of U87 cells． Mean ± SD． n = 3． * P ＜ 0. 05 vs 0 μmol /L．
图 5 PAB诱导 U87 细胞发生凋亡
Figure 6． The effects of PAB on the protein levels of apoptosis-related proteins cleaved PAＲP，caspase-3，procaspase-9 and caspase-
8 in the U87 cells． Mean ± SD． n = 3． * P ＜ 0. 05 vs 0 μmol /L．
图 6 PAB对 U87 凋亡相关蛋白 cleaved PAＲP、caspase-3、procaspase-9 和 caspase-8 表达的影响
讨 论
本研究选取了脑胶质瘤细胞株 U87 为研究对
象，探讨 PAB 对 U87 增殖和凋亡的作用及其相关分
子学机制。实验结果表明，PAB 能够抑制 U87 细胞
的活力，使细胞阻滞于 M期，并诱导细胞发生凋亡。
实验证实 PAB能够明显抑制 U87 细胞活力;通
过 MTS法和镜下观察，我们可以发现随着 PAB 浓度
的增加，U87 细胞的生长抑制率明显增加。已有多
篇文献报道 PAB能够作用于肿瘤细胞微管蛋白，从
而使细胞阻滞于 M 期［6，8-9］，为此，我们先用流式细
胞术和 Western blot 法检测 PAB 对 U87 细胞周期的
影响，结果显示 PAB能够使细胞阻滞于 M 期从而抑
制细胞增殖。镜下观察发现高浓度或长时间的 PAB
的处理能诱导细胞死亡，细胞周期结果显示高浓度
PAB处理细胞时 sub-G1 的出现也证实了这一现象;
细胞凋亡为药物诱导细胞死亡一种常见方式，也有
多篇文献报道 PAB 使肿瘤细胞阻滞于 M 期后诱导
细胞发生凋亡［10-11］。Annexin V /PI 双标记流式细胞
术检测结果显示 PAB 的确能诱导细胞发生凋亡，由
于凋亡发生时间较晚，有可能是发生在细胞周期阻
滞之后。另外，Western blot实验结果显示 PAB 能够
使 procaspase-3、procaspase-9 和 procaspase-8 的表达
下降，且呈浓度依赖性，另 caspase-8、caspase-3 和
·7751·
caspase-3 的下游 PAＲP 也出现呈剂量依赖性的切
割，表明 PAB激活了 caspase级联通路。上述结果说
明，PAB能够抑制 U87 细胞活力，使细胞阻滞于 M
期，这可能与 PAB 作用于肿瘤 M 期细胞微管有关;
由于肿瘤细胞增殖活跃，与正常细胞相比有更多的
细胞处于 M期，这也能部分解释为什么 PAB 在一定
浓度下能作用于肿瘤细胞却不影响正常细胞，但是
有关 PAB 对 U87 微管的作用本文并未涉及，仍需进
一步探讨;在 PAB 的作用下，U87 会发生凋亡，其发
生机制可能是通过 caspase通路进行，尽管 PAB诱导
细胞发生凋亡时间较诱导细胞发生周期阻滞时间
晚，但本文并未有直接证据说明两者的前后关系，相
关研究也需进一步进行;另外，目前 PAB对各种肿瘤
细胞均显示出了很好的抗肿瘤性，但是 PAB 的抗肿
瘤分子机制仍不是很清楚，而 PAB 抗脑胶质瘤的确
切分子机制也是未来需进一步探讨的课题。
总之，PAB能通过阻滞脑胶质瘤细胞于 M 期从
而抑制细胞增殖，并诱导细胞发生凋亡，对脑胶质瘤
具有重要的治疗前景。
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(责任编辑:卢 萍，罗 森)
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