全 文 ：#研究论文#
悬浮培养的铁皮石斛原球茎在固体培养
基上生长和分化的研究
侯丕勇 o郭顺星 3
k中国医学科学院 中国协和医科大学 药用植物研究所 o北京 tsss|wl
≈摘要  目的 }对悬浮培养的铁皮石斛原球茎在固体培养基上的生长和分化状况进行研究 o以解决原球茎转
接成活率低的问题 ∀方法 }选用不同基本培养基 !碳源 !培养基 ³‹ 和激素 o以生长鲜重和成苗数为指标 o考察原球
茎的生长和发育 ∀结果与结论 }降低固体基本培养基元素的含量有利于原球茎的生长 o但不利于原球茎的分化 ∀
‘„„ oŒ„„ oŒ…„和 Š„有利于原球茎的生长与分化 o而偏酸的培养基 ³‹ 和灭活的真菌不利于原球茎的生长与分
化 o灭活真菌容易引起原球茎的形态变异 ∀
≈关键词  铁皮石斛 ~原球茎 ~生长 ~分化
≈中图分类号  ≥ xyz ≈文献标识码  „ ≈文章编号  tsst2xvsukussxlts2szu|2sw
≈收稿日期  ussw2su2ts
≈通讯作者  3郭顺星 oר¯ }kstslyu{||zu|
铁皮石斛 ∆εδροβιυ µ χανδιδυ µ • ¤¯ 1¯ ¬¨
¬±§¯1 是5中国药典6usss年版一部收录的 x种药
用石斛之一 ∀其栖息地范围狭窄 o野外生长周期长 o
资源十分有限 o需要利用人工组织培养的方法解决
药源问题 ∀作为兰科植物 o铁皮石斛在组织培养过
程中往往产生大量的原球茎 o原球茎可以分化为幼
苗 o发育成成熟的植株≈t ou  ∀液体悬浮培养可以激
发原球茎迅速大量地增殖和分化≈v  o对于原球茎的
复壮培养有很好的作用 o同时也有利于优良品种的
单一胚系筛选 ∀另外 o采用液体和固体相结合的循
环培养的方法 o不仅可以缩短培养周期 o还可以使得
那些没有发育成植株的培养物作为接种源循环到下
一个周期中 o激发增殖和分化 o有效利用培养物 o节
约培养成本 ∀但液体培养的原球茎转到固体培养基
上的生长和分化还受很多因素的影响 o需要进一步
研究解决 ∀作者就此问题展开研究 ∀
1 材料与方法
111 材料
实验材料为悬浮培养于 yz2∂ 液体培养基的铁
皮石斛原球茎 ∀
112 方法
11211 基本固体培养基试验 培养基采用  ≥ o
tru  ≥ o全 tru  ≥ 和 yz2∂ 培养基 ∀tru  ≥ 为  ≥
培养基大量元素减半 o全 tru  ≥为  ≥培养基全部
元素减半 ∀培养基都含有 us h马铃薯提取液 n v h
蔗糖 n s1| h琼脂 o³‹ x1{ ∀
11212 碳源选择试验 分别采用蔗糖和葡萄糖 o
用量均为 v h ∀
11213 培养基 ³‹ 考察试验 培养基酸碱度采用
³‹ x1v ox1{ oy1v v个浓度 ∀
11214 激素试验 本组实验的培养基中不添加马
铃薯提取液 ∀选用的激素及其使用含量分别为 }
‘„„ oŒ…„ oŒ„„ ou ow2⁄o× oŠ„ 均为 s1x °ª#pt o
Ž× 和 …„°为 s1u °ª#p t ∀以不添加激素的培养
基为对照培养基 ∀
11215 真菌添加物试验 选用 u种从云南野生铁
皮石斛中分离的真菌 «tw和 «uw作为实验菌株 ∀菌
株接种到液体麦麸培养基中k麦麸 vs ªo葡萄糖 us
ªoª≥’w t1x ªoŽ‹u °’w t ªo蒸馏水配成 t sss
°l培养 u ∗ v周 o菌丝体和发酵液一起匀浆后 o灭
菌 o以 x h的添加量加入固体培养基中使用 ∀以没
有添加真菌的培养基为对照 o接入原球茎进行实验 ∀
11216 培养条件和实验指标的测定 除非特别指
出 o固体培养采用的基本培养基为 tru  ≥ n us h马
铃薯提取液 n v h蔗糖 n s1| h琼脂 o³‹ x1{ ∀每个
三角瓶装固体培养基 ws °o将液体悬浮培养的原
球茎接种于各种培养基 o接种量为每瓶kt1s ? s1tl
#|uz#
第 vs卷第 ts期
ussx年 x月
中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
∂ ²¯1vs oŒ¶¶∏¨ ts
¤¼ oussx
ªo每组 v个以上的重复 o培养温度为kuv ? ul ε o每
日光照 | «o培养 ts周左右时间后 o除掉培养基 o精
确测定每瓶原球茎的生长鲜重和成苗数量k长出叶
片的原球茎便记为成苗的原球茎l o用每瓶平均成苗
数量除以平均生长鲜重得出原球茎的成苗比率
k个rªl ∀然后将每瓶原球茎在 ys ∗ zs ε 下烘干 o并
测定干重 o用每瓶原球茎平均干重除以对应的平均
生长鲜重得出原球茎的干鲜重比 o以考察原球茎含
干物质的含量 ∀
2 结果
211 基本培养基对原球茎生长和分化的影响
液体悬浮培养的铁皮石斛原球茎转到不同固体
培养基上培养后 o生长和发育状况明显不同 ∀如表
t所示 o全 tru  ≥和 yz2∂ 培养基有利于原球茎的
生长 o原球茎的生长鲜重明显高于 tru  ≥培养基 o
但这 u种培养基不利于原球茎分化成苗 o其每克原
球茎成苗的个数不超过 t个 ~ ≥培养基非常不利
于原球茎的生长 o其上大部分原球茎发黄变质 o但
 ≥培养基上的部分原球茎容易分化成苗 o苗的生
长速度较快 ∀除了发生败育的  ≥培养基外 o各培
养基上生长的原球茎的干物质含量大致相同 ∀
212 碳源的影响
表 t 铁皮石斛原球茎在不同固体培养基上的生长和分化情况(hξ ? σ)
培养基 生长鲜重rªr瓶 生长干重rªr瓶 干鲜重比 成苗比率r个rª 形态特征
tru  ≥ {1{u{ ? t1zty s1wux ? s1swv s1sw{ {1s 苗小 o原球茎绿色
 ≥ u1tz{ ? s1x||tl s1sy{ ? s1ssu s1svt tu1| 苗大 o原球茎黄色
全 tru  ≥ tv1tts ? t1u{vtl s1yuy ? s1svw s1sw{ s1z 少苗 o原球茎绿色
yz2 ∂ ts1zz{ ? t1s{utl s1w|s ? s1stv s1swx s1t 少苗 o原球茎绿色
注 }tl该组鲜重与对照ktru  ≥组l进行的 τ检验有显著性差异k Π s1sxl
一般情况下 o葡萄糖有利于组织培养物的快速
生长 o而蔗糖有利于培养物次生代谢物质的积累 ∀
如表 u所示 ou种碳源对原球茎生长的影响没有明
显的差异 o蔗糖对原球茎积累干物质作用稍好 o促进
分化的作用比葡萄糖要明显 o而且 o以蔗糖为碳源的
原球茎体积较大 o比较粗壮 ∀
213 培养基 ³‹ 的影响
本实验以 ³‹ x1{为基础考察偏酸和偏碱条件
对原球茎生长和分化的影响 ∀试验所考察的 ³‹ 条
件对原球茎生长没有明显的影响 ∀但偏酸的 ³‹ 条
件不利于原球茎的进一步分化 o同时对原球茎的品
质也有不好的影响 ∀偏酸条件下的原球茎颜色发
黄 o生长较慢 o而偏碱的 ³‹ 条件下 o原球茎颜色较
绿 o形态品质较好k表 v所示l ∀
表 u 碳源对铁皮石斛原球茎生长和分化的影响(hξ ? σ)
碳源 生长鲜重rªr瓶 生长干重rªr瓶 干鲜重比 成苗比率r个rª 形态特征
葡萄糖 tt1s|y ? u1tvy s1wyw ? s1sxz s1swu y1x 苗细小 o原球茎细小
蔗糖 ts1yuw ? u1xzz s1wzw ? s1svs s1swx {1v 苗小 o原球茎粗大
表 v 不同培养基 ³‹ 对铁皮石斛原球茎生长和分化的影向(hξ ? σ)
培养基 ³‹ 生长鲜重rªr瓶 生长干重rªr瓶 干鲜重比 成苗比率r个rª 形态特征
x1v |1yyw ? u1uyz s1wsu ? s1swu s1swu x1y 苗小 o原球茎黄绿色
x1{ ts1xt{ ? u1tu{ s1wzt ? s1svz s1swx {1w 苗小 o原球茎绿色
y1v ts1wyx ? u1vzt s1wv| ? s1szv s1swu {1s 苗小 o原球茎碧绿色
214 激素对原球茎生长与分化的影响
在没有马铃薯提取液和激素的条件下k对照
组l o原球茎不能够存活 ∀同样 oŽ× 和 u ow2⁄单独
使用也不能够使原球茎生长存活 ∀有利于原球茎生
长和分化的激素有 ‘„„ oŒ…„ oŒ„„和 Š„ o其中 Š„
促进分化的作用较强 ∀而 …„°对原球茎积累干物
质有较强的促进作用 ∀文献报道在培养基中有马铃
薯提取液的情况下 o‘„„ 和 …„°对于原球茎的分
化有明显的促进作用≈w  ∀本实验单用 ‘„„ oŠ„
等 o对原球茎的分化作用也较好k见表 wl ∀
215 真菌添加物对原球茎生长与分化的影响
铁皮石斛是与真菌共生的植物 o真菌促进其
种子的萌发并与之形成菌根而促进其对营养物质
的吸收≈x  ∀本实验中 o灭活的真菌对原球茎的生
长和分化有抑制作用 o对干物质的积累有很小的
促进作用 o但真菌容易引起原球茎的变异 o原球茎
变得粗大 o呈球状 o易发生多个原球茎融合生长的
情况k见表 xl ∀
#svz#
第 vs卷第 ts期
ussx年 x月
中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
∂ ²¯1vs oŒ¶¶∏¨ ts
¤¼ oussx
表 w 激素对铁皮石斛原球茎生长和分化的影响(hξ ? σ)
激素 生长鲜重rªr瓶 生长干重rªr瓶 干鲜重比 成苗比率r个rª 形态特征
对照 p p p p p
‘„„ x1zsy ? t1|vw s1u{z ? s1s{v s1sxs ts1| 苗小 o原球茎绿色
Œ…„ y1tzv ? v1wsx s1vsx ? s1tuy s1sw| tt1z 苗小 o原球茎绿色
Ž× p p p p p
Œ„„ y1usu ? s1stv s1vv{ ? s1ssy s1sxw |1z 苗小 o原球茎有褐斑
u ow2⁄ p p p p p
× v1z{t ? s1wxv s1utt ? s1swv s1sxy t1| 苗小 o原球茎黄色
Š„ z1us| ? t1wzt s1vw{ ? s1swv s1sw{ tv1{ 苗大而细弱 o原球茎绿色
…„° w1xxz ? s1|zy s1vsw ? s1syv s1syz v1y 苗叶粗大 o原球茎绿色
表 x 真菌菌丝对铁皮石斛原球茎生长和分化的影响(hξ ? σ)
真菌添加物 生长鲜重rªr瓶 生长干重rªr瓶 干鲜重比 成苗比率r个rª 形态特征
对照 ts1vyt ? t1|xt s1wyv ? s1svy s1swx {1x 苗小 o原球茎绿色
«tw {1zvv ? t1zxstl s1wvw ? s1swx s1sxs z1u 苗小而粗 o原球茎粗大
«uw ts1tsu ? u1wvx s1wyu ? s1swy s1swy x1w 苗细小 o原球茎粗大
注 }tl该组鲜重与对照k没有真菌添加物l进行的 τ检验有显著性差异k Π s1sxl
3 讨论
本试验研究采用液体2固体循环培养法大规模
培养铁皮石斛 o考察了液体培养的原球茎组织过渡
到固体培养基上的各种条件 ∀结果显示 }利用低离
子浓度的  ≥培养基可以使得原球茎组织顺利完成
从液体培养到固体培养的过渡 ∀  ≥培养基是兰科
植物组织培养常用的培养基 ∀很多报道表明 }用
tru  ≥培养基作为基本培养基有利于原球茎的分
化≈u ow  ∀降低  ≥培养基中的元素浓度有利于铁皮
石斛原球茎的生长 o但不利于向苗的分化 o如何获得
同时有利于生长和分化的  ≥培养基的配比还应该
深入研究 ∀调节培养基的 ³‹ 和采用 ‘„„ 等生长
素以及赤霉素对原球茎的分化有促进作用 o不同的
碳源也影响原球茎的分化 ∀这些条件的引入有利于
弥补基本培养基不利于原球茎分化的缺点 o尤其是
一些植物激素对生长和分化的影响十分明显 o这些
激素的运用可以替代常用的马铃薯提取液 o避免因
马铃薯质量不稳定而造成的影响 ∀
真菌菌丝细胞壁物质往往可以导致植物停止对
氮元素的吸收等正常的生长发育程序而产生防卫反
应 o促进植物体内细胞壁加厚以及胼胝质以及植保
素等物质的合成≈y  ∀本实验中所表现的真菌对原
球茎生长和发育的抑制作用以及对干物质含量的促
进作用是正常的生理现象 ∀但真菌导致原球茎发生
形态变异的现象还少有文献的报道 o还应该对这一
特殊现象进行进一步的研究 ∀
≈参考文献 
≈t  左春芳 q黑节草的组合自培养 q植物生理学通讯 ot|{x oktl }vx q
≈u  刘瑞驹 o蒙爱东 o邓锡青 o等 q铁皮石斛试管苗快速繁殖的研
究 q药学学报 ot|{v ouvk{l }yvy q
≈v  颜昌敬 q植物组织培养手册 q上海 }上海科学技术出版社 o
t||s qv{y q
≈w  张治国 o王 黎 o刘 骅 o等 q铁皮石斛原球茎分化适宜培养
基的研究 q中国中药杂志 ot||v ot{ktl }ty q
≈x  宋经元 o郭顺星 q离体培养时真菌对铁皮石斛和金钗石斛生
长的影响 q中国医学科学院学报 ousst ouvkyl }xwz q
≈y  余叔文 q植物生理与分子生物学 q北京 }科学出版社 ot||{ q
zzs q
Στυδιεσ ον τρανσπλαντινγ συσπενσιον2χυλτυρεδ προτοχορµσ οφ
∆ενδροβιυµ χανδιδυµ οντο σολιδ χυλτυρε µεδιυµ
‹ ’ ˜ °¬2¼²±ªo Š˜’ ≥«∏±2¬¬±ª
(Ινστιτυτε οφ Μεδιχαλ Πλαντ ∆εϖελοπµεντ , Χηινεσε Αχαδε µψοφ Μεδιχινε Σχιενχε & Πεκινγ Υνιον Μεδιχινε χολλεγε , Βειϕινγ tsss|w , Χηινα)
[ Αβστραχτ] Οβϕεχτιϖε: × «¨ ¶∏¶³¨ ±¶¬²±2¦∏¯·∏µ¨§³µ²·²¦²µ°¶²© ∆ενδροβιυ µ χανδιδυ µ º µ¨¨ ·µ¤±¶³¯¤±·¨§²± ·«¨ ¶²¯¬§¦∏¯·∏µ¨
° §¨¬∏° ©²µ¶·∏§¼¬±ª·«¨ ©¤¦·²µ¶¬±©¯∏¨ ±¦¬±ª·«¨¬µ§¬©©¨ µ¨±·¬¤·¬²± ¤±§ªµ²º·«q Μετηοδ : × «¨ ªµ²º·«¤±§§¬©©¨ µ¨±·¬¤·¬²± ²©³µ²·²¦²µ°¶
#tvz#
第 vs卷第 ts期
ussx年 x月
中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
∂ ²¯1vs oŒ¶¶∏¨ ts
¤¼ oussx
º µ¨¨ §¨·¨¦·¨§ º«¨ ± §¬©©¨ µ¨±·¥¤¶¨2° §¨¬¤o³¯¤±·³«¼·²«²µ°²±¨ ¶o¦¤µ¥²«¼§µ¤·¨¶¤±§³‹ º µ¨¨ ¤³³¯¬¨§qΡεσυλτ ανδ Χονχλυσιον : × «¨ §¬2
∏¯·¨§  ≥ ° §¨¬∏° ³µ²°²·¨¶·«¨ ªµ²º·«²©³µ²·²¦²µ°¶¥∏·¬±«¬¥¬·¨ §¬©©¨ µ¨±·¬¤·¬²±q × «¨ ³«¼·²«²µ°²±¨ ‘„„ oŒ„„ oŒ…„ ¤±§ Š„ ¤µ¨
«¨ ³¯©∏¯ ·²·«¨ ªµ²º·«¤±§§¬©©¨ µ¨±·¬¤·¬²± ²©³µ²·²¦²µ°¶o«²º √¨ µ¨o·«¨ ²¯º ³‹ √¤¯∏¨¶¤±§³µ¨¶¨±¦¨ ²©¤∏·²¦¯¤√ §¨©∏±ª¬«¤√¨¶∏³³µ¨¶¶¬√¨
©¨©¨ ¦·¶²± ³µ²·²¦²µ°¶q × «¨ ©∏±ª¬¤¯¶²¬±§∏¦¨ °²µ³«²¯²ª¬¦¤¯ √¤µ¬¤·¬²± ²©³µ²·²¦²µ°¶q
[ Κεψ ωορδσ] ∆ενδροβιυ µ χανδιδυ µ ~³µ²·²¦²µ° ~ªµ²º·«~§¬©©¨ µ¨±·¬¤·¬²± ≈责任编辑 王康正 
x种习用柴胡的 Œ×≥序列鉴别
武 莹t ou 3 o刘春生t o刘玉法t o阎玉凝t
kt1 北京中医药大学 中药学院 o北京 tsstsu ~
u1 北京卫生学校 中药学科 o北京 tsssxvl
≈摘要  目的 } 用 °≤ • 扩增方法测定 x种常用柴胡的 Œ×≥序列 o为柴胡的分子鉴定提供依据 ∀方法 }分别从
x种柴胡的叶片中提取总 ⁄‘„ o以核基因组通用引物进行扩增 o扩增产物经纯化后 o用 °≤ • 产物直接测序 ∀结果 }
各样品的 Œ×≥t长度为 utw ∗ uus ¥³oŒ×≥u长度为 uvs ∗ uvt ¥³∀x种柴胡的 Œ×≥序列分别有多个特异性信息位点 ∀
结论 }Œ×≥序列可以作为柴胡分子鉴定的依据 ∀
≈关键词  柴胡 ~Œ×≥序列
≈中图分类号  • u{u1x ≈文献标识码  „ ≈文章编号  tsst2xvsukussxlts2szvu2sv
≈收稿日期  ussw2sy2st
≈通 讯 作 者   3 武 莹 o ר¯ }k sts l yvxv{{uu2txs o ∞2°¤¬¯}
¥º º¼|{xt ƒ tyv1¦²°
Œ×≥序列在被子植物中的长度变异很小 oŒ×≥t
和 Œ×≥u的长度均不足 vss ¥³o°≤ • 扩增及测序简
单易行 o特别是 °≤ • 直接测序法的诞生 o极大地推
动了 Œ×≥在被子植物科内 o尤其是近缘属间及种间
关系研究中的应用≈t  ∀
柴胡是一种多来源药材 o自古以来应用品种就
很多≈u2w  ∀虽然5中国药典6usss年版一部只规定伞
形科植物柴胡 !狭叶柴胡 u种为柴胡的正品≈x  o但市
场所出售的柴胡品种有十几种 o其中以北柴胡 !狭叶
柴胡 !竹叶柴胡 !黑柴胡 !小叶黑柴胡为主 ∀然而仅
用性状鉴别 !显微鉴别及理化鉴别方法较难清楚地
区分市场上的柴胡品种 ∀本实验旨在通过从上述 x
种柴胡植物叶片中提取 ⁄‘„ 并测定其 Œ×≥序列 o
为柴胡的分子鉴定提供依据 ∀
1 材料和方法
111 材料 柴胡 !狭叶柴胡 !黑柴胡为硅胶快速干
燥的叶片 o竹叶柴胡为自然干燥的标本叶片 o小叶黑
柴胡为自然干燥的原植物叶片 ∀均经北京中医药大
学中药学院阎玉凝教授鉴定k见表 tl ∀
表 t 各种样品采集地点及时间
名称 采集地点 采集日期
柴胡 Βυπλευρυ µ χηινενσε 河北雾灵山 usst2s{
狭叶柴胡 Β1 σχορζονεριφολιυ µ 山东泰山 ussu2sy
竹叶柴胡 Β1 µ αργινατυ µ 云南昆明 usst2s{
黑柴胡 Β1 σµιτηιι 宁夏固原 ussu2ts
小叶黑柴胡 Β1 σµιτηιι √¤µ1 παρϖιφολιυ µ 宁夏海原 ussu2s|
112 ⁄‘„ 提取 用 ≤ × „… 法≈y 提取获得总
⁄‘„ ∀称取 s1v ª各样品叶片 o置于培养皿中 o加水
少许 o浸泡至充分展开 o剪去病斑 o用棉球擦拭叶片 o
去除杂质 o再用 zs h乙醇擦拭叶片表面 o然后用超
纯水清洗 v次 o置于超净台上干燥 ~在液氮中研磨成
细粉 o转移至含有 v °u ≅ ≤ × „… 的提取缓冲液
ku h ≤ × „…os1t °²¯ #p t ×µ¬¶2‹≤¯o³‹ {1s o∞⁄× „
s1su °²¯#pt o‘¤≤¯t1w °²¯#pt ot h °∂ ° o用前加
入 Β2巯基乙醇 u h l的离心管中 o轻轻转动离心管 o
使植物组织在提取缓冲液中均匀分散 oyx ε 温浴 |s
°¬±o并不时轻轻转动离心管 ~混合物冷却至室温
后 o加入等体积的氯仿2异戊醇kuwΒtl o轻轻颠倒离
心管 o使管内混合物成乳浊状 ow ε tu sss µ#°¬±p t
分相 ∀转移上清液至另一洁净离心管中 o重复该步
骤 u次 ~在最终 t次抽提液中加入 s1z体积 p us ε
异丙醇 ow ε 放置 vs °¬±以上 ow ε tu sss µ#°¬±p t
#uvz#
第 vs卷第 ts期
ussx年 x月
中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
∂ ²¯1vs oŒ¶¶∏¨ ts
¤¼ oussx