全 文 :应用基因芯片研究雄黄对
w细胞的作用
王怀宇 o刘陕西
k西安交通大学 第一医院血液科 o陕西 西安 ztssytl
≈摘要 目的 }研究雄黄在诱导急性早幼粒细胞白血病细胞株
w分化及凋亡过程中基因表达谱的改变 ∀方
法 }应用包含 tssv条人类基因的 ¦⁄ 表达谱芯片 o检测雄黄作用于
w 细胞前后基因表达的调控 ∀结果 }
w
细胞在雄黄作用后 tu «o|条基因上调 ovz条基因下调 ~u条参与蛋白酶体降解途径的基因显著上调 o多条与细胞信
号传导 ! 加工及蛋白质合成相关的基因下调 ∀结论 }°≥ ≤u o°≥ ⁄t 及 ×
t 基因的表达改变可能与
w
细胞的分化和凋亡有密切关系 ∀
≈关键词 雄黄 ~基因芯片 ~白血病
≈中图分类号 u{x qx ≈文献标识码
≈文章编号 tsst2xvsukussuls{2syss2sx
三氧化二砷k¶uvl对急性早幼粒细胞白血病
k°l的治疗效果已得到广泛认可 o并对其作用机
理进行了深入的研究 ∀近年来 o有报道显示硫化砷
k¶w≥wl对 °可取得更好的治疗效果 o而且其毒
副作用较 ¶uv 明显降低≈t ou ∀中药雄黄的主要成
分即硫化砷k¶w≥wl o在传统医学中的应用已有很长
的历史 o用含雄黄的中药治疗白血病取得一定的疗
效≈v ∀本研究室对雄黄进行了部分研究 o临床疗效
与报道基本相符 o并且经小鼠急性毒性实验证实其
毒性远较 ¶uv 低≈w ∀为明确雄黄对 °的作用
机理 o本实验应用基因芯片来研究雄黄作用于 °
细胞株后 o对其基因网络的调控 ∀
1 材料和方法
1 q1 材料
雄黄购自西安中药集团k产地为湖南l o经酸洗
水飞法进行纯化加工 ∀对纯化产物经 ÷ 线衍射分
析 o硫化砷含量大于 |x h o未检测到 ¶uv ∀样品溶
于 ° tywsk
≤ 公司l培养液 o灭菌分装备用 o
储存浓度为 vx °ª#p t o应用时稀释为工作浓度 vxs
Λª#pt ∀
w 细胞为人急性早幼粒细胞白血病细
胞株 o由上海血液学研究所陈竺教授惠赠 ∀
¬²⁄²²µ2
tsuw⁄表达谱基因芯片由上海联合基因公司提供 o
共包含 t ssv个待研究基因 ∀
≈收稿日期 usst2tt2tu
≈基金项目 陕西省中医药科研资助项目kt|||ssul
≈通讯作者 电话 }ksu|lxvyt{y| 传真 }ksu|lxuyvt|s ∞2
°¤¬¯}º«¼º«¯ ³∏¥q¬¤²±¯¬±¨ q¦²°
1 q2 细胞培养
取
w细胞按 t ≅ tsx# °p t浓度接种于含及
不含 vxs Λª#pt雄黄的新鲜 ° tyws 培养液中
k内含 ts h小牛血清 ot °°²¯#p t谷氨酰胺 ot °°²¯
#pt丙酮酸及 tss #°p t青霉素 otss #°p t链
霉素l o于 vz ε ox h ≤ u 培养箱中培养 tu «后收集
细胞 ∀
1 q3 探针制备
×µ¬½²¯ 总 抽提试剂盒k
≤ 公司l抽提
w细胞总 o用 ¬¯ª²·¨¬ ° ¬§¬¬·k±¬¤2
ª¨ ±公司l纯化 ° o应用 电泳及分光光度
仪测 ⁄uysr⁄u{s 以鉴定 ° 质量 ∀ 参照
≥¦«¨ ±¤等的方法≈x 将样品 ° 经逆转录反应制
成带荧光标记的 ¦⁄ 探针 k用荧光染料 ≤¼v2
§×°标记未经雄黄处理的
w细胞 ° 为对
照组 o≤¼x2§×°标记经雄黄处理 tu «后的
w细
胞 ° 为实验组l ∀乙醇沉淀后溶解在 us Λx
≅ ≥≥≤k≥²§¬∏° ¦«¯²µ¬§¨r≥²§¬∏° ¦¬·µ¤·¨ ¥∏©©¨µo氯化
钠r柠檬酸钠缓冲液l n s qu h ≥⁄≥k≥²§¬∏° §²§¨¦¼¯
¶∏¯©¤·¨ o十二烷基硫酸钠l杂交液中 ∀
1 q4 芯片预杂交
芯片置 |x ε 双蒸水中水浴 u °¬±o取出后置无
水乙醇中 vs ¶o室温晾干 o将杂交试剂滴加到芯片
上 o盖上盖玻片 o置于含少许双蒸水的保湿杂交舱
中 o封口膜封口 owu ε 水平放置 x «∀
1 q5 杂交及洗涤
将含荧光标记的探针置 |x ε 水浴中变性 u
#ssy#
第 uz卷第 {期
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Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
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∏ªqoussu
°¬±o将探针加在已预杂交的基因芯片上 o盖玻片封
片 owu ε 杂交tx ∗ tz«∀分别用s qt h ≅ ≥≥≤ n
s qu h ≥⁄≥ os qt h ≅ ≥≥≤ 洗涤 ts °¬±o室温晾干 ∀
1 q6 检测与分析
用 ≥¦¤± µµ¤¼ vsss扫描仪k ±¨¨ µ¤¯ ≥¦¤±±¬±ª公
司l扫描芯片 o°¤ ±¨¨ v qs 软件分析 ≤¼v 和 ≤¼x 两
种荧光信号的强度和比值 ∀通过两种波长扫描得到
的强度值分别代表 ≤¼v与 ≤¼x的数值 o计算出每个
点 ≤¼v与 ≤¼x的µ¤·¬²值 ∀
2 结果
2 q1 芯片的质量标准控制
¬²⁄²²µ2tsuw⁄表达谱基因芯片的质量标准是 }
有 |u个管家基因k阳性对照l必须为阳性 o{个植物
基因k阴性对照l及 |{个点样液k空白对照l必须为
阴性 ∀本实验结果完全符合上述条件 o说明实验无
污染而且检测体系正常 ∀
2 q2 差异表达的基因
先将所有数据的前景值与背景值相减 o得出
≤¼v o≤¼x标记的强度值 ~将所有小于 uss的强度值
以 uss取代 ∀根据总数为 ν 的有效基因k¶¨¯¨ ¦·值
t o≤¼v o≤¼x值两者皆大于 uss o或者其一大于 {ssl
的µ¤·¬²的自然对数值 ±¯¬ ±¯k≤¼xr≤¼vl o以 ¬值
在 s qt ∗ ts的有效基因作为均一化依据 o算出这些
基因 µ¤·¬²自然对数平均值 o即均一化k±²µ°¤¯¬½¤2
·¬²±l系数≈x ∀
将所有数据项的 ≤¼v 标记强度乘上均一化系
数 o得出调整后的 ≤¼v 3 ∀算出所有基因的 µ¤·¬²值
k≤¼xr≤¼v 3 l ∀列出µ¤·¬²值大于 u或小于 s qx的数
据 o从中筛选出具有同一 ±¨¨ ⁄号 o在与两种探针
杂交时皆表现出一定的差异 o且上下调趋势一致 ∀
根据以上筛选标准得出 o
w 细胞在雄黄处理
前后µ¤·¬²值大于 u或小于 s qx o且同一基因的两个
重复点表达均有相同变化的共有 wy 条 ∀其中表达
上调的有 |条 o表达下调有 vz 条 o以下仅列出经人
类基因命名委员会 k ∏°¤± ±¨¨ ²° ±¨¦¯¤·∏µ¨
≤²°°¬··¨¨o«··³}Μººº qª¨ ±¨ q∏¦¯ q¤¦q∏®r±²° ±¨¦¯¤2
·∏µ¨l正式确定基因标记kª¨ ±¨ ¶¼°¥²¯l的 u{条基因
k表 tl ∀在芯片杂交信号的散点图中 o每个点的 Ψ
轴为 ≤¼x的杂交信号相对强度 o表示在实验组中的
表达水平 ∀ Ξ轴为 ≤¼v的杂交信号相对强度 o表示
该基因在对照组中的表达水平 ∀wxβ角直线上的点
的 ≤¼xr ≤¼v比率为 t o表示无表达差异 o远离 wxβ角
直线上的点为差异表达基因k图 tl ∀
图 t 基因芯片杂交信号的散点图
3 讨论
基因芯片kª¨ ±¨ ¦«¬³l又称 ⁄ 微矩阵k °¬2
¦µ²¤µµ¤¼l o是 us 世纪 |s 年代中期以来随着人类基
因组计划k°l快速发展起来的分子生物学高新技
术 o是各学科交叉综合的崭新科学≈x ∀基因表达谱
芯片作为目前应用最广泛的基因芯片是将几千各特
异性基因的探针或其 ¦⁄ 固定在一个芯片上 o对
不同细胞或组织 !不同发育阶段或不同刺激等条件
下的细胞内 ° 或逆转录 ¦⁄ 进行检测 o可以
大规模分析这些基因在不同条件下表达的差异性 o
为进一步探索这些基因的功能提供条件 ∀
芯片中 tssv个待研究基因及阳性r阴性对照基
因均为双点 ∀对于待研究基因 o必须在双点均为表
达有差异 o且上下调趋势一致 o才认为是差异表达的
基因 ∀并应用逆转录聚合酶链反应 °≤ k³²¯¼° µ¨¤¶¨
¦«¤¬± µ¨¤¦·¬²±l方法对部分结果进行验证 o本实验选
择 ×
t基因验证与基因芯片结果完全相符k结果
待发表l ∀另外关于砷剂可引起热休克蛋白的表达
增加 o与文献报道相符k见下文l o也进一步证实芯片
结果的可靠性 ∀
本研究室对雄黄的研究发现 ovxs Λª#p t的雄
黄作用于
w 细胞后 o可引起细胞的凋亡 o同时光
镜下可见到部分细胞出现核凹陷 o核浆比例减少 o酷
似中 !晚幼粒细胞 o投射电镜下可见细胞核缩小 o胞
浆内可见较多的分化颗粒 ∀流式细胞仪检测发现
w细胞表面分化抗原 ≤⁄tt¥逐渐升高 o≤⁄vv 逐
渐下降≈w ∀这些结果证实雄黄在诱导
w 细胞凋
亡的同时还有诱导
w 细胞分化的作用 ∀应用基
因芯片检测出在雄黄作用过程中 t sss余条基因的
表达情况 ∀在表达差异的 wy 条基因中仅有 | 条上
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调 o其余的 vz条均下调 o可见多数基因下调 ∀
在表达上调的基因中 o有两条基因的表达产物
参与蛋白酶体的降解途径有关 ∀°≥ ≤ u基因和
表 t 雄黄作用
w细胞前后表达差异基因
±¨¥¤±®p⁄ ±¨¨ ≥¼°¥²¯ ¤·¬² ±¨¨ ¤°¨
pssuutt ×
t s qtux ¬±·¨ªµ¬±o¥¨·¤t k©¬¥µ²±¨ ¦·¬± µ¨¦¨³·²µo¥¨·¤³²¯¼³¨ ³·¬§¨ o¤±·¬ª¨ ± ≤⁄u|
¬±¦¯∏§¨¶ ⁄ƒu o ≥tul
s{suv ∞ × s quy{ ¦2° µ¨³µ²·²2²±¦²ª¨ ±¨ ·¼µ²¶¬±¨ ®¬±¤¶¨
suvuvu ƒ°|x s quz| ½¬±¦©¬±ª¨µ³µ²·¨¬± «²°²¯²ª²∏¶·² ©³|x ¬± °²∏¶¨
pssy{uv ° s qu{x ³µ²·¨¬± ®¬±¤¶¨ k¦ °2§¨ ³¨ ±§¨ ±·o¦¤·¤¯¼·¬¦l ¬±«¬¥¬·²µ¤¯³«¤
ƒswtwvw °×°wv s qvsz ³µ²·¨¬±·¼µ²¶¬±¨ ³«²¶³«¤·¤¶¨ ·¼³¨ ∂ o °¨°¥¨µv
÷swwtu ≥ s qvtw ª¨ ¶¯²¯¬± k¤°¼¯ ²¬§²¶¬¶oƒ¬±±¬¶«·¼³¨ l
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°≥ ⁄t基因是 uy≥ 蛋白酶体复合物中 t|≥ 调控复
合物的两个不同亚基 ∀经雄黄作用后 o°≥ ≤u基因
及 °≥ ⁄t基因的表达均明显上调 ∀ ¶uv 可启动
蛋白酶体通路 o降解 ° 蛋白及 ° r Α融合
蛋白 o同时恢复核体的正常分布 o与
w 的凋亡相
关≈y ∀
w 细胞的分化也与融合蛋白 ° 2 Α
的降解以及核体正常结构的恢复关系密切 o而蛋白
酶体途径参与这些过程≈z ∀应用蛋白酶体抑制剂可
阻止砷剂诱导
w的分化 o进一步证实了蛋白酶体
的作用≈{ ∀本实验室研究发现雄黄也可恢复核体的
正常分布k论文另发表l ∀提示雄黄可能通过上调这
两条基因激活蛋白酶体复合物 o从而引起
w细胞
中 ° 2 Α融合蛋白的降解 o而诱导
w细胞的
凋亡和分化 ∀ ≥°≤ 基因的表达产物为热休克蛋
白 |sk«¶³|sl o它可能促进蛋白酶体的降解 ∀«¶³|s
为一种分子伴侣 o可通过与异常蛋白质的结合 o促进
这些蛋白质转运到胞浆中的蛋白酶体而被降
解≈| ots ∀有研究也证实砷剂作用后可引起 «¶³|s表
达的增加≈tt ∀另一个表达明显升高的基因为 2
°≤基因 o编码k«± ° ≤ 核不均一性核糖核蛋白 ≤
蛋白l ∀«± ° ≤ 通过与序列特异性 结合 o起
到 分子伴侣的作用 o对前体 进行加工处
理≈tu ∀ ¶³|s及 «± ° ≤ 在雄黄诱导
w细胞分
化时 o是否能起到促进蛋白酶体的降解途径尚待进
一步研究 ∀
v条与蛋白质合成相关的基因都表达降低 ∀核
糖体是蛋白质合成的重要细胞器 o °≥uz 基因 !
°tz基因和 °tv 基因的表达产物都属于核糖
体蛋白质 o在雄黄作用后均下调≈tv ∗ tx ∀可能由于雄
黄作用后表达下降的基因占多数 o蛋白质的合成相
应减少 o因此与蛋白质合成相关的基因则同时表达
下降 ∀
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多条与细胞信号传导有关的基因表达明显下
调 ∀如 ∞ × 基因的表达产物为酪氨酸激酶的受
体 o在正常的 × 淋巴细胞 !
淋巴细胞未检测到表
达 o但在许多肿瘤性
细胞 !× 细胞中表达≈ty ∀
≥u基因可调控 蛋白信号通路 o该基因在急性
髓细胞性白血病 !急性淋巴细胞性白血病及慢性粒
细胞性白血病均表达 o但在正常的骨髓及造血细胞
中未检测到≈tz ∀该基因可能在白血病发生中起一
定作用 o在雄黄作用后表达降低 ∀研究中表达降低
最明显的基因为 ×
t o编码整合素k¬±·¨ªµ¬±lΒt亚
单位 ∀整合素是一类重要的细胞表面受体 o由 Α和 Β
两个亚单位组成的异二聚体 o主要介导细胞之间及
细胞与细胞外基质的粘附 ∀整合素在胞内外信号传
导中起重要作用 o参与调节细胞的生长 !分化 !凋亡
等 ∀Βt整合素在正常表皮角化细胞中 o起到抑制细
胞分化的作用≈t{ ∀在我们对 ¶uv 的研究中也发
现 ×
t基因出现下调k论文另发表l ∀×
t 基
因在雄黄作用后表达明显下调 o是否参与促进细胞
分化及诱导凋亡有待更深入的研究 ∀
应用基因芯片对白血病治疗的研究才刚起步 ∀
在维甲酸诱导
w分化的检测中发现有 tss条基因
上调 oy|条基因下调 o与雄黄的结果相比 o基因表达
谱的差异极大 o表明两者在同样诱导
w细胞分化
的情况下 o细胞内的基因网络调控有很大区别≈t| ∀
应用基因芯片在硫化砷对 xyu细胞的研究中 o发现
有 tt条表达差异基因 o与本研究比较无相同基因表
达改变≈us ∀除与实验方法不同外 o硫化砷的浓度相
差也极大 ∀对 xyu 的研究中 o硫化砷的浓度为 xs
Λ°²¯#p t o可诱导细胞凋亡 o不同于本实验中 vxs Λª
#p t的雄黄k约相当于 t Λ°²¯ #p t的硫化砷l还可
诱导
w细胞的部分分化 ∀
总之 o以上差异基因的发现为进一步研究雄黄
治疗急性早幼粒细胞白血病时的分子机制提供了具
体的线索 o尤其是 °≥ ≤u o°≥ ⁄t及 ×
t基因的
表达改变可能在
w 细胞的分化和凋亡中起到非
常重要的作用 ∀
≈参考文献
≈t 陆道培 o邱镜滢 o江 滨 o等 q硫化砷治疗急性早幼粒细胞白血
病 tst例报告 q中华医学会第六次全国血液学学术会议论文
汇编 ousss qw{ q
≈u ∏⁄ ° o ±¬∏ ≠ o¬¤±ª
o ·¨¤¯ q ∞©©¨ ¦·¬√¨ ×µ¨¤·° ±¨·²© ¦∏·¨
°µ²°¼¨¯²¦¼·¬¦¨∏®¨ °¬¤ º¬·« × ·¨µ¤2¤µ¶¨±¬¦× ·¨µ¤≥∏¯©¬§¨ k¶w≥wl
²±²2¬±¶·¬·∏·¬²±¤¯ ≥·∏§¼ q
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≈v 黄世林 o郭爱霞 o向 阳 o等 q复方青黛片为主治疗急性早幼粒
细胞白血病的临床研究 q中华血液学杂志 ot||x otyktl }uy q
≈w 孙志新 o冯建明 q中国西部医学文集血液病分册 q西宁 }青海
人民出版社 ousst qvv q
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≈责任编辑 方文贤
佛手醇提取液的药理作用研究
金晓玲 o徐丽珊 o何新霞
k浙江师范大学 生命与环境科学学院 o浙江 金华 vutsswl
≈摘要 目的 }研究佛手醇提取液的药理作用 ∀方法 }采用常规镇咳 !平喘 !祛痰的试验方法 ∀结果 }佛手醇提
取液灌胃给药能显著减少氨水致小鼠的咳嗽次数 o增加小鼠呼吸道酚红分泌量k Π s qstl o能明显延长有雾化组
胺所引起的豚鼠哮喘潜伏期和延长小鼠咳嗽潜伏期k Π s qsx或 Π s qstl o且呈量效关系 ∀提高小鼠的抗应激
能力 ∀结论 }佛手醇提取液具有明显镇咳 !平喘 !祛痰作用和提高抗应激能力 ∀
≈关键词 佛手醇提取液 ~祛痰 ~平喘 ~止咳 ~应激
≈中图分类号 u{x qx ≈文献标识码
≈文章编号 tsst2xvsukussuls{2sysw2sv
佛手为芸香科植物 Χιτρυσ µεδιχα q√¤µσαρχο2
δαχτψλισk²²·l ≥º¬±ª¯¨的成熟果实 o具有理气化痰
的功效 o用以缓解胃痛 !胸胁痛和呕吐等消化系统症
状≈t ou ∀有关佛手醇提取液的祛痰 !镇咳作用的研
究工作主要集中在广佛手和川佛手 o且以川佛手的
平喘效果较好≈v ∀而对佛手醇提取液的止咳和抗应
激作用的研究尚未见报道 ∀本研究以金佛手为材
料对其醇提取液的祛痰 !平喘 !止咳和抗应激作用进
≈收稿日期 usst2sv2sy
≈基金项目 浙江省教育委员会资助项目kt|||sxstl
≈通讯作者 电话 }ksxz|luu{uvux ∞2°¤¬¯}¬±¬¬¤²¯¬±ª ¶¬±¤q
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行了实验研究 o以期为金佛手的深层开发和利用提
供有力的实验依据 ∀
1 材料和方法
1 q1 动物 小鼠 o金华市实验动物中心提供 o
合格证号 }医动字第 uu2|yszssu ~⁄°豚鼠 o浙江大
学医学院实验动物中心提供 o合格证号 }医动字第
uu2|ystst{ ∀
1 q2 药品及仪器 佛手醇提取液由本实验室提供 o
t ®ª生药量可得醇提取液 uss °ª~复方甘草合剂由
金华市中心医院制剂室提供 o批号 ussss{vt ~苯酚
由上海试剂三厂生产 o批号 |xttuw ~氨茶碱由杭州
民生药厂生产 o批号 |{svsu ∀zut 分光光度计由上
海分析仪器三厂生产 ~≤≥ • 2t 超声波雾化器由广东
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第 uz卷第 {期
ussu年 {月
中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
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