全 文 ：人参毛状根生物合成熊果苷的研究
赵明强 o丁家宜 o刘 峻 o胡 波
k中国药科大学 生物技术研究室 o江苏 南京 utssv{l
≈摘要 目的 }研究人参毛状根生物合成熊果苷的基本条件 ∀方法 }以熊果苷的含量 !氢醌kt ow2对苯二酚l的
转化率为指标 o找出适于生物合成的培养条件 !持续时间和底物浓度 ∀结果 }培养 uu §的人参毛状根更换含底物的
x培养基后 o对浓度为 u °°²¯#p t的氢醌持续转化 uw «o所合成的熊果苷占干重的 tv qs h o转化率达 {| qs h ∀结
论 }本文首次以人参毛状根为反应器 o人工合成出人参属植物所不具有的熊果苷 ∀
≈关键词 人参毛状根 ~氢醌 ~生物合成 ~生物转化 ~糖基化 ~熊果苷
≈中图分类号 ≥ xyz qx n t ~n v ≈文献标识码
≈文章编号 tsst2xvsukusstltu2s{t|2sw
人参 Παναξ γινσενγ ≤ q q ¼¨¨ µ是传统的名贵
中药 o由于人参栽培中存在栽培困难 !周期过长 !地
域限制等难题 o人参的组织培养受到广泛重视 ∀我
室建立起人参细胞大量培养实现工业化生产天然药
物≈t ∀因毛状根培养体系具有生长速度快 o有用物
质含量高和遗传性状稳定等特点 o大有取代细胞培
养之势≈u ∀继人参细胞大量培养后 o我室又建立起
人参毛状根培养体系≈v ∀近 ts年 o国内外学界一致
认为熊果苷是抑制酪氨酸酶活性的优良天然产
物≈w ∀我室已将人参细胞与熊果苷配伍在化妆品中
应用 o深受广大消费者青睐≈x ∀天然熊果苷来自熊
果 !越橘等植物≈y oz o未曾见存在于人参属植物中的
报道 ∀本文首次利用人参毛状根将外源氢醌转化为
熊果苷 o已获得初步结果 o现报告如下 ∀
1 材料和方法
1 q1 实验材料 人参毛状根 ∞w 株系由本实验室
提供 o在
x培养基中悬浮培养 o每 ux §继代 t次 o在
转速为 tss µ#°¬±p t的摇床上暗培养 o温度kux ? tl
ε ∀
1 q2 培养方法 在 txs °¯ 摇瓶中加入 zx °¯
x
培养基 o³ 调至 x q{ o灭菌后 o每瓶接种 txs °ª湿
重的嫩根 ∀
1 q3 糖基化方法 每瓶人参毛状根培养至一定
阶段 o将其生长培养基更换为 zx °¯ 含一定浓度氢
醌的
x培养基 o以上述转速 !温度暗培养一定时间 ∀
每 ts瓶处理 o共重复 v次 ∀
1 q4 人参毛状根生长测定 取培养到一定阶段的
≈收稿日期 usst2sx2ts
人参毛状根 o吸干表面水分 o称湿重kƒ • l ∀每次取
样 ts瓶 o共重复 v次 ∀
1 q5 熊果苷含量分析方法
1 q5 q1 仪器与试剂 日本岛津 ≤2ts× 高效液
相色谱仪 o日本岛津 ts≥°×2ts ∂2∂≥ 检测器 o
• 色谱工作站 o乙腈为色谱纯 o水为 u次重蒸水 o
熊果苷标准品k≥ 公司l ∀
1 q5 q2 色谱条件 色谱柱 ≤t{ ≥«¬°2°¤¦® ≤≤2
⁄≥kt qy °° ≅ txs °° ox Λ°l ~流动相2乙腈2水ktΒ
|l ~流速 t °¯ # °¬±p t ~检测波长 u{s ±° ~进样量 us
Λ¯ ~柱温 ux ε ∀
1 q5 q3 对照品和供试品溶液的制备
标准品溶液 取熊果苷标准品 x qww °ªo用流
动相定容于 x °¯ 的容量瓶 o制成浓度为 t qs{{ °ª#
°¯ p t的标准品溶液 ∀
供试样品溶液 分别取出各种条件下转化后的
人参毛状根 o用少量蒸馏水洗涤 op xs ε 冻干 o研
磨 o过 ys目筛 ∀精密称取粉末 ts °ª置于 ts °¯ 容
量瓶中 o加蒸馏水 ts °¯ o冷浸 uw «o超声 ts °¬±后
定容 os qu Λ°微孔滤膜过滤 o得供试样品溶液 o贮藏
于 w ε 冰箱备用 ∀
1 q5 q4 测定方法
1 q5 q4 q1 标准曲线的制备 取浓度为 t .s{{s °ª#
°¯ p t的标准品溶液 t °¯ o置 x oux oxs otss °¯ 容量瓶
中 o以流动相定容 o分别取上述 x种浓度的标准品溶
液 o各重复进样 us Λ¯k ν vl o记录峰面积积分值 o以
进样浓度 Χk°ª# °¯ p tl对峰面积平均值 Α进行线
性回归 o得回归方程 }Χ v ≅ tsp z Α p s qssvu ρ
#|t{#
第 uy卷第 tu期
usst年 tu月
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Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
∂ ²¯ quy o²qtu
⁄¨ ¦qousst
s q|||| o表明熊果苷在 s qssts{{ ∗ t qs{{s °ª# °¯ p t
有良好的线性关系 ∀
1 q5 q4 q2 精密度试验 取浓度为 t .s{{ °ª#
°¯ p t的标准品溶液连续进样 x次 o每次 us Λ¯ o测峰
面积积分值 o结果 ΡΣ∆ s qv h o表明进样精密度
好 ∀
1 q5 q4 q3 稳定性试验 取上述样品溶液 us Λ¯ o分
别于 s ov oy otu ouw «进样 o测峰面积 oΡΣ∆ u h
k ν vl o结果表明样品至少在 uw «内稳定 ∀
1 q5 q4 q4 重现性试验 取上述样品溶液 us Λ¯ o连
续进样 y次 o测峰面积积分值 oΡΣ∆ s q{ h o结果
表明重现性好 ∀
1 q5 q4 q5 加样回收率实验 精密称取已知含量
的样品 ts .s °ªo共 y份 o分别置于 ts °¯ 容量瓶中 o
各添加浓度为 t qs{{ °ª# °¯ p t的标准品溶液 tss Λ¯ o
加蒸馏水 ts °¯ o冷浸 uw «o超声 ts °¬±后定容 os qu
Λ°滤膜过滤 o制成加样回收样品溶液 ∀分别取上述
加样回收样品溶液 o各重复进样 us Λ¯ k ν vl o记录
峰面积积分值 o熊果苷的加样回收率为 tss qt h o
ΡΣ∆ s qy h ∀
1 q5 q5 样品测定 取供试样品液 us Λ¯ o连续进样
v次 o测定峰面积积分值 o以回归方程计算样品中
的熊果苷含量 ≤¥如式 t o并由此计算出底物转化率
µh o如式 u ∀
≤¥ k Χ¤# ςtr Ωtl ≅ tss h ktl
µh ≈k Χ¥#⁄ Ωlrk #≤ ±# ςul ≅ tss h kul
式ktl中 }Χα为样品溶液中熊果苷的浓度k°ª#
°¯ p tl ~ςt为样品溶液体积k °¯ l ~Ωt 为样品取样量
k°ªl ∀式kul中 }Χβ为样品中熊果苷含量 ~∆ Ω 为
毛状根的干重 k °ªl ~ 为熊果苷的分子量 kª#
°²¯ p tl ~≤ ± 为氢醌浓度k°°²¯ #ptl ~ςu 为每瓶
培养基体积k °¯ l ∀
2 结果
2 q1 毛状根中熊果苷的鉴定 将培养到 uu §的毛
状根转移到新的未加前体
x培养基中 o培养 uw «
后 o依/ 1 q5 q30项下操作 o制成未加前体样品溶液 o依
法测定 ∀通过标准品溶液 !未加前体样品溶液 !样品
溶液的谱图k如图 t中 ¤o¥ o¦l相互对比 o发现标准
品的峰在标准品溶液 !样品溶液的图谱中以相同保
留时间出现 o而未加前体样品溶液的图谱中无此峰 ∀
从而确定熊果苷只存在于加入前体的人参毛状根
中 o证明了人参毛状根能将氢醌合成为熊果苷 ∀
图 t 样品的 °≤ 图谱
¤q标准品溶液 ¥q未加前体样品溶液 ¦q样品溶液
t q熊果苷
2 q2 毛状根的不同培养阶段对熊果苷合成的影响
在 uw «内 o以培养到不同阶段的毛状根来转化浓
度为 u °°²¯#pt的氢醌 o结果如表 t ∀发现培养到
uu §的毛状根中熊果苷含量最高 o且转化率和产量
较高 o∀本研究的其他处理也选择在毛状根培养 uu
§时进行 ∀
表 t 毛状根的不同培养阶段对熊果苷合成的影响
培养
阶段r§
毛状根
鲜重r°ª
毛状根
干重r°ª
熊果苷
含量r h
熊果苷
产量r°ª
转化率
r h
ty tv|v tvu ts qy tw qs vw qu
t| ux|| uux tt qy uy qt yw qv
uu vsxu uz| tv qs vy qw {| qs
ux wzy| u|u { qu uv q| yv qu
u{ xyvt vvy z qy ux qw z| qs
vt yx{z wtv y qs uw q{ yt qy
注 }毛状根的鲜重和干重均以其 ts瓶的平均值计算k表 u ov同l
2 q3 不同底物浓度对熊果苷合成的影响 不同浓
度的氢醌对培养 uu §毛状根的糖基化持续 uw «o其
结果如表 u ∀氢醌浓度为 u °°²¯#pt时 o熊果苷含
量最高 o转化率较高 ∀故以后实验中的氢醌浓度都
定为 u °°²¯#pt ∀
表 u 不同底物浓度对熊果苷合成影响
底物浓度
r°°²¯#p t
毛状根
鲜重r°ª
毛状根
重r°ª
熊果苷
含量r h
转化
率r h
s qyux u|uw uxy s qx |{ qv
s qtux uy{| uwx t qs |y qt
s qux vvyz u{| t qz |x qy
s qx vust u{t v qv |t qx
t qs u{|v uzs y q| |t qt
u qs vsxu uz| tv qs {| qz
w qs u|{u uzv tu qy {x qv
{ qs uz{| ux| tt qx z| qs
ty qs vtuv u{y z qt w| qs
2 q4 转化持续时间对熊果苷合成的影响
在 v ∗ {w «内 o以培养 uu §的毛状根 o持续糖基
化 u °°²¯#pt的氢醌 o具体结果如表 v ∀熊果苷含
#su{#
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Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
∂ ²¯ quy o²qtu
⁄¨ ¦qousst
量 !转化率在 uw «时分别达到 tv qs h o{{ q| h o至
zu «时两者变化不大 o故转化持续 uw «较合适 ∀
表 v 转化持续时间对熊果苷合成的影响
转化持续
时间r«
毛状根
鲜重r°ª
毛状根
干重r°ª
熊果苷
含量r h
转化
率r h
v u{|x uyz v qw uu qv
y u|{z uzu x qx vy qz
tu u|tx uyx y q| ww q{
uw vsxu uz| tv qs {{ q|
vy u{t| uyv tv qt {w qw
w{ u|yw uzs tv qw {{ qz
ys vuts u{t tv qu {{ qv
zu u{|z uzs tu qt {s qt
{w u|yx uzw tt qt zw qx
3 讨论
3 q1 人参毛状根生长迅速 o遗传稳定 o皂苷含量
高 o培养方便 o是一种新型的培养体系 ∀国内的研究
主要集中在毛状根的诱导 !株系筛选和次生代谢产
物的调控上≈{ ∀本研究能高效地将氢醌生物合成为
熊果苷 o有可能是在毛状根中 ⁄°糖基转移酶作
用下 o其富含的葡萄糖高能活化形式 ) ) ) 尿苷二磷
酸葡萄糖k⁄°l与氢醌生物合成为熊果苷 o其生
物合成途径见图 u ∀苷元既可是植物次生代谢产
生 o也可是从环境中吸收≈| ∀
图 u 人参毛状根中熊果苷的生物合成途径
∞q人参毛状根中的 ⁄°糖基转移酶
3 q2 本文首次利用人参毛状根将氢醌糖基化 ∀氢
醌是酪氨酸酶活性抑制剂 o但刺激性强 !副作用大 o
仅在临床中限量使用 ~被转化为天然的熊果苷后 o水
溶性增强 o毒性降低 o扩大了使用范围 ∀与从越橘叶
中提取相比 o糖基化条件可控 o产量稳定 o含量高k越
橘中熊果苷的含量为 w qx h ≈z l o并可工业化生产 ∀
人参毛状根中固有皂苷 !多糖 !维生素 !各种微量元
素等多种有用物质 o当具有利尿 !抗菌 !抑制酪氨酸
酶活性的天然熊果苷被高效合成出后≈ts o其意义更
为突出 ∀由此可见人参毛状根合成熊果苷不仅对研
究葡萄糖苷生物合成有所启发 o而且极具有开发利
用价值 ∀本文初步确定了影响人参毛状根合成熊果
苷三条基本因素 ) 培养阶段 !持续时间 !氢醌浓度 o
为工业化开发人参属植物所不能合成的如熊果苷等
天然有用化合物奠定基础 o并取得较好效果 ∀根据
初步实验 o可以获得熊果苷占干重 tv h的人参毛状
根 o氢醌转化率达 {| qs h o其合成过程中许多因素
的影响 o以及如何提高人参毛状根的熊果苷生物合
成能力和规模有待深入研究 ∀
≈参考文献
≈t ≠ ⁄¬±ªo ±¬≤«¨ ± o⁄÷¬¤±ªo ·¨¤¯ q≥·∏§¬¨¶²± §¨¬¦¬±¤¯ °µ²§2
∏¦·¶©µ²° °¤±¤¬ ¬±¶¨±ª ≤¨¯¯ ≤∏¯·∏µ¨ q
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≈u 刘 涤 o胡之璧 o宋纯清 q传统生物技术研究是中药现代化的
重要内容 q国外医药 q植物药分册 ot||{ otvkyl }uwx q
≈v 刘 峻 o丁家宜 o徐 红 o等 q¬质粒人参转化系统的建立及鉴
定 q中国中药杂志 ousst ouykul }|x q
≈w ƒ∏±¤¼¤°¤ oµ¤®¤º¤ o≠¤°¤°²·² o ·¨¤¯ q∞©©¨ ¦·¶²© ³¯«¤
¤±§
¨ ·¤2¤µ¥∏·¬± ²± ¦·¬√¬·¼ ²© ×¼µ²¶¬±¤¶¨¶©µ²° ∏¶«µ²²° ¤±§
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≈x 高怡琅 o李淑玲 q中国经济快讯 ousst oy }uy q
≈y ¤·¶∏§¤ o¬ª¤¶«¬±² o ¤®¤¬ ≠ o ·¨¤¯ q ≥·∏§¬¨¶ ²© ≤∏·¬¯¨
⁄µ∏ª¶©µ²° ¤·∏µ¤¯ ≥²∏µ¦¨¶q∂ q±«¬¥¬·²µ¼ ∞©©¨¦·¶²©≥²°¨ µ¦2
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t||y ot|ktl }txv q
≈z 孙 晖 o王喜军 o黄 睿 o等 q °2°≤ 法测越橘茎叶中熊果
苷的含量 o中国中药杂志 ot||z ouuk|l }xxx q
≈{ 常拯战 o果德安 o郑俊华 q¬质粒转化植物用于天然活性成分
的研究进展 q中草药 ot||{ ou|ktsl }zsx q
≈| פ®¤¼∏®¬≥ o ׶«¤©∏° q
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¶·µ¤·¨¶¥¼ °¯ ¤±· ≤¨¯¯ ≤∏¯·∏µ¨ q°«¼·²¦«¨ °¬¶·µ¼ ot||s ou| k{l }
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≈ts 贾丹兵 q中医药研究 o越橘口服后血中移行成分的生物活性研
究 qusss otykxl }vy q
Στυδιεσ ον τηε Αρβυτιν Βιοσψντηεσισ βψ Ηαιρψ Ροοτ οφ Παναξ γινσενγ Χ .Α Μαψερ
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[ Αβστραχτ] Οβϕεχτιϖε: ײ¶·∏§¼ ¥¤¶¬¦¦²±§¬·¬²±¶©²µ¥¬²¶¼±·«¨¶¬¶¤µ¥∏·¬± ¥¼·«¨ «¤¬µ¼µ²²·²© Παναξ γιν2
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Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
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©²∏±§qΡεσυλτ : ©·¨µ¦∏¯·∏µ¨§©²µuu §¤¼¶o·µ¤±¶©¨µµ¨§¬±©µ¨¶«
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«¤¬µ¼µ²²·¥¬²·µ¤±¶©²µ°¤·¨§«¼§µ²´ ∏¬²±¨ ¬±·² ¤µ¥∏·¬± ¬± uw «²∏µ¶o·«¨ ¥¬²¦²±√ µ¨¶¬²± µ¤·¨ º¤¶{| qs h ¤±§·«¨
¦²±·¨±·²©¤µ¥∏·¬±¬± §µ¼µ²²·º¤¶tv qs h qΧονχλυσιον : µ¥∏·¬±oº¤¶º«¬¦«±¨ √ µ¨©²∏±§¬±·«¨ ª¨ ±∏¶²© Παναξ
γινσενγ o¦¤± ¥¨ ¥¬²¶¼±·«¨¶¬¶¨§¥¼·«¨ «¤¬µ¼ µ²²·²© Παναξ γινσενγ q
[ Κεψ ωορδσ] «¤¬µ¼µ²²·²© Παναξ γινσενγ ~«¼§µ²´ ∏¬²±¨ ~¥¬²¶¼±·«¨¶¬¶~¥¬²·µ¤±¶©²µ°¤·¬²±~ª¯¼¦²¶¼¯ ¤·¬²±~
¤µ¥∏·¬± ≈责任编辑 王康正
银杏不同变异类型的 °⁄指纹研究
刘叔倩 o马小军 o郑俊华
k北京大学 药学院 o北京 tsss{vl
≈摘要 目的 }分析银杏变异类型的遗传分化及其遗传多样性水平 ∀方法 }用随机扩增多态性 ⁄k °⁄l
标记方法对 u{个银杏变异类型进行遗传多样性检测和遗传分析 ∀结果 }供试银杏样品之间遗传多样性水平较低 o
遗传关系较近 ∀结论 }开发银杏种质资源时 o首要任务是扩大银杏的自然变异率 o并在此基础上 o通过无性繁殖的
方式 o选育药用银杏新品种 ∀
≈关键词 银杏 ~ °⁄~遗传多样性
≈中图分类号 u{u ~±vwz ≈文献标识码
≈文章编号 tsst2xvsukusstltu2s{uu2sw
银杏 Γινκγο βιλοβα q在我国药用历史悠久 o
其果实具润肺 !平喘 !止咳等功效 ∀t|yx 年德国科
学家发现银杏叶中含防治心血管和神经系统疾病的
活性成分银杏黄酮和银杏内酯之后 o其开发成为国
际植物药开发的热点 ∀目前国外正利用分子生物学
技术增加银杏自然变异率 o以提高银杏萜内酯含量
的变异性≈t ∀我国银杏的栽培群体中存在着许多变
异类型 o收集 !鉴定 !比较和评价这些宝贵的变异类
型或品系 o分析这些变异类型的遗传分化程度及遗
传多样性水平 o对银杏的选种有重要意义≈u ∀目前
对银杏变异类型的种质鉴定和评价基本上停留在表
现型水平≈v ow o而从 ⁄ 分子水平对我国银杏遗传
变异的研究尚未见报道 ∀作者采用 ⁄ 指纹技术
中的 °⁄分子标记方法≈x oy 首次对 u{个银杏变
异类型的遗传分化和遗传多样性水平进行了研究 o
为银杏的进一步开发和利用提供依据 ∀
1 材料与方法
1 q1 材料 供试的银杏材料于 t||{年 w月底采
自江苏邳州银杏良种繁育资源圃 o包括 uw个雌株类
型kt2uwl和 w个雄株类型kux2u{lk表 tl ∀取
幼嫩叶片 o清水洗净晾干后立即放在装有硅胶的密
封塑料袋中迅速干燥 ∀
表 t 实验材料及其来源
编号 变异类型 编号 变异类型 编号 变异类型 编号 变异类型
t 泰兴 t号 { 苏农佛手 tx 小圆子 uu 小龙眼
u 泰兴 u号 | 铁富宇香 ty 鸭尾银杏 uv 梅核 t号
v 泰兴 v号 ts 马铃 t号 tz 大佛手 uw 梅核 u号
w 泰兴 w号 tt 马铃 u号 t{ 龙眼 ux 大花穗 t号
x 洞庭皇 tu 绿仁 t| 叶籽银杏 uy 大花穗 u号
y 新民 u号 tv 大龙眼 us 家佛指 uz 大花穗 v号
z 洞庭佛手 tw 小梅核 ut 小佛指 u{ 大花穗 w号
≈收稿日期 usst2sz2ts
#uu{#
第 uy卷第 tu期
usst年 tu月
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∂ ²¯ quy o²qtu
⁄¨ ¦qousst