全 文 ：药材伪品涉及到不同的科 !属或种 o测定药材对
应物种 °·⁄‘„中的一段保守系列作为标准序
列贮存 o就象贮存药品的红外光谱一样 o有疑问
的药材 o只需测定其 °·⁄‘„ 的这一段序列 o与
标准序列作比较 o如果序列吻合则是该物种 o反
之则不是 o就可方便地作出结论 ∀随着分子生
物学技术的高速发展及 ⁄‘„ 序列自动分析仪
的普及 o使 ⁄‘„ 系列分析的速度提高而成本
降低 o有利于将此技术引入药材的检验中 ∀这
可能是今后提高药材检验技术的一个研究方
向 ∀
3 参考文献
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tt 谭邦杰 1 哺乳动物分类目录 1 北京 }中国医药科技出版
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tu 宿兵等 1 中国科学 ot||y }uykxl }wtw
致谢 中国昆明动物研究所细胞与分子进化开放
研究试验室的吴春花 !陈永久 !朱春玲 !齐堇等同志在
技术上给予帮助及云南省药品检验所的踞健 !金永清
同志给予的支持 ∀
t||y ) ts ) ux收稿
⁄‘„分子遗传标记鉴别
在生药鉴定中的应用前景 3
王义权 徐珞珊 徐国钧
k中国药科大学中药学院生药研究室 南京 utsss|l
周开亚
k南京师范大学生物系 南京 utss|zl
摘要 概述了 ⁄‘„分子遗传标记技术在生药鉴别中的理论依据 o并综述了该技术在生药鉴定中的
应用情况和实际应用中需注意的问题 o展望了 ⁄‘„分子遗传标记鉴别在生药鉴定中的前景 ∀
关键词 ⁄‘„ 分子遗传标记 生药鉴定
我国药材资源丰富 o据统计有 t1u万余种 o
其中药用动植物占 || h ≈t  ∀现行使用的中药
材许多品种来源复杂 o互混 !互代现象屡有可
见 ∀近年来 o由于经济利益的驱使 o药材伪 !混
品种的数量有增无减≈u  ∀为确保中药使用安
全 !有效 o对各种药材进行准确地鉴定显得十分
重要 ∀传统上是用经典的形态分类和解剖学特
征来进行生药品种的鉴别 o这种以形态学为基
础的鉴别方法有着简便 !易行等优点 o今后仍将
不失为一种行之有效的生药鉴别方法 ∀但有的
品种 o特别是动物药材或经过多道工序加工后
的药材 o以及中药复方制剂中用药组分的鉴别
3 国家自然科学基金 ‘²1v|xzs{yx ~中国博士后科学
基金资助项目 t||y ou号
#v{x# 中国中药杂志 t||z年第 uu卷第 ts期
就显得力不从心 ∀随着现代分子生物学技术的
迅猛发展 o分子遗传标记技术在医学 !农学 !畜
牧 !水产 !动植物等品种鉴别和系统演化关系的
研究 !法医鉴定等领域中得到越来越广泛的应
用 o已为用分子遗传标记技术对中药材品种进
行准确地鉴别奠定了基础 ∀
1 ⁄‘„分子遗传标记鉴别的依据
生药鉴定研究首先要找到具有物种特异性
的遗传标记kª¨ ±¨ ·¬¦°¤µ®¨ µl o这种遗传标记主
要有形态 !组织细胞 !化学成分 !蛋白质 !染色体
组型 !血清学 !同功酶等特征≈v  ∀然而有些特
征为生物体的遗传性和环境因素共同作用的结
果 o它们受到遗传因素影响的同时 o还与生物体
的发育阶段及环境条件对生物体的作用有着密
切关系 ∀如同种植物由于生长在不同日照条件
下 o即生长的小生境不同 o往往在形态上甚至组
织细胞上都有显著差异 o其化学成分也受生长
地的土壤 !气候等因素的影响 ∀同样 o动物也因
生长发育的不同时期和生理状态的周期不同而
在形态 !血清学等方面有显著的变化 ∀ ⁄‘„ 分
子作为遗传信息的直接载体 o不受外界因素和
生物体发育阶段及器官组织差异的影响 o每一
个体的任一体细胞均含有相同的遗传信息 ∀因
此 o用 ⁄‘„ 分子特征作为遗传标记 ) ) ) 即
⁄‘„ 分子遗传标记 k⁄‘„ °²¯ ¦¨∏¯¤µ ª¨ ±¨ ·¬¦
°¤µ®¨ µl进行物种鉴别更为准确可靠 ∀
⁄‘„分子是由 Š o„ o≤ o× w种碱基构成 o
为双螺旋结构的长链状分子 o生物体特定的遗
传信息便包含在特定的碱基排列顺序中 o不同
的物种其遗传性不同 o这种遗传上的差异便表
现在这 w种碱基排列顺序的变化之中 o这就是
生物的遗传多样性kª¨ ±¨ ·¬¦§¬√ µ¨¶¬·¼l ∀比较物
种间 ⁄‘„分子的遗传多样性的差异来鉴别物
种就是 ⁄‘„ 分子遗传标记鉴别k¬§¨ ±·¬©¬¦¤·¬²±
¥¼ ⁄‘„ °²¯ ¦¨∏¯¤µª¨ ±¨ ·¬¦ °¤µ®¨ µl ∀在真核生
物中 o其单倍体细胞的碱基对数k¥³l在 tsz ∗
tstt之间 o由于 ⁄‘„ 分子的信息含量巨大 o目
前所知 o真核生物中各种基因所占基因组 ⁄‘„
的比例最多也不会超过 us h ∀因此 o在 ⁄‘„
分子上 o有编码与物种存活密切相关的基因区
域 !编码与物种存活不十分密切相关的基因区
域和非编码基因区域 ∀基因组 ⁄‘„ 的这些不
同区域在生物进化过程中所受到的选择压力不
同 o前者所受选择压力大 o表现出高度的保守 o
后者所受选择压力小 o表现出较大的变异 ∀正
是由于这种 ⁄‘„ 分子不同区域承受的选择压
力不同 o使得 ⁄‘„ 分子的不同区域有不同程
度的遗传多样性 ∀因此 o我们能够选择适当的
⁄‘„分子遗传标记 o在属 !种 !亚种 !居群或个
体水平上对研究对象进行准确地鉴别 o这也是
中药材品种 ⁄‘„ 分子遗传标记鉴别的分子基
础 ∀
⁄‘„分子作为遗传信息的载体 o除具有较
高的遗传稳定性外 o在诸多的生物大分子中 o较
蛋白质 !同功酶等还有较高的化学稳定性 ∀不
象蛋白质和同功酶那样 o在生物体死亡后 o很快
失去生物活性 o并迅速降解 ∀在陈旧标本中所
保存下来的 ⁄‘„ 仍能够用于 ⁄‘„ 分子遗传
标记的研究≈w ∗ y  o特别是自 {s年代中期聚合酶
链式反应 k °²¯¼° µ¨¤¶¨ ≤«¤¬± • ¤¨¦·¬²±o简称
°≤ • l技术的建立并得到发展以来≈z o{  o人们甚
至可以从数千年前遗留下来的的古代骨骼标本
中提得微量的 ⁄‘„ o经 °≤ • 扩增后对其特定
的 ⁄‘„片段进行分子遗传标记的研究≈| ∗ tv  ∀
由于 ⁄‘„ 分子所载信息量巨大 o并且相对稳
定 o°≤ • 技术具有高速 !高效和特异性高等特
点 o因此用 ⁄‘„ 分子遗传标记鉴别中药材品
种和对中药复方制剂中组分的检测具有快速 !
准确 !专属性强 !重现性好等优点 ∀
2 ⁄‘„分子遗传标记在生药鉴定中的应用
通常 °≤ • 扩增的模板 ⁄‘„都来自新鲜的
动植物组织材料 ∀如将 ⁄‘„ 分子遗传标记方
法用于生药鉴别中 o首先要解决的问题是能否
从陈旧的药材标本中提得药材本身的 ⁄‘„ o并
能用于 °≤ • 扩增 o这方面已有成功的报道≈tw  o
其次是寻找一种检测药材 ⁄‘„ 多态性的方
法 ∀t||s年 • ¬¯¯¬¤°¶和 • ¨¯¶«两个研究小组
分别在不同的实验室同时发展起来一种新的分
子遗传标记技术 o这就是随机扩增多态 ⁄‘„
k• ¤±§²° „ °³¯¬©¬¨§ °²¯¼°²µ³«¬¦ ⁄‘„ o简称
#w{x# 中国中药杂志 t||z年第 uu卷第 ts期
• „°⁄l o • ¨¯¶« 称之为 „°2°≤ • k „µ¥¬·µ¤µ¬¯¼
°µ¬° §¨°≤ • l≈tx oty  ∀它们的共同之处是用非特
异性的任意单一引物 o在低温条件下与模板
⁄‘„一起复性 o进行 °≤ • 扩增 o这样可以在对
研究对象在没有任何分子生物学研究资料的情
况下 o对其作基因组 ⁄‘„ 多态性分析 o通过用
一系列引物对研究对象的基因组 ⁄‘„ 进行地
毯式的扫描 o便能检测出两个基因组 ⁄‘„ 间
微小的差异 ∀同时 o• „°⁄还具有高效 !灵敏 !
简便 !快速等优点 ∀此项技术出现后很快被用
于动植物的遗传育种 !物种形成和系统演化关
系 !医学微生物和昆虫的鉴别等各个领域的研
究中≈tz  ∀ ≤«¨ ∏±ª等首次用此方法得到西洋参
和人参的 ⁄‘„ 指纹图谱 o并正确地区别这两
种药材≈t{  ∀随后 ≥«¤º 等又用此方法对西洋
参和人参及人参属 v种与 w种伪品的 ⁄‘„ 进
行 °≤ • 扩增 o所得 ⁄‘„ 指纹图谱可用于区别
不同种的人参及伪品≈t|  ∀曹晖等用同样的方
法鉴别中药材地胆草与白花地胆草混淆品获得
成功≈us  ∀在动物药材中 o特别是以部分组织器
官入药和切块的药材 o由于外部形态特征被破
坏 o组织细胞学特征不明显 o理化成分复杂而重
现性差 o给生药鉴定带来困难 ∀我们用 ⁄‘„
分子遗传标记技术对蛇类药材的鉴别研究结果
表明 o用 • „°⁄方法可以准确地区别乌梢蛇及
其混淆品和金钱白花蛇及其伪品 o显示出 ⁄‘„
分子遗传标记技术可望成为一种准确鉴别蛇类
药材的新方法≈ut  ∀目前我们正在进行的蛇类
药材线粒体 ⁄‘„ 细胞色素 ¥基因片段的序列
分析结果也显示 o不同种间 ⁄‘„ 序列有显著
差异 o同种间却高相似 o通过部分 ⁄‘„ 片段序
列分析能够准确区分不同种蛇类药材 ∀在中药
材海马和龟板的鉴别中 o通过线粒体 ⁄‘„ 部
分基因片段的序列分析 o亦能准确地区分出不
同种 ∀此外 o我们还用 • „°⁄方法对湖北麦冬
等几种山麦冬属植物进行了分子遗传标记研
究 o为这几种植物的分类地位提供了佐证 o也为
准确鉴定麦冬类药材提供了分子遗传学方面的
依据 ∀
在中药的使用上 o道地药材一直受到历代
医家的高度重视 o如今道地药材研究已成为中
医药科研的重要课题之一 ∀道地药材具有客观
真实性 o它是来源于特定产区的名优正品药
材≈uu  ∀道地药材的产生除了与药材特定的生
境和特殊的采收加工技术有关外 o还与该道地
药材产区内这一物种的地方种群或居群中遗传
上的特殊性有关 ∀由于这种遗传性的差异 o造
成道地药材与非道地药材品质的差异 ∀但道地
药材与非道地药材毕竟为同种 o甚至同一亚种 o
二者在形态和生药性状等特征上 o差别往往不
十分明显 o给道地药材的鉴别带来了困难 ∀用
⁄‘„ 分子遗传标记鉴别方法能够解决这一难
题 ∀
在 ⁄‘„ 分子遗传标记中 o除上述的 °≤ •
和 • „°⁄ 方法外 o⁄‘„ 限制性片段多态
k• ƒ°l技术 !⁄‘„ 指纹图谱 !位点特异小卫
星 !位点特异微卫星 !⁄‘„ 扩增片段单链构象
多态k°≤ • p ≥≥≤°l !⁄‘„分子克隆 !⁄‘„序列
分析 o进而制备特定的探针进行 ⁄‘„ 分子杂
交技术 !以及新近出现的裂解酶片段长度多态
性k≤ƒ°l技术等分子生物学新技术的不断涌
现 o为我们从居群到科属乃至更大的分类单元
间对中药材进行准确地鉴别提供了更多新的手
段 ∀针对生物体内 ⁄‘„ 分子的不同区段 o其
遗传的保守性和变异性不同 o选择适当的方法 o
利用 ⁄‘„分子遗传标记技术 o研究 ⁄‘„ 分子
中保守性较低的区段 o便可达到准确区分出道
地药材与非道地药材的目的 ∀
此外 o在中药复方制剂中 o某味药是否存
在 o用传统的鉴别方法有时难以奏效 ∀如果通
过对这种药材的分子遗传标记的研究 o找到具
该种高度特异性的 ⁄‘„ 片段 o便可以此为基
础制备出对该种高度特异的寡核苷酸探针 o再
经分子杂交进行 ⁄‘„ 指纹分析 o从而达到鉴
别的目的 ∀这一手段在法医鉴定上的应用≈uv 
表明了它在中药传统制剂中组分鉴别上应用的
可能性 ∀
3 ⁄‘„分子遗传标记鉴别中需注意的问题
在实际应用中 o用 ⁄‘„ 分子遣传标记鉴
别中药材品种还有一些值得注意的地方 ∀首先
#x{x# 中国中药杂志 t||z年第 uu卷第 ts期
是药材采收加工 !储运过程中的生物污染问题 o
由于分子遗传标记具有高度的灵敏性 o样品中
任何生物源的污染 o如霉变 !虫蛀 o甚至人的触
摸都会留下外源 ⁄‘„分子 o这种 ⁄‘„在 °≤ •
扩增过程中可以一同被扩增 o从而使得到的
⁄‘„指纹图谱失真 ∀因此 o在寻找某一品种特
定的 ⁄‘„ 分子遗传标记时 o有效地克服外源
⁄‘„污染显得非常重要 ∀好在 ⁄‘„分子遗传
标记研究所需的实验材料非常少 o通常在取样
过程中一定要选择无霉变和虫蛀的部分 o刮弃
表面 o从内部刮取极少量组织即可 ~或洗净药材
表面 o再用强紫外线照射药材表面 o以彻底破坏
表面的外源 ⁄‘„ ∀同时实验中应严守操作规
程 o避免二次污染 ∀我们在对蛇类药材 ⁄‘„
的提取以及特定 ⁄‘„ 片段的扩增和测序分析
结果表明这样处理可以解决污染问题 ∀
其次 o中药材通常均为动植物的干燥体 o与
分子生物学研究中常用的新鲜材料相比 o均为
陈旧标本 o这对大片段的 ⁄‘„ 扩增往往十分
困难 o而对小片段的 ⁄‘„ 扩增影响不大 o即便
有些影响 o也可通过适当改变实验条件得到克
服 ∀此外 o某些分子生物学方法本身的稳定性
问题尚待进一步提高 o如 • „°⁄虽是首先被用
于中药鉴定的 ⁄‘„ 分子标记鉴别方法 o但实
验过程中实验条件的任何微小变化都会改变实
验结果的一致性 o这一点早已有人注意到 o并在
最佳条件的选择上也做过比较研究≈uw ∗ uy  ∀
另外 o分子生物学研究中消耗品成本较高 o
但随着分子生物学的发展 o产品规模化生产的
形成 o目前分子生物学实验用的一般消耗品价
格已有较大辐度地下降 o并有进一步下降的趋
势 o如 • „°⁄中用的随机引物已有商品化大量
生产 o现在每次反应所用引物的成本已大大下
降 o普通 °≤ • 反应用的 פ´ 酶已由原来的
u1ss元一单位 o降至现在的 s1x 元左右一单
位 ∀随着分子遗传标记鉴别研究的深入 o找到
更为经济实用 o又准确可靠的方法是完全可能
的 ∀
当今分子生物学技术的发展日新月异 o并
广泛地运用到生命科学及各相关学科领域中 ∀
已有人提出分子生药学k  ²¯ ¦¨∏¯¤µ°«¤µ°¤¦²ª2
±²¶¼l这一新的概念≈uz  ∀相信随着分子生物学
技术的发展和对各种生物的分子遗传特征研究
的深入 o亦将为生药鉴定提供更多有效和实用
的分子遗传标记鉴别方法 ∀
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