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鹿鞭的微量 ⁄‘„提取及序列鉴定
王建云 何广新 付文 k云南省药品检验所 昆明 yxssttl
宿兵 王文 张亚平 陆源
k中国科学院昆明动物研究所 昆明 yxssuvl
何牧 k昆明圆通动物园 昆明 yxssssl
朱兆云 k云南省药材公司 昆明 yxsswtl
摘要 采用微量 ⁄‘„ 提取技术 o从梅花鹿血 !毛 !鹿鞭 !鹿茸 !牛鞭 !驴鞭中提取 ⁄‘„ o以线粒体
⁄‘„细胞色素 ¥通用引物 tw{wt和 ‹txtw|扩增约 vsz¥³⁄‘„片段 o扩增产物纯化后采用双脱氧链终
止法测定其序列 ∀结果证明 }梅花鹿毛 !血和鹿鞭的 ⁄‘„序列完全一致 ~而所谓的/鹿茸0则与其有较大
的差异 ∀用所测序列以简约法 °„ ˜°v1t1t程序构建的分子系统树与传统分类系统相吻合 ∀说明此方
法鉴定鹿鞭是科学而准确的 ∀
关键词 鹿鞭 ⁄‘„ 序列测定 鉴定 动物药材
现代生物学证明 }⁄‘„是生物遗传的主要
物质基础 o物体的遗传信息以密码的形式编码
在 ⁄‘„分子上 o表现为特定的核苷酸排列顺
序 o通过 ⁄‘„ 的复制由亲代传给子代 ∀不同
的生物体具不同的 ⁄‘„ 序列 o同种生物体具
有大致相同 ⁄‘„ 序列 o而且这种核苷酸的排
列是相对稳定的 ∀随着分子生物学技术的不断
发展 o特别是微量 ⁄‘„ 提取技术≈t ∗ w  o特异性
扩增 ⁄‘„ 片段多聚酶链式反应k°≤ • l≈x 技
术 o⁄‘„ 序列分析技术≈y oz 的飞速发展 o使我
们能够从制干的动物药材中提取微量 ⁄‘„ o并
进行 °≤ • 扩增 o测定其核苷酸的排列顺序 o根
据所测的 ⁄‘„ 序列 o即可确定药材的种属来
源 ∀本研究根据上述原理 o探索将以上技术引
入动物药材鉴定中 o增加动物药材检验技术的
科学性和准确性 ∀
鹿鞭 o又名鹿肾 o为非常用名贵药材 ∀是鹿
科动物梅花鹿 Χερϖυ νιππον ר°°¬±¦®及马鹿
Χ. ελαπηυσ q雄性的阴茎和睾丸的干燥品≈{  ∀
云南还用水鹿 Χ. υνιχολορ鞭 ∀有补肾 !壮阳 !
益精等功效 ∀近年来因国内资源缺乏曾从国外
进口 o又因价格昂贵 o市场上屡见以牛鞭 !牦牛
鞭和驴鞭伪充≈|  ∀目前的标准对其鉴定主要
依据外观性状 ∀因本品在干燥过程中性状的可
塑性很大 o故影响鉴定的准确性 ∀
1 材料与方法
111 材料k见表 tl
112 方法
11211 ⁄‘„提取和检测 参考已发表的微量
⁄‘„提取方法≈t ∗ w 进行 ∀
11212 ⁄‘„的扩增 °≤ • 引物为哺乳动物线
粒体 ⁄‘„细胞色素 ¥k°·⁄‘„¦·¼2¥l通用引物
tw{wt和 ‹txtw| o该引物特异地扩增哺乳动
物线粒体 ⁄‘„基因组细胞色素 ¥基因中的一
个长度为 vsz¥³的片段 ∀引物序列 }
tw{wt x. ≤ ≤ „× ≤≤ „„≤ „× ≤ × ≤ „Š≤ „× Š„× Š„„„v.
‹txtw| x. Š≤≤≤≤ × ≤ „Š„„× Š„× „× × × Š× ≤≤ × ≤ „v.
°≤ • 扩增试剂盒购自华美公司 o°≤ • 仪为
美国 ≥× • „× „Š∞‘∞ 公司的 • ²¥²¦¼¦¯ µ¨
Š• „⁄Œ∞‘×2ws型微电脑自动基因扩增仪 ∀
#|zx# 中国中药杂志 t||z年第 uu卷第 ts期
表 t 样品材料
样品 样品来源 产地 备注
t梅花鹿k毛l 昆明圆通动物园 引种自黑龙江省 {s年代引种
u马鹿k毛l 昆明圆通动物园 引种自黑龙江省 {s年代引种
v水鹿k毛l 云南省盈江县养鹿场 引种自盈江县野外 ys年代引种
w鹿鞭 云南省药材公司 购自吉林
x鹿茸k片l 昆明市场 不详
y马鹿k血l 云南省盈江县养鹿场 引种自盈江县野外 ys年代引种
z梅花鹿k血l 昆明科技园养鹿场 引种自吉林省 t||w年引种
{牛鞭 昆明屠宰场 云南省红河州 ys ε 干燥
|驴鞭 昆明屠宰场 云南省元谋县 ys ε 干燥
反应系统体系为 xsΛ¯ o内含 us°°²¯r ×µ¬¶2
‹≤ k¯³‹ | 1 sl ~tss °°²¯ r Ž≤¯ ~v °°²¯ r 
ª≤ u¯ ~ s1u°°²¯r §‘×° ~ s1w h …≥„ ~
s1wΛ°²¯r引物 ~xs±ª⁄‘„ ~uΛפ´ ⁄‘„ 聚合
酶 ∀最后用 usΛ¯ 石蜡油覆盖 ∀每个循环过程
为 |x ε 变性 ys¶~复性k温度因样品而异 }梅花
鹿 !血和鹿鞭为 xy ε ~鹿茸为 xu ε ~马鹿和水鹿
毛为 ww ε ~牛鞭和驴鞭为 xw ε lys¶~zu ε 延伸
ys¶∀反应前在 |x ε 预变性 uss¶~ws个循环结
束后在 zu ε 延伸 vss¶∀每次 °≤ • 反应均设一
个阴性k以 §§‹u’ 代替模板l对照 ∀扩增完毕
后 o取 °≤ • 产物 wΛ¯ o以 u h琼酯糖凝胶电泳检
测 o拍照k见图 tl ∀
图 t 几种样品 °·⁄‘„ ≤¼·p ¥vsz片段 ⁄‘„扩增图
 q °¤® s q空白 t1 梅花鹿毛 u1 马鹿毛
v1 水鹿毛 w1 鹿鞭 x1 鹿茸
y1 马鹿血 z1 梅花鹿血 {1 牛鞭 |1 驴鞭
11213 °≤ • 产物回收 以 u h低熔点琼酯糖
k美国 ƒ  ≤l凝胶k内含 s qxΛªr°¯ 溴化乙锭l电
泳分离 °≤ • 产物 o割取含目标 ⁄‘„ 片段的胶
条 o置 ∞³³¨ ±§²µ©管中 oy{ ε 水浴中加热 x°¬±~
胶融后立即加入等体积水饱和酚混匀 o振摇
tx°¬±后 otusssª离心 ts°¬±o取上清液加氯仿
2异戊醇kuwΒtlxssΛ¯ o振摇 ts°¬±otusssª离心
ts°¬±o取上清液加 trts体积 ts  ‘‹w„¦和两
倍体积的 p us ε 无水乙醇混匀 o置 p us ε 冰箱
过夜 ~取出后 otusssª离心 ts°¬±o弃上清液 o加
zx h的乙醇洗涤沉淀 otusssª离心 u°¬±o弃上
清液 o沉淀置 vz ε 温箱中 u ∗ v«至干燥后 o加
×∞液k³‹{ qsltwΛ¯ 溶解后置 p w ε 冰箱中 o作
为序列分析的模板备用 ∀
11214 ⁄‘„序列分析 用 ≥¤±ª¨µ≈y 的双脱氧
链终止法测定 ⁄‘„ 序列 ∀序列分析引物为
tw{wt o采用美国 ˜≥… 公司的 ≥¨´ ∏¨ ±¤¶¨u1s
测序试剂盒kzszzsl及方法 o以美国 ⁄²³²±§公
司放射性同位素 Αvx≥2§„×°kzvw‹|ysxl作为标
记 o经干燥的测序胶 o以 ÷ 光片显影 x天后冲
洗 o以手动式序列分析仪读片 o得约 tzv个碱基
的 ⁄‘„序列k见表 ul ∀
11215 分子系统树的构建 为确定相应 ⁄‘„
序列的/分类0位置 o运用 °„ ˜°v1t qt软件k简
约法l对序列数据进行系统学分析 o以人的序列
为外群构建分子系统树 o并采用/ …²²·¶·µ¤³0方
法对系统树分支置信度进行评价k见图 ul ∀
2 结果与讨论
211 从图 t可见所有样品的目标 ⁄‘„ 均能
被扩增 o扩增片段约在 vss¥³的位置 ~空白对照
无扩增片段 o表明扩增过程中没有外源性 ⁄‘„
的污染 ∀扩增过程中的复性温度不同 }水鹿ku
个体l !马鹿ku个体l毛的 ⁄‘„ 的复性温度比
梅花鹿大约低 ts ε o在此条件下 ⁄‘„ 才能够
被扩增 o但以相同的引物测定序列时 o总得不到
#s{x# 中国中药杂志 t||z年第 uu卷第 ts期
好的结果 ∀提示水鹿和马鹿的 °·⁄‘„ 此段序
列k尤其是引物位置l可能有变异 ∀
图 u 由简约法k°„ ˜°v1t1tl构建的
几种样品的分子系统树
2 1 2 从表u可见 o以tw{wt测得的不同来
源 !产地 !个体 !取样部位的梅花鹿⁄‘„序列
tzv¥³无差异 o而产于东北的鹿鞭的此段序列
与梅花鹿完全一致 o提示此鹿鞭是梅花鹿的鹿
鞭 ∀而产地不详的/鹿茸0的此段序列出现 tv
个碱基的变异 o其中有 y个颠换 z个转换 o提示
此/鹿茸0不是梅花鹿的鹿茸 ~考虑到其 °≤ • 的
退火温度与水鹿和马鹿的不同 o怀疑其也不是
水鹿和马鹿的鹿茸 ∀牛鞭的此段序列与梅花鹿
有明显的不同 o有 ux碱基的变异 o其中有 {个
颠换 tz个转换 o其与报道≈ts 的水牛序列基本
一致 ∀驴鞭的此段序列与梅花鹿也有明显的差
异 o有 wx个碱基的变异 o其中有 uy个颠换 t|
个转换 ∀几种样品的所测序列与录入的人序列
不同 o表明没有人 ⁄‘„ 的污染 ∀除梅花鹿血
外 o每份样品取两个不同个体进行试验 o同种样
品所测系列完全相同 o提示此方法稳定性较好 ∀
表 u 几种样品 °·⁄‘„2¦¼·¥区 tzv¥³片段序列排序图
样 品 ts us
q q
梅花鹿血 × „ „ ≤ „ Š Š ≤ ≤ × „ × × ≤ ≤ × „ Š ≤ „ „ × „ ≤ „
梅花鹿毛 q q q q q q q q q q q q q q q q q q q q q q q q q
鹿 鞭 q q q q q q q q q q q q q q q q q q q q q q q q q
鹿 茸 q q q q q q q q q q q q q q q q q q q ≤ q q q q q
驴 鞭 q ≤ q q q q q q q q q q q q q q q q q × q q q q q
牛 鞭 q ≤ q q ≤ q q q q q q q q q q q q q q q q q q q q
水 牛 q ≤ q q ≤ q q q q q q q q q q q q q q q q q q q q
人 ≤ ≤ q q q q q „ q q q q q q q q q q q ≤ q q Š q q
样品 vs ws xs
q q q
梅花鹿血 ≤ × „ × „ ≤ „ × ≤ ≤ Š „ ≤ „ ≤ „ „ × „ „ ≤ „ Š ≤ „
梅花鹿毛 q q q q q q q q q q q q q q q q q q q q q q q q q
鹿 鞭 q q q q q q q q q q q q q q q q q q q q q q q q q
鹿 茸 q q q q q q q q q × q q q × q q q q q q q q q × q
驴 鞭 q q q ≤ q q q q q „ q q q q q × q ≤ q q q × q q q
牛 鞭 q q q ≤ q q q q q q q q q q q q q ≤ q q q q q q q
水 牛 q q q ≤ q q q q q q q q q q q q q ≤ q q q q q q q
人 q q q ≤ × q q ≤ q „ q q q Š q ≤ × ≤ q q q ≤ q q ≤
样品 ys zs
q q
梅花鹿血 × × ≤ × ≤ ≤ × ≤ „ Š × ≤ „ ≤ × ≤ „ × „ × ≤ × Š ≤ ×
梅花鹿毛 q q q q q q q q q q q q q q q q q q q q q q q q q
鹿 鞭 q q q q q q q q q q q q q q q q q q q q q q q q q
鹿 茸 q q q q q q q q q q q q q q q q q ≤ q q q q × q q
驴 鞭 q q q q q q „ × ≤ ≤ „ Š × q „ q q q q q „ q ≤ × Š
牛 鞭 q q q q q q q q × q q q Š q ≤ q q ≤ q q q ‘ ‘ ‘ ≤
水 牛 q q q q q q q q × q q q Š q ≤ q q ≤ q q q q q q ≤
人 q q × q q „ q q q „ q q Š q ≤ q q ≤ q q q „ ≤ × ≤
#t{x# 中国中药杂志 t||z年第 uu卷第 ts期
续附表
样品 {s |s tss
q q q
梅花鹿血 Š „ Š „ ≤ „ × ≤ „ „ „ × „ × Š Š ≤ × Š „ „ × × „ ×
梅花鹿毛 q q q q q q q q q q q q q q q q q q q q q q q q q
鹿 鞭 q q q q q q q q q q q q q q q q q q q q q q q q q
鹿 茸 q q q q q Š q q q q q ≤ × „ q q q q q q q q q q q
驴 鞭 ≤ ≤ q q Š q Š × q q ≤ q q q q q „ q q q q ≤ q q ≤
牛 鞭 q Š ‘ ‘ q Š q Š q q ≤ q q q q q „ q q q q q q q q
水 牛 q Š q q q Š q Š q q ≤ q q q q q „ q q q q q q q q
人 q q q q q Š q „ q q × q q q q q q q q q q q ≤ q q
样品 tts tus
q q
梅花鹿血 ≤ × Š „ × „ ≤ „ ≤ „ ≤ „ × Š ≤ „ „ „ ≤ Š Š „ Š ≤ „
梅花鹿毛 q q q q q q q q q q q q q q q q q q q q q q q q q
鹿 鞭 q q q q q q q q q q q q q q q q q q q q q q q q q
鹿 茸 q ≤ q q q q q q q q q q ≤ q q q q q q q q q q q q
驴 鞭 „ ≤ ≤ Š q q q q × Š q q ≤ q q × q q q q q q q q q
牛 鞭 × ≤ q q q q q q × q q q ≤ q q q q q q q q q q q ×
水 牛 × ≤ q q q q q q × q q q ≤ q q q q q q q q q q q ×
人 q ≤ q ≤ q q q ≤ × × q q ≤ q q ≤ q q × q q ≤ q q ≤
样品 tvs tws txs
q q q
梅花鹿血 × ≤ „ „ × „ × × ≤ × × ≤ „ × ≤ × Š ≤ × × „ × „ ≤ „
梅花鹿毛 q q q q q q q q q q q q q q q q q q q q q q q q q
鹿 鞭 q q q q q q q q q q q q q q q q q q q q q q q q q
鹿 茸 q q q q q q q q q q q q q q q q q q q q q q q q q
驴 鞭 q q q q q q q q q q q × q q q q q q q q q q q q q
牛 鞭 q q q q q Š q q × q q q q q q q q ≤ q q q q q × q
水 牛 q q q q q Š q q × q q q q q q q q ≤ q q q q q × q
人 q q q q q q q q q q q × q q q q q q ≤ q ≤ q × q ≤
样品 tys tzs
q q
梅花鹿血 × „ ≤ „ ≤ Š × „ Š „ Š ≤ Š „ Š Š „ „ × „ × „ ≤
梅花鹿毛 q q q q q q q q q q q q q q q q q q q q q q q
鹿 鞭 q q q q q q q q q q q q q q q q q q q q q q q
鹿 茸 q q q q q q q q q q q q q q q q ≤ q q q q q q
驴 鞭 q q q q q q q q q Š „ Š ≤ Š „ q × q q q ≤ q q
牛 鞭 q q q q q q q q q Š „ q q q q q ≤ q q q q q q
水 牛 q q q q q q q q q Š „ q q q q q ≤ q q q q q q
人 q q q q q „ q ≤ q Š q q q q q q ≤ ≤ q q q q ×
注 }/ q0者为相同的序列位点 ~/ ‘0者为无法判定的序列位点
213 图 u为根据几种样品的 ⁄‘„ 序列构建
的分子和系统树 o从图中可见梅花鹿k鹿鞭l与
鹿茸被聚在一支上 o提示样品/鹿茸0在亲缘关
系上比较接近梅花鹿 o可能是鹿科某种动物的
/茸0 ~鹿和牛关系相对于驴较近 o这与形态分类
学≈tt k驴属奇蹄目 o而鹿 !牛同属偶蹄目l相符
合 ∀从以上结果可见用微量法提取 ⁄‘„ 并测
定其序列鉴定鹿鞭和鹿茸是可行而准确的 ∀
°·⁄‘„作为母系遗传的大分子 o是研究种
内及种以上系统分类的有力的工具≈u  ∀动物
#u{x# 中国中药杂志 t||z年第 uu卷第 ts期
药材伪品涉及到不同的科 !属或种 o测定药材对
应物种 °·⁄‘„中的一段保守系列作为标准序
列贮存 o就象贮存药品的红外光谱一样 o有疑问
的药材 o只需测定其 °·⁄‘„ 的这一段序列 o与
标准序列作比较 o如果序列吻合则是该物种 o反
之则不是 o就可方便地作出结论 ∀随着分子生
物学技术的高速发展及 ⁄‘„ 序列自动分析仪
的普及 o使 ⁄‘„ 系列分析的速度提高而成本
降低 o有利于将此技术引入药材的检验中 ∀这
可能是今后提高药材检验技术的一个研究方
向 ∀
3 参考文献
t ‹¬±ª∏¦«¬• Š ·¨¤¯ q‘¤·∏µ¨ ot|{w ~tu }u{u
u ‹¬±ª∏¦«¬• Š ·¨¤¯ q  ²¯ ot|{z ~ux }u{v
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tt 谭邦杰 1 哺乳动物分类目录 1 北京 }中国医药科技出版
社 ot||u }v|x
tu 宿兵等 1 中国科学 ot||y }uykxl }wtw
致谢 中国昆明动物研究所细胞与分子进化开放
研究试验室的吴春花 !陈永久 !朱春玲 !齐堇等同志在
技术上给予帮助及云南省药品检验所的踞健 !金永清
同志给予的支持 ∀
t||y ) ts ) ux收稿
⁄‘„分子遗传标记鉴别
在生药鉴定中的应用前景 3
王义权 徐珞珊 徐国钧
k中国药科大学中药学院生药研究室 南京 utsss|l
周开亚
k南京师范大学生物系 南京 utss|zl
摘要 概述了 ⁄‘„分子遗传标记技术在生药鉴别中的理论依据 o并综述了该技术在生药鉴定中的
应用情况和实际应用中需注意的问题 o展望了 ⁄‘„分子遗传标记鉴别在生药鉴定中的前景 ∀
关键词 ⁄‘„ 分子遗传标记 生药鉴定
我国药材资源丰富 o据统计有 t1u万余种 o
其中药用动植物占 || h ≈t  ∀现行使用的中药
材许多品种来源复杂 o互混 !互代现象屡有可
见 ∀近年来 o由于经济利益的驱使 o药材伪 !混
品种的数量有增无减≈u  ∀为确保中药使用安
全 !有效 o对各种药材进行准确地鉴定显得十分
重要 ∀传统上是用经典的形态分类和解剖学特
征来进行生药品种的鉴别 o这种以形态学为基
础的鉴别方法有着简便 !易行等优点 o今后仍将
不失为一种行之有效的生药鉴别方法 ∀但有的
品种 o特别是动物药材或经过多道工序加工后
的药材 o以及中药复方制剂中用药组分的鉴别
3 国家自然科学基金 ‘²1v|xzs{yx ~中国博士后科学
基金资助项目 t||y ou号
#v{x# 中国中药杂志 t||z年第 uu卷第 ts期