全 文 ：中国生态农业学报 2015年 4月 第 23卷 第 4期
Chinese Journal of Eco-Agriculture, Apr. 2015, 23(4): 441−446


* 国家自然科学基金项目(30972136)资助
** 通讯作者: 韩正晟, 主要研究方向为农业机械化工程技术与装备、机械化耕作理论与技术。E-mail: hanzhengsheng@gsau.edu.cn
王仪明, 主要研究方向为植物生理生态。E-mail: lilybright1129@163.com
收稿日期: 2014−09−25 接受日期: 2015−01−27
http://www.ecoagri.ac.cn
DOI: 10.13930/j.cnki.cjea.141117
高温胁迫对淮阴苜蓿差异蛋白表达及生理的影响*
王仪明1 李伟民2 雷艳芳3 魏臻武3 韩正晟1**
(1. 甘肃农业大学农学院 兰州 730070; 2. 许昌学院 许昌 461000; 3. 扬州大学草业科学研究所 扬州 225009)
摘 要 为进一步了解紫花苜蓿在高温胁迫下的生理变化和相关差异蛋白表达情况 , 本研究以淮阴苜蓿
(Medicago sativa L. cv. Huaiyin)为材料, 以 25 ℃为对照, 对 30 ℃、35 ℃和 40 ℃不同高温胁迫下, 淮阴苜蓿不
同时期(0 h、0.5 h、1 h、4 h、12 h和 24 h)幼苗叶片的电导率、丙二醛(MDA)、细胞活力的动态变化进行监测,
并进一步对 35 ℃和 40 ℃高温处理 24 h的幼苗叶片差异表达蛋白进行筛选、分析和鉴定研究。结果发现, 淮
阴苜蓿在 35 ℃和 40 ℃高温下, 生长 0.5 h, 叶片的电导率含量开始急剧上升, 1 h后电导率下降, 并随着处理时
间的延长, 电导率变化趋缓; 生长 1 h时, 叶片的MDA含量较高, 4 h后MDA含量平缓下降; 细胞活力随着时
间的延长总体表现出下降的趋势。差异蛋白点筛选分析结果显示, 在 35 ℃处理 24 h时, 有 27个点存在显著
差异, 其中 19个点是上调的, 与对照图谱相比, 新增了 5个特殊的蛋白点。在 40 ℃处理 24 h时, 有 51个点
存在显著差异, 其中 40个点是上调的, 与对照图谱相比, 新增了 11个特殊的蛋白点。对 40 ℃时 51个蛋白点
进行二级质谱鉴定发现, 20 kD chaperonin、Hsp70、Hsp23和 Hsp17这 4个蛋白与防御机制有关, 说明 40 ℃诱
导产生更多的防御蛋白, 对膜系统损伤起到一定的修复功能。
关键词 淮阴苜蓿 高温胁迫 生理指标 蛋白质组 二级质谱 热激蛋白
中图分类号: Q945.78 文献标识码: A 文章编号: 1671-3990(2015)04-0441-06
Effects of high temperature stress on differentially expressed proteins
and physiological characteristics of alfalfa
WANG Yiming1, LI Weimin2, LEI Yanfang3, WEI Zhenwu3, HAN Zhengsheng1
(1. College of Agronomy, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China; 2. Xuchang College, Xuchang 461000, China;
3. Institute of Grassland Sciences, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China)
Abstract The Medicago sativa L. cv. Huaiyin variety of alfalfa was used to determine the physical changes and related differences
in protein expressions of alfalfa in response to heat stress. Electrical conductivity, malonaldehyde content and cell activity were
measured in alfalfa seedlings at 25 ℃, 30 ℃, 35 ℃ and 40 ℃ in combination with different durations of heat stress (0 h, 0.5 h,
1 h, 4 h, 12 h and 24 h). In addition, alfalfa seedlings treated at 35 ℃ and 40 ℃ for 24 h were used to analyze differentially
expressed protein. The results showed that electrical conductivity of the test samples increased sharply after treatment at 35 ℃ and
40 ℃ for 0.5 h, but declined for treatment durations exceeding 1 h. However, malonaldehyde content of the samples increased for
treatment durations exceeding 1 h but gradually declined after 4 h. Cell activity of test samples declined with increasing treatment
duration. Screening analysis of the differences in proteins showed 27 significantly different spots after treatment at 35 ℃ for 24 h,
19 of which spots were raised and 5 were new. After treatment at 40 ℃ for 24 h, 51 significantly different spots were observed —
40 out of the 51 spots were raised and 11 were new. Secondary mass spectrum analyses indicated that 4 proteins — 20 kD
chaperonin, Hsp70, Hsp23 and Hsp17, were only observed in samples at 40 ℃ for 24 hours. This suggested that the 4
proteins correlated with heat stress defense mechanisms, the samples produced more defense proteins at 40 ℃ to repair damage to
alfalfa seedling membranes.
Keywords Medicago sativa L.cv. Huaiyin; High temperature stress; Physiological index; Proteome; Secondary mass
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spectrum; Heat shock protein
(Received Sep. 25, 2014; accepted Jan. 27, 2015)
我国紫花苜蓿(Medicago sativa L.)栽培区主要
在北方, 其生长最适温度 25 ℃左右, 南方地区由于
高温高湿等原因 , 苜蓿生产受到严重影响 [1], 而淮
阴苜蓿经过多年栽培驯化已成为适应江淮流域的地
方优良苜蓿品种, 其具有生长发育快、再生性好、
干物质产量高、耐热性强等特点[2]。近年来, 随着畜
牧业的快速发展, 南方地区对优质苜蓿需求量增大,
胡化柏等[3]认为发挥紫花苜蓿在南方地区栽培利用
价值, 有利于推动畜牧业的可持续发展。因此, 对淮
阴苜蓿耐热机制的研究是促进南方苜蓿产业发展的
首要任务。
目前, 国内苜蓿抗逆性机理的研究工作主要围
绕苜蓿品种的抗寒性、抗旱性和耐盐碱等部分生理
和分子指标方面开展[4−6]。苜蓿的耐热性研究主要集
中在形态指标、生理生化指标、生产性能指标、生
长发育指标等[7−8]。姜义宝等[9]发现高温降低了紫花
苜蓿中叶绿素的含量; 刘大林等[10]研究发现, 在夏
季高温胁迫下紫花苜蓿叶片中 MDA 和过氧化物酶
含量显著增加; 莫亿伟等[11]发现高温胁迫导致紫花
苜蓿光合作用显著下降; 张鹤山等[12]通过研究 19个
紫花苜蓿品种的耐热性发现夏季高温不仅降低了紫
花苜蓿的植株高度和产草量, 而且对许多农艺性状
和生产性能的发挥有抑制作用。以上学者均未对淮
阴苜蓿进行研究, 南方地区紫花苜蓿品种在高温胁
迫下的生理过程尚未完全了解。
比较蛋白质组学 (comparative proteomics)技术
是常用的一种研究蛋白质表达差异的策略, 近年来
广泛用于研究水稻(Oryza.sativa L.)、玉米(Zea mays
L.)、木薯(Manihot esculenta Crantz)、牧草等植物叶
片、根系等不同组织的抗逆性蛋白质表达差异[13−19]。
目前, 蛋白质的变化与植物耐热性关系方面的研究
取得长足进展[20], 但是利用比较蛋白质组学技术研
究紫花苜蓿耐热性的报道较少。赵雁等[21]对高温胁
迫下 3 种紫花苜蓿胞质蛋白质的降解情况进行了研
究。因此, 目前对于紫花苜蓿抗热过程的发生机制
缺乏较为深入的探讨。
本研究测定了不同高温胁迫下淮阴苜蓿电导
率、MDA含量和细胞活力的变化, 并利用比较蛋白
质组学技术手段, 对不同温度处理下淮阴苜蓿热激
蛋白差异表达进行了分析, 筛选出一系列特异表达
的蛋白, 为进一步了解淮阴苜蓿的耐热机理和抗热
苜蓿品种的研究提供理论依据。
1 材料和方法
1.1 试验材料
淮阴苜蓿(Medicago sativa L.cv. Huaiyin)苜蓿属,
蝶形花科, 多年生, 茎直立, 少数斜生, 为极早熟品
种, 适应南方湿热环境条件, 主要分布在江淮地区。
试验用淮阴苜蓿种子由全国畜牧总站种质资源中期
库提供。
1.2 试验设计
将淮阴苜蓿种子在流水下冲洗 20 min, 转入无
菌三角瓶中, 用无菌水冲洗 1 次, 用 70%酒精浸泡
45 s, 无菌水冲洗 3 次, 用 0.1%升汞浸 12~15 min,
无菌水冲洗 3~5 遍, 最后用无菌滤纸吸干水分, 放
在 Murashige和 Skoog培养基上, 在 20 ℃的暗室培
养 3 d。将发芽的淮阴苜蓿种子取出后放入生长室中
[25 , ℃ (60±15)%的相对湿度], 生长 1个月以后, 转
移到 13 cm×15 cm 盛有蛭石的花盆中, 幼苗生长 4
周后, 分别放在 30 ℃、35 ℃和 40 ℃的培养箱中高
温处理 0 h、0.5 h、1 h、4 h、12 h和 24 h, 取样用
于研究。以 25 ℃下生长植株作为对照, 所有处理均
设 3次重复。
1.3 测定内容与方法
1.3.1 生理指标测定
从每个处理中随机选取 16 片完全伸展的叶片,
3次重复, 分别用 0.8 cm直径的打孔器打孔, 将叶盘
放入离心管。采用电解质渗漏法测定相对电导率 ,
硫代巴比妥酸法测定 MDA 含量, TTC(氯化三苯基
四氮唑称为 2,3,5-Tripheny Tetrazoliumchloride)法测
定细胞活力。
1.3.2 差异蛋白检测
利用双向电泳检测差异蛋白。随机选取 12株淮
阴苜蓿幼苗作为一组处理, 3次重复, 分别在 35 ℃和
40 ℃处理 24 h后, 摘取 0.5 g叶片, 25 ℃生长的植株
作为对照, 采用 TCA-丙酮沉淀法提取总蛋白[22]。蛋
白浓度测定使用 Bradford 法, 考马斯亮蓝法染色,
凝胶使用 Image Scanner 白光扫描仪进行透射扫描,
图像用 PDQuest 8.0.1 软件进行分析, 选择 1.5 倍作
为差异蛋白选择的标准。
1.3.3 酶解和质谱分析
对选择的蛋白点, 采取手动方式在 CBB染色的
胶上取点, 用 milli-Q 水清洗 2 次, 每次 15 min, 然
后在 25 mmol·L−1碳酸氢铵与乙腈比例为 1︰1的溶
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液中脱色, 直到胶粒颜色脱去为止, 每次 30 min。然
后胶点在乙腈中脱水 2次, 每次 15 min, 直到胶粒发
白。胶粒在烘箱中 60 ℃干燥。干燥后每管加入 10 μL
12.5 ng·μL−1胰蛋白酶消化液 , 使胶粒重新吸胀。
冰浴 45 min, 每管加入 5 μL 25 mmol·L−1碳酸氢铵 ,
37 ℃过夜。将上清转到新的离心管中, 胶粒用 20 μL
含有 1%三氟甲酸的 50%的乙腈溶液抽提 3次, 每次
20 min, 混合液真空干燥。将肽段用 3 μL 5%的甲酸
溶液溶解, 用来做 MALDI-TOF-MS分析。
所有获得的蛋白样品均采用 5800 MALDI TOF/
TOF (Applied Biosystem,Framingham, MA,USA)进行
分析。运用二级质谱进行蛋白的质谱分析, 在进行
一级质谱分析后, 选取每个样品中检测到最多的 20
个离子片段用来做二级质谱分析, 能量 2 kV。搜索
引擎选用 Matrix Science 对获得的质谱结果进行分
析, 肽段搜索使用 NCBInr蛋白数据库, 搜索参数如
下: 分类选择 Viridiplantae(Green Plants), 肽段差异
范围为±1.2 Da, 串联质谱差异范围为±0.6 Da, 肽段
允许一个不完全的破裂, 甲硫氨酸氧化是可选蛋白
修饰。
1.4 数据分析
统计分析通过单尾测验(ANOVA)和多重比较对
不同组数据进行显著性检验。在 P<0.05水平上进行
显著性检验。
2 结果与分析
2.1 不同高温和时间处理对淮阴苜蓿生理指标的
影响
测定不同处理下样品的外渗液电导值的结果
(图 1)表明, 在 0 h、0.5 h、1 h、4 h、12 h和 24 h
这 6个时间点, 25 ℃时的叶片电导率无显著差异。
在 30 ℃、35 ℃和 40 ℃处理不同时间, 叶片电导率
的变化存在显著差异。在 0.5 h的样品中, 叶片的电
导率急剧上升, 1 h后电导率下降, 并随着处理时间
的延长电导率变化趋缓。在 40 ℃处理 24 h的样品
电导率与 30 ℃和 35 ℃处理的样品相比较低, 这可
能与诱导更多的防御蛋白有关。在 30 ℃、35 ℃和
40 ℃的温度下, MDA浓度均显著高于对照水平, 随
着胁迫时间的延长, MDA含量呈先增高后降低的趋
势。35 ℃和 40 ℃处理 1 h时的试验材料显示较高的
MDA含量, 4 h后 MDA含量平缓下降(图 1)。TTC
分析的结果显示, 不同温度下细胞对 TTC 的还原能
力表现出不同的变化趋势。30 ℃处理的植株中, 细
胞对 TTC 的还原能力呈现先增加后降低, 然后再升
高的趋势。35 ℃和 40 ℃处理的植株, 细胞对 TTC
的还原能力总体表现出下降趋势(图 1)。

图 1 高温对淮阴苜蓿电导率、MDA含量和细胞活力
的影响
Fig. 1 Effects of high temperature on electrical conductivity,
MDA content and cell viability (TTC reduction) of Medicago
sativa L. cv. Huaiyin
2.2 双向电泳图谱的软件分析及差异蛋白点筛选
双向电泳分析结果表明, 与对照(图 2A)相比,
在 35 ℃处理 24 h的植株中, 有 27个点表现出显著
差异, 其中 19个点(2、3、5、10~13、15、20、22~24、
30、33、40、41、43、44 和 49)是上调的(图 2B)。
在 40 ℃处理 24 h的植株中, 有 51个点表现出差异,
其中 40个点(1~3、5~7、9~21、23、24、27~38、40、
41、43~45、49和 50)是上调的(图 2C)。与对照植株
相比, 5 个特殊的蛋白点(8、10、11、41 和 43)出现
在 35 ℃处理 24 h的植株中, 有 11个特殊的蛋白点
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(6、16~19、27、29、32、34~36)第 1次出现在 40 ℃
处理 24 h的植株中。

图 2 不同高温处理(A: 25 ℃; B: 35 ℃; C: 40 ℃)24 h淮
阴苜蓿叶片差异蛋白表达
Fig. 2 Differentially expressed proteins of Medicago sativa L.
cv. Huaiyin leaves after 24 h treated by different temperatures
(A: 25 ℃; B: 35 ℃; C: 40 ℃)
2.3 差异蛋白点的 MALDI-TOF-MS质谱分析
通过对淮阴苜蓿差异蛋白点的分析研究发现 ,
40 ℃处理 24 h, 1.5倍差异以上的蛋白点一共有 51
个。为了获得这些蛋白的功能信息 , 进一步通过
BLASTP 工具来分析它们与数据库中其他蛋白的同
源性, 来鉴定其功能。鉴定的蛋白与同源蛋白在氨
基酸序列上有超过 50%的相似性, 证明它们可能有
相似功能[23]。通过二级质谱鉴定, 成功鉴定出 29个
点, 根据 Bevan 等[24]描述的功能目录对鉴定的蛋白
进行分类发现, 与防御机制有关的蛋白点共 12个。
这 12个蛋白点与第 1次出现在 40 ℃处理 24 h的植
株中 11个蛋白点相比 , 有 5个蛋白点完全一致(6、
16、27、32、34)。这 5个蛋白点对应的蛋白名称分
别为 20 kD chaperonin(32)、Hsp70(6)、Hsp23(16、
27)和 Hsp17(34), 说明这 4 个蛋白与淮阴苜蓿抵御
高温密切相关。
3 讨论与结论
在正常生长情况下, 植物体内各项生理进程都
处于稳定状态, 当植物遭受高温胁迫后, 各项生理
进程受到高温影响而改变。细胞膜是高温逆境最直
接的受体, 因此膜系统也是植物细胞最易受高温伤
害的部位。电导率升高说明细胞膜的伤害已经发生,
MDA积累量越大, 细胞受损程度越重。本研究发现,
淮阴苜蓿在 35 ℃和 40 ℃高温下, 生长 0.5 h, 叶片
的电导率开始急剧上升, 1 h后电导率下降, 并随着
处理时间的延长变化趋缓 ; 生长 1 h 时 , 叶片的
MDA 含量较高 , 4 h 后 MDA 含量平缓下降 ; 细胞
活力随着时间的延长总体表现出下降趋势。这表
明高温导致淮阴苜蓿膜系统受到了损伤 , 这与姜
义宝等 [25]的研究结果一致。植物对胁迫具有一定的
抵御能力, 在处理后期电导率和 MDA 含量略有降
低, 这表明高温诱导淮阴苜蓿的防御机制, 从而减
轻高温胁迫对植物的伤害, 这与林丽秀[26]研究结果
相似。与大多大田种植的苜蓿耐热方面的研究相比,
本试验选择实验室模拟高温 , 处理时间间隔较短 ,
研究结果反映了 0~24 h之间的生理变化。
应用比较蛋白质组学技术研究植物在逆境胁迫
下产生的差异表达蛋白, 将有助于从整体和动态的
蛋白质水平了解植物抗逆的分子机制[18]。本研究通
过蛋白质组学技术分析了不同高温胁迫下淮阴苜蓿
蛋白的差异表达。这些蛋白可以分为 7 类, 例如抗
氧化胁迫、信号转导、光合作用、蛋白降解和储存,
植物防御和代谢等。与对照相比, 在 35 ℃处理 24 h
时, 有 27 个点存在显著差异, 其中 19 个点是上调
的 , 与对照图谱相比 , 新增了 5 个特殊的蛋白点。
在 40 ℃处理 24 h时, 有 51个点存在显著差异, 其
中 40个点是上调的, 与对照图谱相比, 新增了 11个
第 4期 王仪明等: 高温胁迫对淮阴苜蓿差异蛋白表达及生理的影响 445


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特殊的蛋白点。不同的蛋白表达表明 35 ℃和 40 ℃
分别诱导了不同的防御机制。更多的蛋白差异出
现在 40 ℃处理的样品中 , 从而表现出更强的防御
能力。
二级质谱分析结果发现 20 kD chaperonin(32)、
Hsp70(6)、Hsp23(16、27)和 Hsp17(34)仅在 40 ℃处
理 24 h的植株中出现, 说明这 4个蛋白与淮阴苜蓿
抵御高温密切相关。Kuo 等 [27]研究发现 20 kD
chaperonin 是位于叶绿体中的一种辅伴侣蛋白, 它
通过相互影响来调节 FeSOD的活性, 单独的 20 kD
伴侣蛋白可以增强超氧化物歧化酶的活性。Hsp70
涉及新合成多肽的折叠和低聚反应, 同样, 它们也
涉及多聚体结构的组装和解体、蛋白输入、感受器的
运输和蛋白的修复[28]。Hsp70基因的过量表达可以
增强植物对高温和环境胁迫的抵抗能力 [29−30]。
Hsp23 和 Hsp17 隶属于小热激蛋白家族, 它们可以
恢复蛋白的状态, 维持细胞的动态平衡, 也可以作
为一个高温胁迫的生物标记, 在植物抗热性研究上
起着关键作用[31]。
通过分析不同高温胁迫下淮阴苜蓿生理变化 ,
研究发现高温会导致淮阴苜蓿膜系统损伤, 细胞活
力下降。随着胁迫时间延长, 植物会产生一系列防
御机制, 从而减轻胁迫产生的伤害。蛋白质组的研
究表明, 35 ℃和 40 ℃分别诱导不同种类的蛋白表
达, 这说明不同温度诱导植物不同的防御机制, 40 ℃
诱导更多与胁迫相关的蛋白, 从而表现出更强的防御
能力。通过二级质谱鉴定发现 20 kD chaperonin、
Hsp70、Hsp23 和 Hsp17 与淮阴苜蓿抵御高温密切
相关。
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