全 文 ：中国生态农业学报 2014年 4月 第 22卷 第 4期
Chinese Journal of Eco-Agriculture, Apr. 2014, 22(4): 401−407


* 中国和意大利甲基溴替代技术合作项目、国家自然科学基金项目(40871131, 31240009)资助
** 通讯作者: 曹坳程, 主要从事土壤消毒使用技术和外来入侵植物控制方面的研究。E-mail: caoac@vip.sina.com
燕平梅, 主要从事生态学研究。E-mail: yanpingmei@sohu.com
收稿日期: 2013−10−19 接受日期: 2014−02−10
DOI: 10.3724/SP.J.1011.2014.31023
土壤熏蒸剂对土壤硝化、反硝化作用的影响*
燕平梅 1,2 高贵喜 1 曹坳程 2** 张 腾 1 李 园 2 王秋霞 2 郭美霞 2
(1. 太原师范学院生物系 太原 030012; 2. 中国农业科学院植物保护研究所 北京 100193)
摘 要 采用化学分析和变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术, 以大田威百亩、棉隆、溴甲烷、硫酰氟熏蒸 100 d土
壤为研究对象, 探究土壤熏蒸对土壤硝化活性、反硝化活性及 amoA基因型硝化型细菌、nirS基因型反硝化细
菌群落结构影响。研究表明, 威百亩、棉隆、硫酰氟熏蒸剂处理下, 土壤硝化活性与对照无显著差异; 而溴甲
烷处理的硝化活性比对照降低 13.19%, 差异显著(P<0.05); 熏蒸剂之间土壤硝化活性无显著差异。4种熏蒸剂
之间以及与对照之间土壤反硝化活性无显著差异。4种熏蒸剂中溴甲烷处理土样 amoA型硝化细菌多样性指数、
均匀度显著低于对照土样和其他 3 种熏蒸剂处理土样; 而丰富度指数无显著差异。威百亩、棉隆和硫酰氟熏
蒸土样之间及与对照之间 amoA 型硝化细菌 3 种生态指数无明显差异。4 种熏蒸剂处理土壤 nirS 型反硝化细
菌多样性指数、均匀度与对照无显著差异(P＞0.05); 熏蒸剂之间存在显著差异(P<0.05)。研究表明, 溴甲烷对
土壤硝化活性的抑制是通过抑制 amoA型硝化细菌的多样性而实现, 其他 3种熏蒸剂对土壤硝化活性无显著影
响。4种熏蒸剂对土壤反硝化活性无显著影响。
关键词 土壤熏蒸剂 硝化作用 反硝化作用 硝酸还原酶 反硝化还原酶 amoA型硝化细菌 nirS型反
硝化细菌
中图分类号: S158 文献标识码: A 文章编号: 1671-3990(2014)04-0401-07
Effects of soil fumigants on soil nitrification and denitrification
YAN Pingmei1,2, GAO Guixi1, CAO Aocheng2, ZHANG Teng1, LI Yuan2, WANG Qiuxia2, GUO Meixia2
(1. Department of Biology, Taiyuan Normal University, Taiyuan 030012, China; 2. Institute of Plant Protection, Chinese Academy of
Agricultural Sciences, Beijing 100193, China)
Abstract Soil fumigants have been comprehensively used to control nematodes, weeds, soil-borne pathogens and insects in high
value (cash) crop plantations. Though ideal pesticides are toxic only to target organisms, fumigants are a class of pesticides with
broad biocidal ability thus affecting many non-target soil organisms, including nitrifying and denitrifying bacteria. It may results in
changed soil nitrification and denitrification. The aim of this study was to explore the proper application measures of fumigants by
quantifying the effects of different soil fumigants on soil nitrification and denitrification in laboratory and field conditions. To
investigate the effects of different soil fumigants on soil nitrogen transformation processes of nitrification and denitrification,
chemical analysis and degeneration gradient gel electrophoresis technique (DGGE) were used. Soils fumigated with metham-sodium,
dazomet, methyl bromide and sulfuryl fluoride for a period of 100 d were sampled and the effects of fumigation on soil nitrification
and denitrification activities determined along with the community structures of amoA nitrification bacteria and nirS denitrifying
bacteria. The results showed that compared with the control, no significant differences existed in nitrification activity of soils
fumigated with metham-sodium, dazomet, sulfuryl fluoride. However, nitrification activity of soils fumigated with methyl bromide
decreased by 13.19%, which was significant (P < 0.05) compared with the control. No significant differences existed among the four
fumigants in terms of observed soil nitrification activity. There was also no significant difference in soil denitrification activity
among the four fumigants and the control. Diversity index and evenness index of amoA nitrifying bacteria community of soil
fumigated with methyl bromide were significantly lower than those of soils fumigated with the other three fumigants and the control.
Richness index was not significantly different among all the treatments. The three indexes were not significantly different among
402 中国生态农业学报 2014 第 22卷


soils treated with metham-sodium, dazomet, sulfuryl fluoride and the control. Diversity index, evenness index and richness index of
nirS denitrifying bacteria community were significantly different among the four fumigants, but not significantly different from those
of the control. The research results showed that the inhibition effect of methyl bromide on soil nitrification activity was achieved
through the inhibition of the diversity of amoA nitrifying bacteria community. The other three fumigants had no significant effect on
soil nitrification activity. Denitrification activity of soils was not significantly affected by the four fumigants.
Keywords Soil fumigant; Nitrification; Denitrification; Nitrate reductase; Nitrite reductase; amoA nitrifying bacteria; nirS
denitrifying bacteria
(Received Oct. 19, 2013; accepted Feb. 10, 2014)
为了减少土传病原包括真菌、细菌、线虫病原
菌及杂草和昆虫等的危害, 农业生产者在种植高价
值经济作物前对保护地进行土壤消毒处理。土壤消
毒在极大程度上杀死病原微生物的同时也会对土壤
中的非目标微生物的组成及活性产生影响 [1−4], 进
而改变整个土壤生态系统的结构和功能, 特别是养
分转化过程[5]。土壤硝化−反硝化作用是氮素转化的
重要组成部分, 在保持土壤肥力等过程中发挥关键
的作用。研究土壤熏蒸剂对土壤硝化、反硝化作用
的影响可为熏蒸处理后提高保护地土壤氮利用率提
供理论依据。
大量研究报道熏蒸处理会抑制土壤硝化作用。
如甲基溴和威百亩熏蒸后, 土壤硝化作用受到明显
抑制[6]。Cyanamid DD 95(1.3-二氯丙烯+1,3-二氯丙烷)
熏蒸土壤后至少3周内, 硝化作用都会受到抑制[7]。用
甲基溴及其替代品熏蒸土壤后, 硝化速率与对照相比
减少55%以上, 且一直持续到熏后37周还未恢复[1]。蒸
汽熏蒸后反硝化细菌数量减少85%, 反硝化细菌群
落结构受到破坏 , 反硝化细菌种群数量在熏蒸处
理后第13 d即恢复到对照水平。蒸汽熏蒸处理后酶
活性受到持续的抑制, 反硝化作用缓慢恢复[3]。颜冬
冬[8]研究报道氯化苦和棉隆熏蒸土壤后表现出明显
的促进土壤反消化作用过程; 而1,3-二氯丙烯、二甲
基二硫与对照之间没有显著差异。关于熏蒸剂对土
壤硝化、反硝化作用影响的研究报道是以实验室内
熏蒸土壤为研究对象, 为了探究熏蒸剂对室外土壤
的影响, 本文以土壤熏蒸剂威百亩、棉隆、溴甲烷、
硫酰氟为研究对象, 研究不同类型土壤熏蒸剂对土
壤硝化、反硝化作用的影响。试图提出土壤熏蒸剂
的合理施用方法, 为促进保护地农业生产的可持续
发展提供指导方法。
1 材料和方法
1.1 土壤处理及土壤样品
试验地为北京市通洲区潞城镇小营村的温室大
棚。前茬为番茄。于 2010年 8月 2日分别在 3个温
室大棚以威百亩、棉隆、溴甲烷、硫酰氟 50 g·m−2
的浓度采用覆 PE膜熏蒸法熏蒸, 以未熏蒸处理为对
照, 在 3个大棚中每个处理重复 3次, 每个处理面积
约 167 m2。半个月后揭取 PE膜, 定植黄瓜。在黄瓜
生长期未施用化学肥料。土壤样品采样时间为熏蒸
后 100 d(2010年 11月 22日), 每个重复采用对角线
取样法取 5~15 cm 土壤样品, 混合后保存于−20 ℃
和−80 ℃各一份备用。
1.2 测定方法
1.2.1 土壤反硝化和硝化作用活性
土壤中加入一定量的硝酸盐 , 经厌氧培养后 ,
由土壤硝酸根的消灭率代替测定反硝化作用发生的
含氮气体, 用以表示土壤的反硝化活性[9]。
向土样中加入一定量的铵态氮, 根据其在土样
中转化为NO3−-N或(NO3−+NO2−)-N占总矿态氮的百分
率计算土样中硝化率 [9], 用以表示土壤硝化活性。
(NO3−+NO2−)-N 测定采用连续流动分析仪法(INTEGRAL
Futura ALLIANCE INSTRUMENTS)。
1.2.2 土壤 NH4+-N、NO3−-N和微生物生物量氮含量
采用连续流动分析仪法 (INTEGRAL Futura
ALLIANCE INSTRUMENTS)测定土壤 NH4+-N、
NO3−-N含量[10]。
根据熏蒸土壤与未熏蒸土壤的有机氮量(NH4+-N)
的差值及转换系数, 计算土壤微生物生物量氮含量,
提取液中的氮采用茚三酮比色法测定[10]。
1.2.3 硝酸还原酶和亚硝酸还原酶活性测定
硝酸还原酶活性采用比色法测定的土壤反硝化
反应前后硝态氮差值求得[11]; 亚硝酸还原酶活性测
定是基于 NO2−-N与格里试剂反应所产生颜色的深度,
测定酶促反应前后 NO2−-N的变化[10]。
1.3 PCR-DGGE 方法分析 amoA 型硝化细菌和
nirS型反硝化细菌群落结构
1.3.1 土壤总 DNA的提取与检测
土壤总DNA的提取按照MO BIO公司生产的土
壤 DNA提取试剂盒步骤提取。DNA提取物用 2%胶
浓度的琼脂糖凝胶电泳检测。每个处理 3个重复, 然
后混合 DNA提取液, 保存于−20 ℃冰箱中备用。
1.3.2 nirS基因和 amoA基因的 PCR扩增和变性梯
度凝胶电泳(DGGE)
采用引物 Cd3aF-GC F 5′-GT(C/G)AACGT(C/G)
第 4期 燕平梅等: 土壤熏蒸剂对土壤硝化、反硝化作用的影响 403


AAGGA(A/G)AC(C/G)GG-3′和 R3cd 5′-GA(C/G)TTCGG
(A/G)TG(C/G)GTCTTGA-3′扩增土壤 nirS 基因[11]。
采用 amoA-F 5′-CTGGGAYTTCTGGMTKGACTG-3′和
amoA-R 5′-AGTARASYTTKCCRARRTACCACCA-3′扩
增土壤 amoA基因[12]。
取 PCR产物 20 μL进行 DGGE分析, 细菌的变
性剂梯度范围为 35%~50%, 200 V 60 ℃下电泳 4 h。
电泳后采用 SYBR Green对凝胶进行染色。从 DGGE
图谱胶切下目的条带, 以不带夹子的 nirS 引物作为
引物再次进行 PCR扩增。PCR扩增产物与 TA-克隆
体系的 T-Vector 载体连接形成重组质粒, 挑取阳性
克隆加 30%的甘油保藏在−70 ℃条件。阳性克隆使
用通用 T7/SP6序列为引物测定所有的序列反应。测
序由华大基因技术服务有限公司完成。
1.3.3 DGGE指纹图谱分析、群落结构计算和系统
学分析
DGGE 指纹图谱分析借助于 Bio-Rad 公司的凝
胶成像系统(Quantity One, Bio-Rad, USA)分析样品
电泳条带。群落结构和系统学分析采用下列指标 :
Shannon-Wiener多样性指数(H), H =−Σ(ni/N)ln(ni/N),
ni表示单一条带的峰面积, N为所有峰的面积。丰富
度指数(Margalef, R), R=S−1/lnN, S为某一泳道的总
带数。均匀度指数(Eveness, E), E=H/Hmax (其中
Hmax=lnS)。相似性指数(Cs), Cs(%)=[1−j/(a+ b−j)]×
100, j为两个处理间共有的条带数, a、b分别为两个
处理各自的条带数[13]。
1.3.4 nirS 基因和 amoA 基因序列的鉴别和系统发
育分析
测定每个阳性转化克隆菌 nirS 基因序列。将所
测的序列用 DNAMAN(Version4.0)软件去除两端的
载体序列, 用 CHECK CHEMERA 程序检测人工嵌
合序列并剔除。不同的序列用 BLAST 程序在
GenBank中搜索相似序列, 将相关序列用DNAMAN
(Version4.0)进行比对, 进行系统发育分析。
2 结果与分析
2.1 熏蒸剂对土壤硝化−反硝化作用的影响
威百亩、棉隆、溴甲烷、硫酰氟熏蒸剂对土壤
反硝化及硝化作用的影响如图 1 所示。从图中可以
看出, 4种熏蒸剂与对照及 4种熏蒸剂之间反硝化活
性无显著差异(P>0.05), 说明 4 种熏蒸剂处理土壤
100 d后土壤反硝化作用未发生显著变化。威百亩、
棉隆、硫酰氟熏蒸剂处理的土壤硝化活性与对照无
显著差异(P>0.05), 而溴甲烷处理比对照降低 13.19%,
差异显著(P<0.05), 4 种熏蒸剂的土壤硝化率间无显
著差异(P>0.05)。

图 1 4种熏蒸剂对土壤反硝化作用和硝化作用活性的影响
Fig. 1 Effects of soil fumigants on soil denitrification and
nitrification activities
2.2 熏蒸剂对土壤 NH4+-N、NO3−-N、微生物生物量
氮含量的影响
4种土壤熏蒸剂熏蒸土壤 100 d后土壤 NH4+-N、
NO3−-N、微生物生物量氮含量见图 2。不同熏蒸剂熏
蒸土壤的 NH4+-N、NO3−-N和微生物生物量氮含量无
显著差异(P>0.05), 与对照差异不显著(P>0.05)。说
明 4 种熏蒸剂熏蒸土壤 100 d 后土壤的 NH4+-N、
NO3−-N和微生物生物量氮含量未发生显著变化。

图 2 4种熏蒸剂对 NH4+-N、NO3−-N和微生物生物量氮含
量的影响
Fig. 2 Effects of soil fumigants on soil NH4+-N, NO3−-N and
microbial biomass nitrogen contents
2.3 熏蒸剂对土壤硝酸还原酶、亚硝酸还原酶活性
的影响
从图3可知, 威百亩、棉隆、硫酰氟、溴甲烷熏
蒸剂熏蒸土壤100 d后, 土壤硝酸还原酶和亚硝酸还
原酶活性无显著差异(P>0.05), 4种土壤熏蒸剂熏蒸
土壤与对照(未熏蒸土壤)差异也不显著(P>0.05)。说
明熏蒸剂熏蒸土壤100 d后土壤硝酸还原酶和亚硝
酸还原酶活性未发生显著变化。
404 中国生态农业学报 2014 第 22卷



图 3 4种熏蒸剂对土壤硝酸还原酶和亚硝酸还原酶活性
的影响
Fig. 3 Effects of four soil fumigants on soil nitrate reductase
and nitrite reductase activities
2.4 不同熏蒸剂对 amoA型硝化细菌 nirS型反硝化
细菌群落结构的影响
2.4.1 对 amoA型硝化细菌和 nirS型反硝化细菌相
似性的影响
威百亩、棉隆、溴甲烷、硫酰氟熏蒸土壤及对
照土壤 amoA 基因和 nirS 基因 PCR 扩增产物的
DGGE图谱结果见图 4。

图 4 威百亩(M)、棉隆(D)、溴甲烷(B)、硫酰氟(S)熏蒸
土壤的 amoA基因(左图)和 nirS基因(右图)的 DGGE图谱
Fig. 4 DGGE-patterns based on amoA nitrifying bacteria (left)
and nirS denitrifying bacteria (right) in the soils fumigated
metham-sodium (M), dazomet (D), methyl bromide (B) and
sulfuryl fluoride (S)
1、2、3、4、5表示从 DGGE胶上回收的电泳带。1, 2, 3, 4,
5 are DGGE fragments.

采用非加权成对算术平均法UPGMA对土壤样
品amoA型硝化细菌PCR-DGGE指纹图谱作相似性
聚类分析, 结果见图5a。结果表明, 所有供试土壤的
遗传相似性为70%, 在70%~76%的遗传性水平可将
5个处理土壤区分开来 , 表明不同处理土样间存在
遗传多样性。棉隆处理与威百亩、对照、溴甲烷、
硫酰氟处理之间聚为两大类, 其土壤硝化细菌类型
遗传距离为0.70; 威百亩处理与对照土样聚为一个
类群 , 其土壤中硝化细菌类型遗传距离为0.83; 溴
甲烷处理与硫酰氟处理聚为一个类群, 硝化细菌遗
传距离较高, 为0.84。4种熏蒸处理与对照土壤硝化
细菌遗传相似性相比, 威百亩与对照遗传距离最近,
为0.83; 溴甲烷和硫酰氟次之 , 硝化细菌类型遗传
距离为0.76, 棉隆处理土样与对照硝化细菌类型遗
传距离为0.70。结果表明棉隆处理与对照和其他3种
熏蒸剂处理土壤amoA型硝化细菌的遗传差异较大,
威百亩处理与对照amoA型硝化细菌的遗传差异较
小, 溴甲烷处理与硫酰氟处理土样amoA型硝化细菌
的遗传性相近。

图 5 熏蒸剂处理土壤硝化细菌(a)和反硝化细菌(b)种群
遗传距离矩阵图
Fig. 5 Genetic distance matrixes of amoA nitrifying bacteria
(a) and nirS denitrifying bacteria (b) populations of soil fumi-
gated with fumigants

采用非加权成对算术平均法UPGMA对土壤样品
nirS型反硝化细菌PCR-DGGE指纹图谱作相似性聚类
分析, 其结果见图5b。所有供试土壤的遗传相似性为
34%, 在46%~47%的遗传性水平可将5个处理土壤区
分开来, 表明土样间存在遗传多样性。威百亩和棉隆
处理聚为一个类群, 土壤反硝化细菌类型遗传距离
为0.46; 溴甲烷和硫酰氟处理聚为一个类群, 反硝化
细菌遗传距离较高, 为0.60; 而对照单独为一类。4种
熏蒸剂处理与对照土壤反硝化细菌遗传相似性相比,
溴甲烷和硫酰氟反硝化细菌类型遗传距离为0.47, 威
百亩和棉隆处理与对照反硝化细菌类型遗传距离为
0.34。结果表明 , 溴甲烷和硫酰氟处理与对照土壤
nirS型反硝化细菌遗传差异较小, 而威百亩和棉隆处
第 4期 燕平梅等: 土壤熏蒸剂对土壤硝化、反硝化作用的影响 405


理与对照土壤nirS型反硝化细菌遗传差异较大。
2.4.2 对 amoA型硝化细菌和 nirS型反硝化细菌群
落多样性的影响
表 1 为 5 个处理土壤 amoA 型硝化细菌和 nirS
型反硝化细菌群落多样性指数。从表 1可以看出, 4
种熏蒸剂处理之间及与对照间土壤 amoA 型硝化细
菌的丰富度指数(R)无显著差异(P>0.05)。威百亩、
棉隆和硫酰氟处理间及对照间均匀度指数(E)无明
显差异(P>0.05), 而显著高于溴甲烷处理(P<0.05)。
威百亩、棉隆和硫酰氟熏蒸处理间及与对照间多样
性指数(H)无显著差异(P>0.05), 显著高于溴甲烷处
理土样(P<0.05)。研究结果表明 4种熏蒸剂中溴甲烷
处理的土壤 amoA型硝化细菌多样性指数(H)、均匀
度指数(E)显著低于对照土样和其他 3 种熏蒸剂; 而
丰富度指数(R)无显著差异。威百亩、棉隆和硫酰氟
处理间及与对照间 3种生态指数无明显差异。
表 1 不同熏蒸剂处理土壤的 amoA型硝化细菌和 nirS型反硝化细菌的群落多样性特征
Table 1 Community diversity characteristics of amoA nitrifying bacteria and nirS denitrifying bacteria in soils fumigated with
different fumigants
细菌类型
Bacteria type
多样性指数
Diversity index
威百亩
Metham sodium
棉隆
Dazomet
溴甲烷
Methyl bromide
硫酰氟
Sulfuryl fluoride
对照
CK
Shannon-Weiner指数
Shannon-Weiner index
1.114±0.056a 1.114±0.056a 1.055±0.102b 1.119±0.027a 1.160±0.079a
丰富度指数 Richness index 0.925±0.041a 0.925±0.041a 0.943±0.062a 0.929±0.019a 0.947±0.058a
amoA型硝化细菌
amoA nitrifying
bacteria
均匀度指数 Evenness index 15.803±0.242a 15.799±0.280a 12.793±0.268b 15.802±0.291a 16.801±0.312a
Shannon-Weiner指数
Shannon-Weiner index
0.805±0.015ab 0.886±0.062a 0.632±0.024b 0.861±0.059a 0.703±0.022ab
丰富度指数 Richness index 7.795±0.242b 9.799±0.256a 6.788±0.202b 8.796±0.301ab 7.790±0.213b
nirS型反硝化细菌
nirS denitrifying
bacteria
均匀度指数 Evenness index 0.727±0.019a 0.886±0.017a 0.534±0.015b 0.822±0.025a 0.635±0.014ab

从表 1 可知, 威百亩、棉隆、硫酰氟熏蒸剂处理
土壤nirS型反硝化细菌群落的多样性指数(H)与对照
无显著差异 (P>0.05), 溴甲烷处理则显著低于
(P<0.05)棉隆和硫酰氟处理，与威百亩和对照无显著
差异。棉隆处理的丰富度指数(R)显著高于对照和威
百亩、溴甲烷处理(P<0.05), 其他 3种熏蒸剂处理间
丰富度指数(R)与对照无明显差异(P>0.05)。溴甲烷
处理的均匀度指数(E)显著低于其他 3种熏蒸剂处理
(P<0.05), 与对照无显著差异(P>0.05)。
2.5 熏蒸剂处理下土壤 nirS 型反硝化细菌差异微
生物鉴定结果
4种熏蒸剂处理及对照土壤的 nirS基因 PCR扩
增产物 DGGE图谱结果(图 4)显示, 熏蒸剂间及与对
照间土壤 nirS基因条带有差异, 如条带 1、2、3、5
在对照土壤中不存在。回收泳带 , 测序分析后与
GenBanK 已知序列对比结果(表 2)显示, 4 个条带均
为非培养菌, 同源性为 100%, 说明熏蒸剂处理土壤
后出现新的反硝化细菌, 且均是用培养基无法培养
的微生物。条带 4 为 4 种熏蒸剂和对照土壤共有的
细菌, 测序结果为 Pseudomonas, 说明 Pseudomonas
对威百亩、棉隆、溴甲烷、硫酰氟 4 种熏蒸剂具有
抗性。棉隆熏蒸剂的使用产生了一些新的(即对照土
壤没有)nirS 型反硝化细菌, 是土壤中微生物对熏蒸
剂的一种适应现象。
表 2 nirS-PCR-DGGE片段测序分析结果
Table 2 Sequencing analysis results of nirS-PCR-DGGE fragments
测序条带
Sequenced band
登录号
GenBank submission number
与 NCBI中已登录同源性比较
Strain or clones with highest identity from NCBIs
同源性
Homology (%)
1 HQ882381.1 Uncultured denitrifying bacterium clone S3-84 NirS (nirS) gene 100
2 JF966849.1 Uncultured bacterium clone H-78 dissimilatory nitrite reductase (nirS) gene 100
3 JF966843.1 Uncultured bacterium clone H-72 dissimilatory nitrite reductase (nirS) gene 100
4 M80653.1 Pseudomonas stutzeri nitrite reductase gene 100
5 FR865836.1 Uncultured bacterium partial nirS gene for cd1-containing nitrite reductase 100

3 讨论
硝化作用分为两个阶段, 即亚硝化(氨氧化)和
硝化(亚硝酸氧化), 分别由两类化能自养微生物完
成: 氨氧化细菌的氨单加氧酶(amoA)完成氨(NH3)
的氧化过程, 硝化细菌完成亚硝酸氧化过程。硝化
作用易受到多种环境因子的影响, 温度、pH、重金
属及农药等都能直接影响到土壤硝化作用进行的程
406 中国生态农业学报 2014 第 22卷


度。对硝化作用过程的抑制主要是抑制 amoA活性。
本试验通过威百亩、棉隆、溴甲烷、硫酰氟 4 种熏
蒸剂对土壤硝化作用和 amoA 型硝化细菌群落结构
影响的研究表明, 溴甲烷熏蒸土壤(100 d)明显降低
了土壤硝化强度。而溴甲烷熏蒸土壤硝酸还原酶、
亚硝酸还原酶活性均与对照无显著差异, 说明硝酸
盐的异化还原与对照无差异。溴甲烷对土壤硝化作
用的抑制主要发生在硝化过程。amoA-PCR-DGGE
图谱分析表明溴甲烷处理土样 amoA 型硝化细菌多
样性指数(H)、均匀度指数(E)显著低于对照, 而丰富
度指数(R)值无显著差异。说明溴甲烷的使用抑制了
部分 amoA型硝化细菌的硝化活性。由此可知, 溴甲
烷对土壤硝化强度的抑制是通过抑制 amoA 型硝化
细菌的多样性。前人研究报道溴甲烷熏蒸后, 土壤
硝化作用受到明显抑制[6]。用甲基溴及其替代品熏
蒸土壤后, 硝化速率与对照减少 55%以上, 且一直
持续到熏后 37 周还未恢复[1]。本研究结果与前人结
果一致。本研究中, 威百亩、棉隆、硫酰氟 3 种熏
蒸剂对土壤硝化强度无显著影响, 因为不同熏蒸剂
对微生物的作用机制不同, 而微生物功能恢复所需
时间不同。
生物反硝化作用主要由反硝化细菌引起。土壤
中存在大量的反硝化细菌[13], 用熏蒸剂熏蒸土壤后
不仅目标微生物被抑制, 非目标微生物、尤其细菌
类受到强烈的抑制 , 也抑制反硝化细菌的生长 [14],
导致反硝化细菌数量减少[2]。Roux-Michollet等[3]报
道溴甲烷熏蒸土壤(15~62 d)反硝化活性显著低于对
照土壤。本试验结果得出4种熏蒸剂熏蒸土壤(100 d)
反硝化活性与对照无显著差异。熏蒸剂对土壤反硝
化作用研究的结果相矛盾是由于熏蒸剂熏蒸土壤后
测定反硝化作用的时间不同, 熏蒸剂熏蒸土壤100 d
后 , 与反硝化相关的微生物恢复了功能活性 , 从
nirS-PCR-DGGE 图谱分析nirS型反硝化细菌多样性
指数(H)、均匀度指数(E) 与对照无显著差异的结果
得到证实。不同熏蒸剂处理反硝化强度之间无差异,
而nirS型反硝化细菌的3种生态指数表现了不同的差
别, 由于土壤反硝化过程的复杂性, 仅仅由nirS型反
硝化细菌的变化反映其与反硝化强度的相关性是片
面的, 建议以后的研究探究反硝化过程中每个环节
中微生物的动态变化与反硝化强度的相关性及贡献。
4 结论
1)威百亩、棉隆、溴甲烷、硫酰氟熏蒸 100 d后
的大田土壤之间以及与对照的土壤反硝化作用、
NH4+-N和 NO3−-N及微生物量氮含量、硝酸还原酶和
反硝化还原酶活性无显著差异。威百亩、棉隆、硫
酰氟熏蒸剂对土壤硝化活性无显著影响, 而溴甲烷
处理降低 13.19%, 且差异显著。4 种熏蒸剂之间对
土壤硝化活性的影响无显著差异。
2)4种熏蒸剂中溴甲烷处理土壤 amoA型硝化细
菌多样性指数(H)、均匀度指数(E)显著低于对照和其
他 3 种熏蒸剂处理, 而丰富度指数(R)无显著差异。
威百亩、棉隆和硫酰氟熏蒸土样之间及与对照 amoA
型硝化细菌 3种生态指数无显著差异。
3)4 种熏蒸剂处理土壤 nirS 型反硝化细菌多样
性指数(H)、均匀度指数(E)与对照无显著差异, 熏蒸
剂之间差异显著。从 DGGE图谱差异条带回收测序
可知熏蒸剂处理土壤后出现新的反硝化细菌, 且均
是用培养基无法培养的微生物。4 种熏蒸剂和对照
土壤共有的细菌, 测序结果为 Pseudomonas, 说明
Pseudomonas 对威百亩、棉隆、溴甲烷、硫酰氟 4
种熏蒸剂具有抗性。
4)对土壤样品 amoA 型硝化细菌 DGGE 指纹图
谱作相似性聚类分析可知, 棉隆处理与对照和其他
3种熏蒸剂处理土壤 amoA型硝化细菌的遗传差异较
大, 威百亩处理与对照 amoA 型硝化细菌的遗传差
异较小, 溴甲烷与硫酰氟处理 amoA 型硝化细菌的
遗传性相近。
5)对土壤nirS型反硝化细菌DGGE指纹图谱作
相似性聚类分析表明, 溴甲烷和硫酰氟处理与对照
土壤nirS型反硝化细菌遗传差异较小 , 而威百亩和
棉隆处理与对照nirS型反硝化细菌遗传差异较大。
6)研究表明, 溴甲烷对土壤硝化强度的抑制是
通过抑制 amoA型硝化细菌的多样性而实现。
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