全 文 ：中国生态农业学报 2016年 4月 第 24卷 第 4期
Chinese Journal of Eco-Agriculture, Apr. 2016, 24(4): 470477 农业生物多样性利用与保护专题


* 国家自然科学基金项目 (41271311)、国家科技支撑计划项目 (2012BAD05B0203)和中国科学院科技服务网络计划 (STS 计划)项目
(KFJ-SW-STS-142-3, KFJ-EW-STS-083-2, KFJ-EW-STS-055-1)资助
** 通讯作者: 赵炳梓, 主要研究方向为农田地力提升和作物生产力等方面的研究。E-mail: bzhao@issas.ac.cn
李增强, 主要研究方向为土壤生态环境。E-mail: zqli@issas.ac.cn
收稿日期: 20151126 接受日期: 20151229
* The study was supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 41271311), the National Key Technologies R&D
Program of China (2012BAD05B0203) and the Science and Technology Service Network Initiative Program of Chinese Academy of Sciences
(No. KFJ-SW-STS-142-3, KFJ-EW-STS-083-2, KFJ-EW-STS-055-1).
** Corresponding author, E-mail: bzhao@issas.ac.cn
Received Nov. 26, 2015; accepted Dec. 29, 2015
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DOI: 10.13930/j.cnki.cjea.151257
13C标记磷脂脂肪酸分析在土壤微生物生态
研究中的应用*
李增强1,2 赵炳梓1** 张佳宝1
(1. 中国科学院南京土壤研究所土壤与农业可持续发展国家重点实验室 南京 210008; 2. 中国科学院大学 北京 100049)
摘 要 磷脂脂肪酸(PLFA)是微生物细胞膜的重要组成成分, 不同微生物群落可通过不同生化途径合成不同
的 PLFA, 因此可选择某些 PLFA 作为微生物群落结构变化的生物标志物。PLFA 与稳定性同位素 13C 标记
(13C-PLFA)技术结合, 不仅能够确定原位土壤环境中微生物群落组成, 而且能够定向发掘土壤生态系统中参
与碳源代谢过程的微生物群落, 提供复杂群落中土壤微生物相互作用的信息, 具有广阔的应用前景。其基本原
理为: 将富集 13C 稳定同位素的基质加入土壤中, 土壤中的某些微生物群落利用基质 13C 合成 PLFA, 提取并
纯化土壤微生物的 PLFA, 利用气相色谱燃烧同位素比例质谱(GC-C-IRMS)测定其 13C丰度, 通过对比分析,
从而获取微生物群落组成与其功能的直接信息。本文在介绍了 13C-PLFA原理的基础上, 综述了该技术在光合
同化碳的根际微生物利用、土壤有机质分解的激发效应、甲烷氧化、有机污染物降解、外源简单碳源和外源
复杂碳源的微生物利用等方面的应用, 对此项技术的优缺点进行了分析并展望了其未来应用。
关键词 磷脂脂肪酸 稳定性同位素标记技术 土壤微生物 群落结构 微生物功能
中图分类号: S154.3 文献标识码: A 文章编号: 1671-3990(2016)04-0470-08
Application of 13C-labeled PLFA analysis in soil microbial ecology studies*
LI Zengqiang1,2, ZHAO Bingzi1**, ZHANG Jiabao1
(1. State Key Laboratory of Soil and Sustainable Agriculture, Institute of Soil Science, Chinese Academy of Sciences, Nanjing
210008, China; 2. University of the Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)
Abstract Analysis of phospholipid fatty acids (PLFA) is an effective non-culture-based technique for information on living
soil microbial community. PLFA is an important component of microbial cell membranes. Microbes can synthesize this special
PLFA through various biochemical pathways hence some PLFA can be used as biomarker for a microbial community. When
coupled with stable isotope 13C-labeled (13C-PLFA) technique, PLFA can be used to identify in situ structures of soil microbial
communities. This can also be used to explore soil microbial functional communities responsible for metabolic processes of
soil carbon sources in soil ecosystem, thus providing abundant information about microbial interactions in complex communities.
This technique has the potential for wide future applications. The principle of 13C-PLFA technique is as follows: 1) adding
13C-rich substrates to the soils assimilated by some members of the soil microbial community; 2) extracting and purifying
PLFA from soil substrate mixtures; 3) determining 13C value of PLFA using gas chromatography combustion isotope ratio mass
spectrometry (GC-C-IRMS); and 4) deriving required information by comparative analysis. This study introduced the principle
of 13C-PLFA technique and reviewed the applications of 13C-PLFA in the fields of photosynthetic carbon utilization by
第 4期 李增强等: 13C标记磷脂脂肪酸分析在土壤微生物生态研究中的应用 471


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rhizosphere microorganisms, priming effects of soil organic matter decomposition and mineralization, microbial oxidation of
methane, degradation of organic pollutants and microbial utilization of exogenous simple and complicated carbon sources. The
limitations and application potentials of this technique were also discussed. It was concluded that 13C-PLFA method was an
excellent way of providing insight into the relations between microbial community composition and soil biogeochemical cycle.
Keywords Phospholipid fatty acid; Stable isotope labeled technique; Soil microbe; Community structure; Microbial function
土壤微生物是土壤生态系统的重要组分之一 ,
几乎所有的土壤过程都直接或间接的与土壤微生物
有关。过去对微生物的研究多依赖于实验室分离培
养技术, 但该方法能够分离鉴定到的微生物只占土
壤微生物总数的 0.1%~1%[1]。因此, 以磷脂脂肪酸
(phospholipid fatty acids, PLFA)分析为代表的现代微
生物研究方法被广泛地应用于土壤微生物研究。
PLFA 是活体微生物细胞膜的重要组成部分, 不同
种类的微生物能够通过不同的生化途径形成自己独
有的 PLFA, 并且一种类型的 PLFA总是出现在同一
种类的微生物中, 而在其他种类的微生物中出现很
少, 因此根据不同种类微生物的指示性 PLFA 不同,
可以从整体上概述微生物群落结构。另外, PLFA的
合成与微生物的生长密切相关, 因此 PLFA 又可以
用来计算微生物生物量。关于 PLFA分析技术在土
壤微生物研究中的应用已有较为详细的综述[2]。但
是, 利用 PLFA 分析技术取得的结果仍难以将微生
物种类与其功能联系起来以提供有关微生物间相
互作用及其代谢功能的直接信息。近年来得到广
泛关注的 PLFA 技术结合稳定性同位素 13C 标记
(13C-PLFA)分析技术 , 为人们提供了解决这一问题
的关键途径。
13C-PLFA 分析技术的基本原理为: 首先, 将稳
定同位素 13C 富集的基质加入土壤中, 这样土壤中
的某些微生物能够以基质中的 13C 为碳源进行生理
代谢并满足其自身生长需要, 基质中的 13C 被吸收
同化进入微生物体内, 参与 PLFA的合成; 其次, 通
过提取、分离纯化和测定这些微生物体内含有 13C
的 PLFA, 从而将土壤微生物群落的组成与其功能
联系起来。PLFA的 13C丰度用气相色谱燃烧同位
素比例质谱(GC-C-IRMS)仪器测定。GC-C-IRMS 系
统用气相色谱毛细管柱分离 PLFA, 柱子的出口连
接有一个微型氧化装置, PLFA在氧化装置中燃烧产
生 CO2气体, CO2气体进入 IRMS测定重的(13C)和轻
的(12C)同位素比例(13C/12C)。与基于核酸(DNA)的
13C标记技术(13C-DNA)相比, GC-C-IRMS仪器对 13C
同位素丰度的分辨率可达到千分之一, 即使很小的
13C含量的差别也可以通过此方法分开, 因此 13C-PLFA
技术具有极高的灵敏度。其次, 微生物 PLFA合成速
度快, 短时间内可获得足量被 13C标记的 PLFA用于
分析, 从而缩短了培育周期, 降低了实验成本。另外,
13C-PLFA 分析技术的前处理操作步骤少, 这样能够
减少操作过程中样品的损失。因此, 该技术已被广
泛应用于确认土壤中的功能微生物群落, 追踪碳元
素在微生物群体和个体间的流动等方面, 是一项相
对成熟的技术。本文就 13C-PLFA技术在植物光合同
化碳、土壤有机质激发效应、甲烷氧化、有机污染
物降解、外源简单碳源和外源复杂碳源的微生物利
用以及该技术的优势和不足等方面加以阐述。
1 光合同化碳的根际微生物利用
碳在“大气植物土壤”系统中的运输和分配是
碳循环的重要组成部分。植物以根际沉积物
(rhizodeposits)的形式将部分光合同化碳输入土壤中,
这部分碳源通过土壤微生物的作用或以气体的形式
释放到大气中 , 或以有机质的形式储存在土壤中 ,
在稳定土壤碳库方面起着关键作用。因此, 解析微
生物对光合同化碳的转化以及参与转化的微生物群
落对于认识土壤有机碳循环方面具有重要意义。对
于这类研究多采用气态 13CO2 脉冲标记或连续标记
的方法。Butler 等[3]首次利用 13C-PLFA 技术发现不
同标记时期显著影响了黑麦草(Lolium perenne)根际
微生物对光合同化碳的利用 , 革兰氏阳性菌(i15:0
和 a15:0)在第 2标记阶段的活性降低, 而革兰氏阴性
菌(16:1ω5c)更加活跃; 真菌(18:2ω6,9c)在两个阶段
均能利用光合同化碳。此外, 不同的土壤水分条件[4]、
大气 CO2 浓度[5]等环境条件也会影响根际微生物对
光合同化碳的利用。如 Tian 等[4]发现持续淹水条件
下, 光合同化碳主要被水稻(Oryza sativa)根际微生
物中的革兰氏阳性菌利用, 而在非淹水和干湿交替
条件下, 革兰氏阴性菌和真菌则是利用光合同化碳
的主要群落。但是Wu等[6]发现与非转基因水稻相比,
转基因水稻插入 cry1Ab和标志基因并不影响根际微
生物群落对水稻光合同化碳的利用。除气态 13CO2
标记外, Kušlienė等[7]利用 Na213CO3溶液标记白三叶
草(Trifolium repens)和黑麦草叶片, 发现不同作物中
利用光合同化碳的微生物群落不同。此外, 不同研
究者均发现在标记后短时间内即能在微生物群落中
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检测到标记 13C, 表明光合同化碳能够快速转移到土
壤中并被微生物利用 [37]。综上可知 , 不同植物种
类、植物生育期以及环境条件均能显著改变利用光
合同化碳的微生物群落, 这可能与来自光合同化碳
的根际沉积物组成的改变有关[45,7]。
2 参与土壤有机质激发分解的微生物研究
土壤有机质(SOM)是最大的碳库 , 影响全球碳
循环。大量研究表明添加新鲜有机物料能够加快
SOM 的分解, 这种现象叫做激发效应[8]。许多研究
者在不同的环境条件下, 采用不同的外源有机物质
对于参与激发效应的微生物群落进行了大量研究。
Garcia-Pausas和 Paterson[9]通过添加 13C标记葡萄糖
研究了草地 SOM 的激发效应, 发现革兰氏阴性菌
(cy17:0和 cy19:0)是利用葡萄糖的主要群落, 而真菌
和放线菌则是引起正激发效应的直接群落。然而 ,
Bastida等[10]添加 13C标记葡萄糖后却发现革兰氏阴
性菌是初期控制激发效应的主要群落, 而真菌和放
线菌则是后期控制激发效应的群落。Nottingham
等 [11]利用 13C 自然丰度蔗糖和玉米秸秆发现特定革
兰氏阴性菌(16:1ω5c 和 16:1ω7c)是利用土壤有机碳
的主要群落并与激发效应有直接联系。Blagodatskaya
等[12]发现由 13C标记纤维素引起的 SOM激发效应在
短时间内(<14 d)主要是由真菌和革兰氏阴性菌活动
引起的, 而在长时间内(14~60 d)则主要是由真菌和
革兰氏阳性菌对 SOM的分解造成的。根际沉积物输
入土壤后也会引起激发效应, 革兰氏阳性菌是控制
根际激发效应的主要群落[13]。此外, 研究者发现不
同环境条件[14]、不同土层[15]、养分添加[16]等均能影
响激发效应的大小以及通过不同的内在机理改变参
与激发效应的微生物群落。综合以上研究可知, 有
机物料种类、培育时间、环境条件等因素均能显著
改变参与 SOM激发分解的微生物群落类型。其内在
机理为: 在某些条件下外源有机物料添加后通过改
变微生物群落结构[79], 或为微生物群落提供能量、
提高微生物活性[11,13]促进 SOM激发分解; 而在另一
些条件下添加外源有机物料并不影响微生物群落结
构或活性, 引起 SOM激发分解的主要原因则是因为
添加外源有机物料促进了相关分解酶的产生[12]。
3 甲烷氧化微生物研究
甲烷(CH4)是一种重要的温室气体, 在 100 a 时
间尺度上, 单位质量 CH4 的增温潜势是 CO2 的 23
倍。近 200 a来大气中 CH4浓度不断增加, 而甲烷惟
一的生物汇为土壤里甲烷氧化细菌的氧化作用, 大
约占大气甲烷汇的 10%。因此, 研究者对参与甲烷
氧化的微生物群落进行了大量研究。Boschker 等[17]
首次利用 13C-PLFA 技术报道了淡水底泥沉积物中
微生物群落对 CH4的氧化, 通过对标记的 PLFA 进
行对比鉴定 , 发现Ⅰ型甲烷氧化菌的特征 PLFA
(16:1ω9c, 16:1ω7c和 16:1ω5c)富集 13C, 最后较为肯
定地认为是Ⅰ型甲烷氧化菌而不是以前人们认为的
Ⅱ型甲烷氧化菌与环境中 CH4氧化有重要关系。随
后, Nold 等 [18]在湖泊沉积物中也发现相同的结果,
并发现增加铵离子浓度显著降低微生物群落对
13CH4的利用。然而, Maxfield等[19]发现在草地土壤中
CH4-13C 主要在Ⅱ型甲烷氧化菌的特征 PLFA
18:1ω7c 中富集。Mohanty 等[20]在德国榉木(Fagus
sylvatica)-夏栎(Quercus robur)森林土壤中发现Ⅰ型
(16:1ω8c 和 16:1ω5t)和Ⅱ型(18:1ω8c)甲烷氧化菌均
能参与 CH4 的氧化 , 并发现添加氮肥 (NH4Cl 和
KNO3)促进了Ⅰ型甲烷氧化菌的活性, 而抑制了Ⅱ
型甲烷氧化菌的活性。Maxfield 等 [21]研究了
Broadbalk地区非淹水农田土壤对 CH4的氧化, 发现
Ⅱ型甲烷氧化菌是施用化肥土壤中氧化 CH4的主要
群落, 而在施用厩肥的土壤中Ⅰ型甲烷氧化菌则是
主要群落。综上可知, Ⅰ型和Ⅱ型甲烷氧化菌均能
参与 CH4氧化, 且氮素种类能够影响参与 CH4氧化
的微生物类型。但是, 上述研究主要是利用常规 CH4
浓度得到的对 CH4高亲和力的甲烷氧化菌对 CH4氧
化的结果。Chowdhury和 Dick[22]认为在高 CH4浓度
条件下, Ⅱ型甲烷氧化菌发挥作用, 而在低 CH4 浓
度条件下, Ⅰ型甲烷氧化菌可能发挥更大的作用。
4 有机污染物的微生物降解
土壤是环境中各种有机污染物的最终容纳体之
一, 土壤有机污染已经成为全球性的重要环境问题
之一。存在于土壤环境中的天然微生物种群对有机
物的降解是有机污染物从土壤环境中消除的基本途
径之一。该方法具有成本低, 最终产物是 CO2和水,
不会产生二次污染并且处理效果好等优点, 是应用
前景最为乐观的有机污染物处理方法。Hanson等[23]
首次使用 13C-PLFA技术研究了微生物对 13C标记甲
苯的利用, 发现培育 119 h后, 约 27%的总 PLFA能
够被甲苯 13C 标记, 表明在土壤这种复杂环境中可
用 13C-PLFA技术研究微生物对有机污染物的代谢。
随后, Mauclaire等[24]利用 13C-PLFA技术研究了甲苯
降解菌 (Pseudomonas sp.)和食细菌鞭毛变形虫
(Vahlkampfia sp.)对甲苯的代谢, 指出该技术在示踪
微生物甲苯碳代谢食物链中具有独特优势。Tillmann
第 4期 李增强等: 13C标记磷脂脂肪酸分析在土壤微生物生态研究中的应用 473


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等[25]利用 13C标记 2,2′-二氯联苯(2,2′-dichlorobiphenyl)
研究了微生物对多氯联苯 (PCBs)类物质的降解 ,
发现 13C 在 Burkholderia 菌的特征脂肪酸 (16:0、
17:0cyclow7c、18:1ω9c、19:0cycloω8c)中富集, 而土
壤中数量最多的 Methylobacterium 菌的特征脂肪酸
(18:1ω7c)基本不富集 13C, 表明 Burkholderia菌是所
培育土壤中好氧分解 PCBs的主要菌株。Mellendorf
等[26]发现 PLFA i14:0、15:0、18:0、18:1ω5c和真菌
PLFA 18:2ω6,9c能够富集菲 13C, 添加菜籽油促进了
这种富集作用并加快了菲的降解。此外, 研究者还
研究了五氯酚[27]、异恶草松(一种除草剂)[28]、多环
芳烃(PAHs)[29]等的微生物降解。值得注意的是, 虽
然微生物能够降解有机污染物, 但是有机污染物对
微生物同样具有毒性, 加入土壤后能够显著影响微
生物群落活性和结构, 抑制磷脂类物质的生物合成,
从而影响对最终结果的解释[30]。
5 微生物对外源简单碳源的利用
葡萄糖是一种能被大部分厌氧和好氧微生物直
接分解利用的简单有机碳, 因此常被用作标准物质
研究微生物群落对简单碳源的利用。Ziegler等[31]发
现在培养初期革兰氏阳性菌是利用葡萄糖 13C 的主
要群落, 当葡萄糖耗竭后, 放线菌(10me18:0)在葡萄
糖碳再循环过程中起重要作用, 并指出取样时期对
于解释葡萄糖的微生物利用至关重要。Dungait等[32]
也发现取样时间影响了利用葡萄糖 13C 的微生物群
落; 在整个培育过程中, 革兰氏阳性菌是利用葡萄
糖的主要的群落(约 30%), 而真菌对葡萄糖的利用
较少(<1%), 同时随着葡萄糖添加浓度的增加, 农田
土壤微生物群落对13C利用增加, 草地土壤微生物中
革兰氏阳性菌和放线菌对 13C 的利用受葡萄糖浓度
影响较小。Zhang等[33]发现培养前期葡萄糖13C主要
出现在细菌中 , 随着培养时间的延长 , 真菌和放
线菌对葡萄糖 13C 的利用增加; 施用有机肥处理的
土壤 13C-PLFA 含量显著高于施用化肥和不施肥处
理。此外, 微生物对葡萄糖的利用受土壤类型的影
响[34], 而草地植物群落组成不影响微生物对葡萄糖
的利用[35]。
除葡萄糖以外, 研究者也研究了不同试验条件
下微生物群落对其他简单碳源的利用。Arao[36]发
现乙酸中的 13C主要进入 PLFA 18:2ω6,9c, 16:0 和
18:1ω9c 中, 同时微生物对乙酸的利用随着土壤 pH
的增加而增加。而13C标记甘氨酸则主要被未扰动荒
原土壤中的革兰氏阳性菌(i16:0)利用, 随着 CO2 浓
度的增加, 革兰氏阳性菌(i17:0)对甘氨酸的利用量
降低, 而非特异性 PLFA 16:0 和 18:0 对甘氨酸的利
用量增加[37]。Wang 等[38]发现土壤类型显著影响了
微生物对尿素 13C 的利用, 在红壤中 13C 主要进入
PLFA 16:0、16:1ω5c和 cy19:0, 在潮土中 13C则主要
进入 PLFA 16:0、16:1ω5c和 16:1ω7c, 在两种水稻土
中 13C主要进入 PLFA 16:0、18:1ω7c和 i15:0, 且随
着土壤 pH增加, 总 PLFA中来自尿素的 13C含量增
加。此外, 部分研究者同时比较了土壤微生物对不
同简单碳源的利用, 例如, Brant 等[39]比较了不同管
理措施下森林土壤微生物对葡萄糖、谷氨酸、草酸
和酚的利用。Dungait等[40]比较了甘氨酸、氨基酸混
合物和根系提取物的微生物利用。Rinnan等[41]比较
了 13C 标记的葡萄糖、乙酸、甘氨酸、淀粉和香草
醛的微生物利用。Gunina等[42]同时比较了微生物群
落对氨基酸(丙氨酸和谷氨酸)、单糖(葡萄糖和核糖)
和羧酸(乙酸和棕榈酸)的利用。综合以上研究发现微
生物群落对简单碳源的利用受取样时间的显著影响,
同时, 微生物对外源简单碳源的利用一方面与土壤
本身微生物群落结构有关, 在微生物整体群落中占
优势的群落是利用碳源的主要群落[3233]; 另一方面
与所添加的碳源类型有关, 相同群落对不同碳源的
利用能力不同[3942]。
6 微生物对外源复杂碳源的利用
植物残体是最常见的复杂有机碳源, 植物残体
分解在维持土壤养分循环、保持 SOM含量、为土壤
生物群落提供碳源和能源等方面起着主要作用。
Williams等[43]首次利用 13C-PLFA技术研究了 13C标
记深红三叶草 (Trifolium incarnatum)和黑麦草
(Lolium multiflorum)的根和地上部秸秆的微生物分
解过程, 发现部分 PLFA(16:1ω5c 和 10me17:0)基本
不利用添加的根和地上部秸秆碳 , 而另一部分
PLFA(16:0、18:1ω9c 和 18:2ω6,9c)则在整个培养过
程中均能大量利用来自根和地上部秸秆的碳, 并指
出植物残体性质和土壤条件均能影响参与残体碳分
解的微生物群落。Kong等[44]发现不同粒径土壤团聚
体微生物中革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌是利用毛
苕子(Vicia dasycarpa)根和茎叶 13C 的主要群落, 不
同团聚体粒径对微生物 13C 分布比例无显著影响。
此外, 玉米(Zea mays)秸秆 13C 也在革兰氏阳性菌
(i15:0和 a15:0)和革兰氏阴性菌(16:1ω7c和 16:1ω5c)
中富集 , 且添加重金属混合物促进了这种富集作
用 [45]。Elfstrand等[46]在田间试验中发现 16:0、革兰氏
阴性菌(16:1ω7c和 18:1ω7c)、真菌(18:1ω9c)是利用深
红三叶草秸秆碳的主要群落。另外, 由于组成植物
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残体的成分不同, 植物残体的分解分为快速和慢速
两个分解阶段, 在不同的分解阶段参与分解的微生
物群落不同。Moore-Kucera和 Dick[47]发现细菌是前
期(<1 月)分解花旗松(Pseudotsuga menziesii)地上部
残体和根的主要群落, 而后期(>5 月)则主要由真菌
参与分解。Paterson 等[48]进一步发现黑麦草残体水
溶性成分主要由细菌特别是革兰氏阴性菌参与分解,
而真菌主要参与不溶性成分的分解。然而, McMahon
等[49]发现真菌(18:2ω6,9c)能够利用黑麦草残体水溶
性、非水溶性和残体整体 3种组分, 而 PLFA(i15:0、
10me16:0 和 cy19:0)均不能很好地利用这 3 种组分,
随着培养时间的延长真菌对 3 种组分的利用程度增
加。
生物炭是生物质在无氧或微氧条件下低温热转
化后的固体产物, 具有有机碳含量高、多孔性、碱
性等特性, 施入土壤后能够显著增加土壤有机碳存
储, 因此研究微生物对生物炭的利用对于土壤碳库
的长期稳定具有重要意义。Steinbeiss等[50]首先研究
了通过水热裂解法制得的葡萄糖和酵母生物炭的微
生物利用, 发现真菌是利用酵母生物炭的主要群落,
而革兰氏阴性菌则是利用葡萄糖生物炭的主要群落,
并指出这是因为两种生物炭的表面性质和化学基团
组成不同所引起的。Watzinger等[51]则发现在培育试
验中仅有放线菌 (10me18:0)利用麦壳和柳树 (Salix
spp.)生物炭 , 而在盆栽试验中革兰氏阴性菌
(16:1ω7c、16:1ω5c和 18:1ω7c)是利用生物炭的主要
群落。Gomez等[52]发现土壤类型显著影响了微生物
对橡木(Quercus)生物炭的利用过程, 在普通潜育土
(haplic gleysol)和潜育黑土(gleyic phaeozem)中革兰
氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌是利用生物炭的主
要群落, 而在普通淋溶土(haplic luvisol)中革兰氏阳
性菌、革兰氏阴性菌和放线菌则是利用生物炭的主
要群落 , 在淋溶黑土(luvic phaozem)中没有发现能
够显著利用生物炭的微生物群落。此外, Farrell等[53]
发现在分解初期革兰氏阳性菌是利用小麦(Triticum
aestivum)和桉树(Eucalyptus robusta)生物炭的主要
群落, 随着培养时间的延长, 真菌对生物炭的利用
逐渐增加。综上可知, 土壤微生物群落对复杂碳源
的利用也存在采样时间效应, 这可能与不同微生物
群落所能利用的碳源成分不同有关, 在特定试验条
件下, 某些微生物群落并不参与复杂碳源或其某一
特定成分的分解。
7 其他
除上述研究方面外, 13C-PLFA 技术也被应用到
其他方面。例如 Apostel 等[54]通过在丙氨酸和谷氨
酸特定的碳原子上标记 13C, 利用 13C-PLFA 技术,
研究了微生物群落对上述两种氨基酸特定碳原子的
代谢, 发现两种氨基酸的羧基碳通过氧化作用快速
损失, 而氨基酸中的还原碳(如 C3-5)优先被微生物
利用合成 PLFA, 丙氨酸 C2 碳主要进入革兰氏阴性
菌细胞膜中, 而谷氨酸 C2 碳则从 PLFA 中快速损
失。通过重建微生物碳循环途径, 发现谷氨酸中的
C2 碳进入 PLFA 可以通过乙醛酸代谢途径, 或者通
过在进入三羧酸循环前将谷氨酸转化为天冬氨酸。
Kramer和 Gleixner[55]研究了 C3植被转变为 C4植被
后土壤微生物对有机碳的分解, 发现革兰氏阳性菌
主要利用来自于C3植被的有机碳, 而革兰氏阴性菌
则主要利用来自 C4植被的有机碳。Streit等[56]研究
了增温(+4 ℃)对高寒土壤微生物分解有机碳的影
响, 发现增温降低了真菌(18:2w6, 9c)对新近形成土
壤有机碳的利用, 促进了其对老有机碳的利用。
8 问题与展望
13C-PLFA 技术主要应用于植物土壤系统的碳
循环研究中, 这包括添加 13CO2或 13CH4气体的研究
以及添加其他 13C 标记的有机物料的研究。不同的
研究者在上述各研究方面均取得了一些研究成果 ,
如植物光合固定碳可以在短时间内被根际微生物群
落利用[37]、Ⅰ型甲烷氧化菌是淡水底泥中参与甲烷
氧化的主要群落[1718]以及在微生物整体群落中占优
势的群落是利用简单碳源的主要群落等[3233]。诚然
使用 13C-PLFA 技术能够为生物地球化学过程提供
更多的分析信息, 但是该技术也存在一些无法避免
的缺陷。首先 PLFA 并不是一个完美的生物标志物,
目前尚未确立土壤中所有生物的特征脂肪酸, 并且
在很多情况下还无法完全确定土壤中某些特定脂肪
酸和特定微生物群落的对应关系。例如当包括非菌
根对照时, PLFA16:1ω5c 通常作为丛枝真菌的生物
标志物, 但是在革兰氏阴性菌中也含有该 PLFA。其
次, 交叉取食(cross-feeding)也是该技术的一个普遍
问题。例如, 在长期培养过程中, Uhlík 等[57]发现部
分微生物能够以其他微生物群落的残体或代谢产物
为底物。另一种可能是部分微生物直接同化其他微
生物呼吸产生的 13CO2, 因此部分试验试图通过增加
12CO2浓度来避免这种可能。理想状况是标记后取样
应该尽快进行, 进而避免交叉取食现象的出现。但
这在实际操作中存在一定困难, 首先如果取样太早
可能造成13C标记不完全, 给后续的准确测定带来困
难; 其次, 次级异养取食作用可能快于初级自养同
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化作用, 因此对于 13C-PFLA技术应该分析不同时间
点的土壤样品, 这样能够比较初级同化速率和次级
异养捕食速率, 评估交叉取食风险。
由于细胞死亡后 PLFA 快速消失 , 因此
13C-PLFA技术能够识别参与基质代谢的活体微生物
生物量。与以 DNA/RNA 为基础的技术相比, PLFA
技术能够更加灵敏地反映土壤微生物群落结构的变
化。然而, 仅使用 13C-PLFA技术无法反映种类组成
或者系统发育水平的详细信息 , 因此 , 同时使用
13C-PLFA 和 13C-DNA/RNA 技术, 可为今后充分理
解土壤微生物在土壤生态系统中的功能提供新的思
路和方法。
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