全 文 ：
药材与资源

白芷种质资源遗传多样性的 ISSR研究
郭丁丁1 ,马逾英1* ,唐
琳2 , 陈要臻2 ,吕
强1
( 1
成都中医药大学药学院, 四川 成都
610075; 2
四川大学生命科学学院, 四川 成都
610064)
摘
要: 目的
应用 ISSR分子标记技术分析中药白芷的遗传多样性。方法
对 4 大类商品白芷及白芷近缘野生
种兴安白芷共 20 个居群的白芷种质进行 I SSR 分析, 利用 NT SYS2
1e 软件分析遗传相似系数, UPGM A 方法聚
类, 构建亲缘关系系统图。结果
9条引物共得到 97 条扩增条带, 其中多态性条带 37 条, 占 38% ; 20 个居群的样
品聚为两大类。结论
不同产地栽培白芷的遗传多样性水平较低, 种质间的亲缘关系较近; 而兴安白芷与 4 大类
商品白芷存在遗传差异。
关键词: 白芷; ISSR; 种质资源;遗传多样性
中图分类号: R282
7


文献标识码: A


文章编号: 0253- 2670( 2009) 10- 1627-04
Genetic diversity of Radix Angelicae Dahuricae germplasmic resource based on ISSR analysis
GUO Ding-ding
1
, M A Yu-ying
1
, TANG Lin
2
, CH EN Yao-zhen
2
, L
Qiang 1
( 1
Co lleg e of Pharmacy, Chengdu U niversit y of T raditiona l Chinese M edicine, Chengdu 610075, China;
2
Colleg e o f L ife Sciences, Sichuan Univ ersity , Chengdu 610064, China)
Abstract: Objective
T o determine the genet ic diversity of Radix A ngel icae Dahur icae by ISSR

Methods
The 20 populat ions of germ plasm ic resources of Radix A ngel icae Dahur icae including four com-
modity v ariet ies and Radix A ngelicae Dahur icae w ere analyzed by ISSR
T o make up the system at ic dia-
gram of g enet ic r elat ionship by NTSYS2
1e sof tw are and cluster by U PGMA method
Results
A total o f
97 ISSR bands fr om nine prim ers w er e obtained, among w hich 37 w ere polym orphic bands
The average
per centage of po lym orphic bands w as 38%
T he 20 populat ions of germ plasm ic resources of Radix A ng el i-
cae D ahur icae w ere classified into tw o larg e g roups
Conclusion
T he level of germplasm diversity o f
A rg el ica dahur ica from various habitats is low er and the aff inity relat ionship of Radix A ng el icae Dahur i-
cae is closer
But there is genet ic dif ference betw een A ngel ica dahurica and the four comm odity variet ies

Key words: Radix A ngelicae Dahur icae ; ISSR; g er mplasmic resources; genet ic diversity


白芷为一常用中药, 具有驱风散寒、燥湿排脓、
止痛等功效, 临床应用广泛,目前国内外市场需求量
大。传统商品药材主要分为川白芷、杭白芷、祁白芷
和禹白芷 4大类, 分别主产于四川、浙江、河北及河
南,均为栽培品。白芷由于适应性较强,近年来不少
地区对其进行引种栽培,有的地区已经形成一定规
模,成为了新的白芷主产区,如安徽亳州等。关于白
芷的基源植物及分类地位,历来争议较多,
中国药
典
2005年版收载白芷为伞形科植物白芷 A ngelica
d ahur ica ( Fisch
ex H of fm
) Benth
et H ook
f

或杭白芷A
dahur ica ( Fisch
ex H of fm
) Benth

et H ook
f
var
f ormosana ( Bo iss
) Shan et
Yuan的干燥根,近些年来, 在有关白芷种质资源多
样性、亲缘关系等的研究报道中, 多认为川、杭、祁、
禹 4大类商品白芷不应做分类上的区分 [ 1~ 3]。
ISSR标记技术由加拿大蒙特利尔大学的 Ziet-
kiew icz等于 1994年提出[ 4] , 它与之前广泛采用的
RAPD方法相比具有更多的扩增片段, 能产生足够
的多态位点,更容易捕捉到具有该品种特有的标记
指纹片段,同时克服了 RAPD法重复性和稳定性差
的缺点,目前已被广泛应用于植物遗传多样性分析、
DNA 指纹图谱绘制及分子生态学研究等方面 [ 5~ 9]。

1627
中草药
Chinese Traditional and Herbal Drugs
第 40 卷第 10 期 2009年 10 月
* 收稿日期: 2009-03-23





















基金项目:国家自然科学基金资助项目( 30572337)作者简介:郭丁丁( 1983
) ,女,山西太原人,硕士研究生,研究方向为中药品种、质量和资源开发研究。
* 通讯作者
马逾英
Tel: 13678189939
E-mail: ma- yuying@ 126
com
本实验采用 ISSR分子标记技术对白芷种质资源遗
传多样性进行研究, 从 DNA 分子水平分析了不同
产地白芷的遗传多样性,为合理利用与开发白芷遗
传资源提供科学依据。
1
材料和仪器
1
1
供试材料:实验所用白芷材料均采自于四川遂
宁白芷 GAP 基地白芷种质资源圃, 经课题组贾敏
如教授鉴定(表 1) , 四川、重庆、浙江栽培白芷原植
物为伞形科植物杭白芷 A
dahurica ( F isch
ex
H of fm
) Benth
et H ook
f
var
f ormosana
( Boiss
) Shan et Yuan;河南、河北、安徽、山东栽培
的白芷原植物为伞形科植物白芷 A
dahurica
( F isch
ex H offm
) Benth
et H ook
f
; 吉林采集
的白芷野生近缘植物其原植物为兴安白芷 A

dahur ica Benth
et H ook
。每个居群均随机选取
15株,取新鲜叶片, 用硅胶迅速干燥后带回实验室,
储于- 70
冰箱保存。
表 1
实验材料
Table 1
Materials used in experiment
名称 来
源 名称 来
源
川白芷 四川南充( NC) 川白芷
重庆南川 4( CQ 4)
四川渠县 1( QX1 ) 四川遂宁 1( SN)
四川渠县 2( QX2 ) 四川安岳( AY)
四川达县 1(DX1 ) 禹白芷
河南禹州( YZ)
四川达县 2(DX2 ) 祁白芷
河北安国( AG)
四川达县 3(DX3 ) 杭白芷
浙江磐安( PA)
四川达县 4( QX4 ) 亳白芷
安徽亳州 1( BZ1)
重庆南川 1(C Q 1) 安徽亳州 2( BZ2)
重庆南川 2(C Q 2) 山东白芷 山东荷泽( HZ)
重庆南川 3(C Q 3) 兴安白芷 吉林延边( YB)
1
2
试剂及仪器: M g2+ 、10
PCR buf fer ( M g2+
f ree)、Taq DN A聚合酶购于大连宝生物公司;引物
根据加拿大哥伦比亚大学( U BC)公布的序列设计,
由北京赛百盛基因技术有限公司合成; Biometra

T personal PCR 扩增仪; Gene Genius Bio- im ag ing
System 凝胶成像仪。
2
方法和结果
2
1
基因组 DNA的提取及检测:改良 CTAB法提
取总 DNA [ 10] ,并采用分光光度计法测定其浓度和
纯度,同时采用琼脂糖凝胶电泳法检测提取的 DNA
是否降解,最后将样品稀释为 100 ng/
L, 用于 IS-
SR分析。
2
2
ISSR-PCR扩增与检测
2
2
1
ISSR 反应体系: 25
L 反应体系中, 模板
DNA 质量为 10~ 30 ng , 2
5
L 10
PCR buffer
( M g2+ f ree ) , M gCl2 2
0 mmo l/ L , dNT Ps 0
2
mmo l/ L , T aq 酶 1
0 U, 引物 0
6
m ol/ L。
2
2
2
扩增程序: 94
预变性 5 min; 94
变性
30 s,引物在筛选后的最佳退火温度退火 45 s, 72

延伸 2 min,共计 39个循环,循环结束后在 72
延
伸 5 min, 4
保存。
2
2
3
引物筛选:从 100条引物中筛选出 9条能扩
增出清晰条带, 条带数目相对较多, 表现稳定, 重复
性好的引物用于 ISSR分析。最终确定 9条引物为
UBC815, UBC834, UBC841, U BC853, U BC857,
UBC862, U BC864, UBC868, UBC900(表 2)。
表 2
ISSR引物序列及多态性分析
Table 2
ISSR Primer sequences and diversity analysis
引物
核苷酸序列
( 5
 3
)
退火
温度/

总带
数
多态性
带数
多态性百
分率/ %
UBC815 CTC T CT CTC TCT CTC TG 50 11 4 23
5
UBC834 AG A GAG A GA GAG A GA GYT 56 9 5 55
5
UBC841 GAG AGA GA G AGA G AG AYC 54 11 4 36
4
UBC853 TCT CT C TCT CTC TCT CRT 50 9 4 44
4
UBC857 ACA CAC ACA CA C A CA CYG 54 13 4 30
8
UBC862 AG C AG C AG C A GC A GC A GC 56 10 5 50
0
UBC864 ATG ATG ATG A TG ATG A TG 48 10 2 20
0
UBC868 GA A GAA G AA GA A GA A GAA 48 12 2 16
7
UBC900 ACT TCC CA A CAG GTT AA C A CA 56 12 7 58
3
合计 97 37 38
1
2
2
4
产物检测: 反应产物在含有 EB的 1
5%的
琼脂糖凝胶电泳中电泳分离, 用 DNA Marker( DL
2 000)作为相对分子质量标记, 以 5 V/ cm 的电压
电泳 2
5~ 3 h, 在紫外凝胶成像系统下观察照相。
结果见图 1。
M-DNA Marker ( DL2 000) , 1~ 20-CQ 1、QX2、CQ 3、
NC、CQ 2、YZ、S N、BZ1、DX 1、DX 4、C Q4、QX 1、BZ2、
DX3、YB、H Z、AG、AY、DX 2、PA
图 1
引物 UBC862对 20 个居群的扩增结果
Fig
1
ISSR Profile of 20 populations
generated by Primer UBC862
2
3
数据的采集与统计:在琼脂糖凝胶电泳图谱上
的每一条带( DNA片段)均为一个分子标记, 并代表
1个引物的结合位点。根据各分子标记的有无得到
所有位点的二元数据, 同 1个位点上有带(显性)记
为 1(强带及弱带的赋值均为 1) , 无带(隐性)记为
0,仅记录在实验中可重复稳定出现的条带用于数据

1628
中草药
Chinese Traditional and Herbal Drugs
第 40 卷第 10 期 2009年 10 月
分析。利用 NT SYS2
1e 软件进行 UPGM A 聚类
分析,得到各居群间的遗传距离及聚类树状图, 结果
见图 2。
系数
图 2
不同产地白芷 ISSR标记遗传系数聚类图
Fig
2
Dendrogram of ISSR analysis for Radix Angelicae
Dahuricae from various habitats
3
讨论
3
1
用 9 条 ISSR 引物对白芷 20 个居群的 DNA
样品进行 PCR扩增, 共扩增出 97个清晰、稳定的位
点,片段大小分布在 200~ 1 500 bp。其中, 多态性
位点 37个,平均多态位点百分率为 38%。ISSR 扩
增片断的多态性因引物而异, 多态性片段为 2~ 7
条,平均每条引物能扩增 4
1条多态性带。
3
2
为分析各品种之间的遗传分化程度,计算了基
因遗传相似度(表 3) , 其中川白芷样品的遗传相似
度值分布在0
969 1~ 0
845 4。CQ 1 与 QX2 的遗传
相似度值最大, 为0
969 1; H N、NC 与 DX4 的遗传
相似度值最小, 为0
845 4。在分析中发现除 DX4 样
品其他川白芷样品间的遗传相似度值较低外(分布
在0
845 4~ 0
938 1) ,其余所有川白芷样品间的相
似度均在 0
9以上,说明不同居群点的川白芷样品
遗传相似度较高,相似性良好。
表 3
不同居群点基因遗传相似度
Table 3
Genetic similarity coef ficient of materials f rom diff erent populations
CQ 1 Q X2 CQ3 N C CQ2 YZ SN BZ1 DX1 DX4 CQ4 QX1 BZ2 DX3 YB HZ AG AY DX2 PA
CQ1 1
000 0
Q X2 0
969 1 1
000 0
CQ3 0
948 5 0
938 1 1
000 0
N C 0
927 8 0
896 9 0
958 8 1
000 0
CQ2 0
917 5 0
927 8 0
927 8 0
927 8 1
000 0
YZ 0
907 2 0
896 9 0
896 9 0
896 9 0
948 5 1
000 0
SN 0
948 5 0
938 1 0
958 8 0
958 8 0
948 5 0
917 5 1
000 0
BZ1 0
938 1 0
927 8 0
927 8 0
907 2 0
917 5 0
886 6 0
927 8 1
000 0
DX1 0
927 8 0
938 1 0
896 9 0
896 9 0
907 2 0
876 3 0
938 1 0
927 8 1
000 0
DX4 0
896 9 0
886 6 0
866 0 0
845 4 0
876 3 0
845 4 0
866 0 0
917 5 0
907 2 1
000 0
CQ4 0
938 1 0
907 2 0
907 2 0
907 2 0
917 5 0
907 2 0
907 2 0
917 5 0
907 2 0
938 1 1
000 0
Q X1 0
927 8 0
917 5 0
917 5 0
896 9 0
927 8 0
896 9 0
938 1 0
886 6 0
896 9 0
886 6 0
907 2 1
000 0
BZ2 0
917 5 0
907 2 0
927 8 0
907 2 0
938 1 0
907 2 0
948 5 0
938 1 0
907 2 0
896 9 0
896 9 0
948 5 1
000 0
DX3 0
927 8 0
938 1 0
896 9 0
876 3 0
907 2 0
896 9 0
917 5 0
907 2 0
938 1 0
886 6 0
886 6 0
896 9 0
907 2 1
000 0
YB 0
762 9 0
773 2 0
773 2 0
752 6 0
783 5 0
835 1 0
773 2 0
783 5 0
773 2 0
783 5 0
804 1 0
752 6 0
783 5 0
793 8 1
000 0
HZ 0
927 8 0
917 5 0
938 1 0
917 5 0
948 5 0
917 5 0
958 8 0
927 8 0
896 9 0
907 2 0
927 8 0
938 1 0
948 5 0
896 9 0
773 2 1
000 0
A G 0
917 5 0
907 2 0
907 2 0
886 6 0
896 9 0
886 6 0
927 8 0
896 9 0
907 2 0
896 9 0
896 9 0
886 6 0
896 9 0
907 2 0
783 5 0
927 8 1
000 0
A Y 0
948 5 0
958 8 0
917 5 0
896 9 0
927 8 0
896 9 0
938 1 0
927 8 0
938 1 0
907 2 0
907 2 0
896 9 0
907 2 0
958 8 0
773 2 0
938 1 0
948 5 1
000 0
DX2 0
948 5 0
958 8 0
938 1 0
917 5 0
948 5 0
917 5 0
958 8 0
948 5 0
938 1 0
886 6 0
907 2 0
938 1 0
927 8 0
938 1 0
773 2 0
938 1 0
927 8 0
958 8 1
000 0
PA 0
896 9 0
907 2 0
886 6 0
886 6 0
917 5 0
886 6 0
907 2 0
896 9 0
886 6 0
855 7 0
896 9 0
886 6 0
876 3 0
886 6 0
783 5 0
886 6 0
896 9 0
907 2 0
948 5 1
000 0
3
3
由基因遗传相似度可知,杭白芷与川白芷之间
的遗传相似度值分布在0
948 5~ 0
855 7, 该值小
于川白芷栽培居群间的相似度值, 而祁白芷与禹白
芷样品之间的遗传相似度值为0
886 6, 该值较杭白
芷与川白芷之间的遗传相似度值略低。分析原因可
能是由于不同产区相距较远,气候、土壤等地理环境
相差较大,在一定程度上产生了遗传分化。
3
4
山东白芷与亳白芷之间的遗传相似度值为
0
927 8与0
948 5, 相似度较高。这与前期的产区
调查中了解到的菏泽栽培的白芷多数从亳州引种,
与亳白芷是一个系列相一致。
3
5
兴安白芷与所有栽培样品的遗传相似度值分
布在0
752 6~ 0
835 1,相似度较差,与栽培样品之
间存在显著差异,遗传关系均较远。
3
6
依据基因遗传相似度将所有样品进行 UPG-
M A 聚类得树状图, 聚在一起的居群表明它们有较
近的亲缘关系。从聚类图中可以看出 20个居群聚
成两支:栽培白芷聚成一支,兴安白芷单独为一支。

1629
中草药
Chinese Traditional and Herbal Drugs
第 40 卷第 10 期 2009年 10 月
在第一类中, 所有白芷样品的聚类没有表现出明显
规律性,即不同产地栽培白芷间遗传差异较小, 这与
前人研究认为四大栽培白芷不应做类的区分相一
致[ 1~ 3] 。
参考文献:
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黄连遗传多样性的 ISSR分析
张春平1 ,何
平1 * ,胡世俊2 ,王瑞波1 , 张益锋1 ,刘长坤1 ,高
姗1
( 1
西南大学生命科学学院 三峡库区生态环境教育部重点实验室, 重庆市三峡库区植物生态与资源重点实验室,
重庆
400715; 2
中国科学院昆明植物研究所, 云南 昆明
650204)
摘
要: 目的
对野生黄连进行遗传多样性研究。方法
通过 ISSR 技术对 7 个野生黄连居群共 78 个个体进行遗
传多样性分析。结果
用 12 个随机引物共扩增出 106 条清晰条带, 其中 72 条具多态性, 平均多态性位点比率为
67
92% , Nei
s 基因多样性指数 H = 0
180 3, Shannon 多样性指数 I= 0
283 2,遗传分化指数 Gst= 0
681 5,遗传距
离和遗传一致度分别为: 0
089 4~ 0
184 6和 0
832 1~ 0
912 7。结论
黄连种水平上具有较高的遗传多样性 ,遗
传变异主要存在于居群间, 遗传多样性与地理关系表现出明显的相关性, ISSR 可以作为研究遗传多样性及遗传分
化的有效标记。
关键词: 黄连;遗传多样性; ISSR ;聚类分析; 遗传分化
中图分类号: R282
7


文献标识码: A


文章编号: 0253- 2670( 2009) 10- 1630-05
ISSR Analysis for genetic diversity of Coptis chinensis
ZH ANG Chun-ping1 , H E Ping 1 , H U Sh-i jun2 , WANG Ru-i bo1 , ZH ANG Y-i feng 1 ,
LIU Chang-kun
1
, GAO Shan
1
( 1
Key Labor ator y ( M inistr y of Education) of Eco- environments o f Three Go rges Reser voir Reg ion, Chongqing Key Labor a-
tor y o f Plant Ecolog y and Resources Resear ch fo r Three Go rges Reser voir Reg ion, School of L ife Sciences, Southwest Univer-
sity, Chongqing 400715, China; 2
Kunming Institute o f Bo tany , Chinese Academy of Sciences, Kunm ing 650204, China)
Abstract: Objective
T o discuss the genet ic diversity of Cop ti s chinensi s
Methods
T he genetic diver-
sity o f 78 individuals from seven populations w as analy zed by inter-sim ple sequence repeat ( ISSR)1 Results
T w elv e prim ers w ere selected to produce highly reproducible ISSR bands1 Am ong 106 amplified bands, 72
showed polym orphism, the per centage of po lymo rphic bands reached to 671 92%1 Neic s gene div ersity in-
dex ( H ) w as 01 180 3, Shannon infor mat ion index ( I) w as 01 283 2, G st w as 01 681 51 The genet ic distance
coeff icient and genet ic similarity w ere 01 089 4 ) 01 184 6 and 01 832 1 ) 01 912 7, respect ively1 Conclusion
C1 chinensi s holds high genet ic div ersity and the majority of genet ic variat ion occurs among the popula-
#1630# 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 40 卷第 10 期 2009年 10 月
* 收稿日期: 2008-11-08 基金项目:国家自然科学基金资助项目( 30070080)作者简介:张春平( 1982 ) ) ,男,山东潍坊人,博士,主要从事植物资源学与植物分子生物学方面的研究。
Tel: 13667652727 E-m ail : chun pingzhang520@ 1631 com
* 通讯作者 何 平 Tel: ( 023) 68254122 E-mail: h eping196373@ 1261 com