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Optimization of ISSR-PCR reaction system for Chrysanthemum morifolium based on analysis of variance

基于方差分析优化菊花ISSR-PCR反应体系



全 文 :与否 ,没有酶的催化 ,反应无法进行。因此 ,寻找合
适浓度的 T aq DNA 聚合酶是实验的重要任务。但
是 ,酶的活性又与 Mg2 + 相关联 ,合适的 Mg2 + 浓度
又是决定酶活性的重要因素。所以 ,笔者采用了酶
与 Mg2 + 的二因子交叉试验 ,通过不同的搭配 ,找出
最适的浓度组合。值得注意的是 ,不同厂家 ,甚至同
一厂家不同批次的酶 ,其活力都存在着差异。为了
减少实验误差 ,应该尽量使用同一厂家生产的同一
批次的酶。
dN TP 是扩增的主要原料 , 其浓度过高时 ,
dN TP 分子中的磷酸基团会定量地与 Mg2 + 结合 ,使
游离的 Mg2 + 浓度降低 ,与酶竞争 Mg2 + ,使得酶的
活性降低 ,扩增产物大大减少。并且还会导致 PCR
错配 ,出现非特异性扩增 ,影响结果。浓度过低 ,又
会影响扩增的产量。因此 ,合适的 dN TP 浓度也是
十分关键的。本实验通过梯度设置 ,得到了合适的
dN TP 浓度。ISSR 对模板的浓度要求并不高 ,只要
是在一定的范围内 ,多样性条带不会有变化 ,但是产
量则有不同。一般而言 ,模板的浓度越高 ,产量
越高[ 12 ] 。
由于 ISSR2PCR 所用的每条引物碱基组成和数
量是不同的 ,因此 ,每条引物都有适合自己的退火温
度。退火温度有时候并不严格等于其 Tm 值 ,而是
在 Tm 值附近波动。在 PCR 反应中 ,过低的温度在
保证模板与引物结合的同时 ,也使得模板与引物之
间未完全配对的位点得到扩增 ,产生了所谓的错误
扩增。因此 ,在允许的温度范围内 ,较高的温度会提
高反应的特异性 ,减少非特异性产物的生成。在本
实验中 ,每条引物都要单独摸索退火温度 ,其基本的
原则是逐步递缩法[13 ] ,即首先设置较宽的温度梯
度 ,找到大体合适的温度范围之后 ,再把此范围的温
度细分 ,直至找到合适的温度为止。
因为分子标记实验受很多因素的影响 ,因此要
尽量严格地控制各反应因素 ,减少不必要的误差出
现。并且实验要重复多次 ,取稳定的条件作为最终
反应条件 ,从而得到最佳实验结果。
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基于方差分析优化菊花 ISSR2PCR反应体系
邵清松1 ,2 ,郭巧生1 3 ,谢作成1 3
(11 南京农业大学中药材研究所 ,江苏 南京  210095 ; 21 浙江林学院 ,浙江 杭州  311300)
摘 要 :目的  对影响药用菊花 ISSR2PCR 扩增效果的一些因素进行优化 ,为进一步研究其遗传多样性奠定基础。
方法  基于方差分析方法 ,利用正交试验从 Taq酶、Mg2 + 、dN TP 和引物等 4 因素 3 水平对药用菊花反应体系进行
优化。结果  药用菊花 ISSR2PCR 的最佳反应体系 :在 20μL 的反应体系中 , Taq酶 1100 U ,Mg2 + 2100 mmol/ L ,
·482· 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs  第 40 卷第 2 期 2009 年 2 月
3 收稿日期 :2008204212
基金项目 :国家科技攻关计划项目 (2004BA721A20) ;国家“十一五”科技支撑计划项目 (2006BAI06A12211)
作者简介 :邵清松 (1980 —) ,男 ,浙江温州人 ,博士研究生 ,主要从事药用植物遗传多样性及中药资源开发与利用方面的研究。3 通讯作者 郭巧生 Tel : (025) 84396591  E2mail :gqs @njau1edu1cn
dN TP 0120 mmol/ L ,引物 0150μmol/ L 。结论  Taq酶、Mg2 + 、dN TP 等对 ISSR 反应结果有极显著影响。所建立
的药用菊花 ISSR 反应体系具有标记位点清晰、反应系统稳定、检测多态性能力较强、重复性好等特点 ,可用于药用
菊花的遗传多样性研究。
关键词 :菊花 ; ISSR 反应体系 ;优化
中图分类号 :R28212    文献标识码 :A    文章编号 :025322670 (2009) 0220284204
Optimization of ISSR2PCR reaction system for Chr ysa nt hemum mori f olium
based on analysis of variance
SHAO Qing2song1 ,2 , GUO Qiao2sheng1 , XIE Zuo2cheng1
(11 Institute of Chinese Medicinal Materials , Nanjing Agricultural University , Nanjing 210095 , China ;
21 Zhejiang Forest ry University , Hangzhou 311300 , China)
Abstract : Objective  To establish and optimize ISSR2PCR systems of Chrysant hem um mori f ol i um and
lay the foundation for it s genetic diversity research1 Methods  Based on t he analysis of variance , an or2
t hogonal design was used to optimize t he ISSR2PCR amplification system on C1 mori f ol i um by four factors
( T aq polymerase , Mg2 + , dN TP , and primer) at t hree concent ration levels , respectively1 Results  A suit2
able ISSR reaction system was const ructed wit h t he 20μL reaction system containing 1100 U T aq polymer2
ase , 2100 mmol/ L Mg2 + , 0120 mmol/ L dN TP , and 01 50μmol/ L p rimer1 Conclusion  ISSR2PCR is sig2
nificantly influenced by the concent ration of T aq polymerase , Mg2 + , and dN TP1 This ISSR2PCR system
could provide clear bands , reliable reaction system , and abundant polymorp hisms . It is p roved to be suit2
able for t he st udy of t he genetic diversity of C1 mori f ol i um1
Key words : Chrysant hem um mori f ol i um Ramat1 ; ISSR reaction system ; optimization
  菊花为菊科菊属植物菊 Chrysant hem um
mori f ol i um Ramat1 的干燥头状花序 ,为常用中药 ,
具有散风清热、平肝明目等功效 ,用于风热感冒、头
痛眩晕、目赤肿痛、眼目昏花等病症。我国药用菊花
具有悠久的历史 ,分布广泛 ,类型多样 ,根据产地的
不同 ,主要有杭菊、贡菊、亳菊、滁菊、怀菊、济菊和祁
菊等类型。由于经过长期的相互引种栽培 ,造成了
地区间药用菊花类型的混杂。据初步调查 ,药用菊
花种质资源在形态特征、内在质量和产量等方面均
有较大差异 ,但彼此间遗传背景、亲缘关系尚不清
楚 ,故有必要运用新的技术手段加强药用菊花种质
资源遗传多样性研究。简单序列重复区间扩增 (in2
ter simple sequence repeat s , ISSR)是 Zietkiewicz 等
于 1994 年创建的一种 DNA 标记技术。ISSR 技术
基于 PCR 的分子标记技术 ,它对两个序列相同但方
向相反的微卫星重复序列之间的区域进行扩增 ,具
有操作简单、成本低、快速、灵敏、检测多态性能力
强、所需 DNA 模板量少等优点 ,其产物的多态性比
随机扩增多态 DNA ( RA PD)丰富 ,而且比 RA PD 技
术更为稳定可靠 ,重复性更好[1 ] 。目前 ISSR 技术
已用于植物品种鉴定[2 ,3 ] 、遗传作图[4 ,5 ] 、遗传多样
性[6 ,7 ]和居群遗传学[ 8 ]等研究中。
本研究基于方差分析方法 ,采用正交设计方法
对影响药用菊花 ISSR2PCR 反应体系的 4 个主要因
素 ( T aq酶、Mg2 + 、dN TP、引物) 的浓度 (数量) 在 3
个水平上进行优化试验 ,选取最佳因素水平 ,建立药
用菊花 ISSR2PCR 最佳反应体系 ,为开展药用菊花
种质资源多样性评价、新品种鉴定和亲缘关系分析
等提供技术支撑。
1  材料与方法
111  材料 :供试材料为搜集到的我国药用菊花主产
区的 35 份种质 ,经郭巧生教授鉴定。材料取自南京
农业大学中药材研究所药用菊花种质资源圃。采取
幼嫩叶片 ,液氮速冻后置于 —70 ℃冰箱保存备用。
112  方法
11211  基因组 DNA 提取 :采用改良的 CTAB 法[9 ]
提取基因组 DNA ,018 %琼脂糖凝胶电泳检测 , Ep2
pendorf 公司生产的 Bio Photometer 核酸检测仪检
测 DNA 溶液浓度 ,并将浓度稀释至 30 ng/μL 。
11212  ISSR2PCR 反应体系的正交试验 :以黄药菊
DNA 为试材 ,针对影响 PCR 反应的 T aq酶、Mg2 + 、
dN TP、引物 4 个因素 ,选用 L 9 (34 ) 正交表在 3 个水
平上试验 ,L 9 (34 )正交设计方案见表 1。
  将表 1 的 9 个处理重复 2 次 ,在 M J Research
公司生产的 P TC —200TM 型扩增仪上进行扩增 ,反
应体系为20μL ,引物为 ISSR2 Y11 ( GA ) 8 T ,除上
·582·中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs  第 40 卷第 2 期 2009 年 2 月
表 1  PCR扩增体系 L9 ( 34 )正交设计
Table 1  Orthogonal design of L9 ( 34 ) for PCR
试验号
Taq酶/
U
Mg2 + /
(mmol ·L - 1)
dN TP/
(mmol ·L - 1)
引物/
(mmol ·L - 1)
1 0150 1150 0110 01 30
2 0150 2100 0115 01 40
3 0150 2150 0120 01 50
4 1100 1150 0115 01 50
5 1100 2100 0120 01 30
6 1100 2150 0110 01 40
7 1150 1150 0120 01 40
8 1150 2100 0110 01 50
9 1150 2150 0115 01 30
述变化因素外 ,还含有 1 ×PCR buffer ,60 ng 模板
DNA。反应程序为 :94 ℃预变性 5 min ;94 ℃变性
45 s ,55 ℃退火 40 s ,72 ℃延伸 70 s ,循环 45 次 ;72
℃延伸 7 min ;4 ℃保存。PCR 产物用 115 %琼脂糖
凝胶电泳检测 ,EB 染色 ,电泳结束后在上海培清科
技有限公司生产的 J S —380 型凝胶成像分析仪上观
测并照相。
11213  优化体系应用 : 根据以上试验结果确定
ISSR2PCR的最佳反应体系和扩增程序 ,对我国不同
产地的 35 份菊花种质材料进行 DNA 扩增 ,对筛选
出的体系和扩增程序进行稳定性检测。
2  结果与分析
211  正交试验结果及数据处理 :根据 L 9 (34 ) 正交
试验 PCR 产物电泳结果 (图 1) ,按照遗传多样性分
析要求 ,依据扩增出的谱带特异性与敏感性即谱带
多少、亮度的强弱和杂带的有无对 PCR 扩增结果从
高到低依次打分。谱带越多、亮度越强、又无杂带则
评分越高。最好的处理定为 9 分 ,最差的处理定为
1 分 ,以这两个处理的结果为比较标准 ,再将其他处
理的谱带结果与这两个标准比较依次评分 ,对两次
重复分别独立统计 ,依处理得到的两次记分结果分
别为 :5、4、2、7、9、3、8、6、1 ;4、5、3、6、9、2、8、7、1。
212  各因素对 ISSR2PCR 反应影响的方差分析 :用
1~92处理代号参见表 1  M2DL 2000
1 —92t reat ment number and t reat ment as showed in Table 1  M2DL 2000 marker
图 1  ISSR2PCR正交试验结电泳图
Fig11  Electrophoretogram of ISSR2PCR orthogonal design
SPSS 1310 统计软件对正交试验结果进行方差分析
(表 2) 。结果表明 , T aq 酶数量、Mg2 + 和 dN TP 浓
度对实验结果有极显著的影响 ( P < 0101) ,引物浓
度对实验结果影响无显著性 ( P < 0105) 。根据两次
记分结果分别计算 T aq 酶、Mg2 + 、dN TP 和引物各
反应梯度 PCR 结果均值 ,进一步对各因素的不同水
表 2  PCR反应各因素正交设计方差分析
Table 2  Analysis of variance for factors of PCR reaction
变异来源 自由度 均方 F值 显著水平
Taq酶数量 2 71 167 211 500 01000
Mg2 + 浓度 2 401 667 1221 000 01000
dN TP 浓度 2 101 500 311 500 01000
引物浓度 2 01 167  01 500 01622
误差 9 01 333
平进行多重比较。
21211  Taq 酶数量的影响 :对 Taq 酶用量进行因素 内多重比较 ,结果表明 ,20μL 反应体系中 , Taq 酶不同的反应梯度只有 1100~1150 U 差异不显著 , P 值为 01088 ,其余梯度之间差异均达到了极显著。从图2 反应结果均值与酶量的关系图中可以看出 , Taq 酶活性过低 ,PCR 反应的敏感性差 ,扩增的条带少 (1~3号处理) ,所能提供的信息少。酶量在0150~1100 U时 ,均值随酶量的增加而递加 ,在 1100 U 时 ,达到最高 ,继续增加酶量 ,均值下降 ,故选择 1100 U 作为ISSR2PCR反应体系中酶的最佳浓度。21212  Mg2 + 浓度的影响 :Mg2 + 主要是通过改变聚合酶的活性对 PCR 反应结果产生影响。Mg2 + 的均值极差分析结果为 41667 ,是 4 个影响因子中极差值最大的 ,说明 Mg2 + 浓度是影响 ISSR2PCR 的最重要因素。对 Mg2 + 进行因素内多重比较 ,结果表明 , 20 μL 反应体系中 , Mg2 + 的反应梯度只有
·682· 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs  第 40 卷第 2 期 2009 年 2 月
1150~2100 mmol/ L 差异不显著 , P 值为 01450 ,其
余梯度之间差异都极显著。从图 3 反应结果均值与
Mg2 + 浓度的关系图中也可以看出 , Mg2 + 浓度在
2100~2150 mmol/ L 时 ,结果均值随着 Mg2 + 浓度
的增加而递减 ,在 2100 mmol/ L 时为最高。故在 20
μL 反应体系中选择 2100 mmol/ L 作为 ISSR2PCR
反应体系中 Mg2 + 的最佳浓度。
21213  dN TP 浓度的影响 : dN TP 作为 PCR 反应
的原料 ,量太少会使扩增反应进行不完全 ,而过多用
量会使 dN TP 分子中的磷酸基团能定量地与 Mg2 +
结合 ,使实际反应中 Mg2 + 的浓度下降而影响聚合
酶的活力。对 dN TP 进行因素内多重比较 ,结果表
明 ,20 μL 反应体系中 , dN TP 的反应梯度只有
0110~0115 mmol/ L 差异不显著 , P 值为 01081 ,其
余梯度之间差异都极显著。从图 4 反应结果均值与
dN TP 浓度的关系图中也可以看出 , dN TP 浓度在
0115~0120 mmol/ L 时 ,结果均值随着 Mg2 + 浓度
的增加而递加 ,在 0120 mmol/ L 时为最高。故在 20
μL 反应体系中选择 0120 mmol/ L 作为 ISSR2PCR
反应体系中 dN TP 的最佳浓度。
21214  引物浓度的影响 :引物浓度过低可能会无扩
增带 ,而浓度过高则会出现非特异性扩增 ,产生模糊
小片断和引物二聚体。对引物浓度进行因素内多重
比较 ,结果表明 ,20μL 反应体系中 ,引物的各反应
梯度之间差异均不显著 , 均值极差分析结果为
01334。从图 5 反应结果均值与引物浓度的关系图
中也可以看出 ,引物浓度在 0130~ 0150 μmol/ L
时 ,结果均值随着引物浓度的增加而递加 ,在 0150
μmol/ L 时为最高。故在 20 μL 反应体系中选择
0150μmol/ L 作为 ISSR2PCR 反应体系中引物的最
佳浓度。
213  ISSR2PCR 反应体系应用 :根据以上试验结果
确定的 ISSR2PCR最佳反应体系和扩增程序 ,对 35
份菊花种质材料进行 DNA 扩增 ,以检测确定的
ISSR2PCR反应体系的应用可靠性。结果见图 6。
35 份药用菊花种质材料上都能扩增出清晰、重复性
好、多 态 性 高 的 DNA 谱 带 , 表 明 已 确 立 的
ISSR2PCR反应体系稳定可靠 ,可用于药用菊花遗传
多样性分析、种质资源鉴定等研究。
3  讨论
ISSR2PCR 反应对模板浓度的要求范围较宽。
冯富娟等[10 ] 在进行红松 ISSR2PCR反应体系优化
·782·中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs  第 40 卷第 2 期 2009 年 2 月
图 6  35 份药用菊花种质 ISSR扩增的结果
Fig16  ISSR Amplif ication of tested thirty2f ive medicinal C1 mori f olium germplasm
时证实模板纯度不会影响扩增结果 ,模板浓度在
10~200 ng/μL 扩增结果相同。因此 ,本研究在进
行优化时没有考虑模板纯度和浓度对反应体系的影
响 ,采用30 ng/μL作为模板浓度进行 PCR 扩增 ,取
得了良好的扩增效果。
  以往对 PCR 体系的优化试验 ,大多采用单因素
梯度试验来进行最佳水平的摸索 ,不能兼顾到各因
素间的交互作用 ,且多数单因素试验仅对扩增结果
作直观分析 ,并未进行统计分析 ,无从考察各组分不
同水平对扩增结果影响的差异显著性。本研究基于
方差分析方法 ,采用 L 9 (34 ) 正交设计对影响药用菊
花 ISSR2PCR 反应体系的 4 个因素 ( T aq 酶 ,Mg2 + ,
dN TP ,引物)在 3 个水平上进行的优化。系统地研
究了不同因素和不同水平对 ISSR2PCR 的扩增结果
影响 ,建立了菊花 ISSR2PCR 反应体系 ,即在 20μL
的反应体系中 , T aq 酶 1100 U ,Mg2 + 2100 mol/ L ,
dN TP 0120 mmol/ L ,引物 0150μmol/ L ;扩增程序
为 :94 ℃预变性 5 min ;94 ℃变性 45 s ,55 ℃退火
40 s ,72 ℃延伸 70 s ,循环 45 次 ;72 ℃延伸 7 min。
在正交试验中 ,某一因素对扩增结果的影响是通过
固定其浓度 ,而动态变化其他多种组分浓度时获得
的平均结果。所取得的结果包含了更多的信息 ,且
工作量较小 ,数据分析简易 ,并可分析交互作用。但
该方法也存在局限性 ,如对试验结果本身的评价带
有主观成分 ,打分的先后次序直接影响分析结果 ,使
影响因素最佳反应水平的确定缺乏可靠性。如何建
立对 PCR 扩增结果评判的客观标准 ,提高试验结果
的可信度和易操作性 ,对于促进 ISSR2PCR 技术的
发展具有重要价值。
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中国药学会 6 种期刊入选“中国精品科技期刊”
2008 年 12 月 10 日 ,在北京举行的“中国科技论文统计结果新闻发布会”上 ,中国药学会主办的《药学学
报》、《中国药学杂志》、《中草药》、《中国新药杂志》、《中国医院药学杂志》、《中国中药杂志》共 6 种期刊被评为
“中国精品科技期刊”。
国家科技部自 2000 年以来立项进行“中国精品科技期刊战略研究”,“中国精品科技期刊”是指在某一学
科内质量和水平较高、在国内具有较高影响且具有一定发展潜力的科技期刊。“中国精品科技期刊”的遴选
指标由定量指标和定性指标两部分组成 ,遴选时以定量指标为主 ,定性指标为辅。定量指标主要包括学术质
量水平指标和国际竞争力水平指标。定性指标主要是指期刊的可持续发展潜力指标。2008 年首批“精品科
技期刊”由 23 种中国国际化精品科技期刊和 300 种中国精品科技期刊组成。
·882· 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs  第 40 卷第 2 期 2009 年 2 月