全 文 ：·748· 中草菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第5期2008年5月
药材与资源
12种翻白草种质资源遗传多样性的ISSR分析
罗明佶1，伍贤进孙，彭 帅1，刘选明1
(1．湖南大学生命科学与技术研究院生物能源与材料研究中心，湖南长沙410082；
2．怀化学院生物工程系，湖南怀化418008)
摘 要：目的进行翻白草Potentilladiscolor种质资源的遗传多样性研究。方法对12份翻白草种质进行ISSR分
析。利用POPGENE1．32软件分析遗传相似系数，UPGMA方法聚类，构建亲缘关系系统图。结果12条引物共得
到128条扩增条带，其中有101条呈现多态性，占78．91％。遗传相似系数变化范围0．1792～o 6325。聚类结果显
示翻白草种质亲缘关系与地理分布有一定相关性，可以看出来源于同一地区的部分翻白草种质聚在一起，呈现出
一定的地域性分布规律。结论翻白草的遗传多样性水平较高。种质问的亲缘关系和地理位置有一定关系。
关键词：翻白草dSSR；种质资源；遗传多样性
中图分类号：R282．2 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2008)05—0748一04
Geneticd versityof12speciesofgermplasmresourcesforPotentilladiscolor
basedonISSRanalysis
LUOYue—jil，WUXian—jin2，PENGShuail，LIUXuan—ruin91
(1．InstituteofLifeScienceandBiotechnology，BioenergyandBiomaterialResearchCenter．HunanUniversity，Changsha
410082，China；2．DepartmentofBioengineering，HuaihuaCollege，Huaihua418008，China)
Abstract：ObjectiveTostudythegeneticd versityofgermplasmre ourcesforPotentilladiscolor．
MethodsTwelvespeciesofgermplasmre ourcesforP．discolorwereanalyzedbyISSRmolecular
markers．TomakeupthesystematicdiagramofgeneticrelationshipbyPOPGENE1．32software。cluster
byUPGMAmethod，andestablishthedendrogram．ResultsAtotaof128ISSRbandswerescoredfor
12primers，amongwhich101werepolymorphicbands．Theaveragepercentageofpolymorphicbandswas
78．91％．Geneticsimilaritycoefficientwaschangedfrom0．1792tO0．6325．Byclusteranalysis，the
geographicaldistributionismutuallyre atedOtherelationshipofgermplasmresourcesforP．discolorand
itwasalsoshowedsomeofP．discolorfr mthesameregionwereinthesamegroupwhichpresentedth
ruleofgeographicaldistributionin hetestedmaterials．ConclusionThediversitylevelofthedifferent
germplasmre ourcesforP．discolorhigherandtherelationshipofP．discolorcor elateswiththe
geographicallocationinsomeway．
Keywords：PotentilladiscolorBunge；ISSR；germplasmresources；geneticdivers ty
翻白草PotentilladiscolorBunge又名天青地
白、白头翁、叶下白、鸡腿苗、结梨，为蔷薇科委陵菜
属植物，生于山坡、路旁、草地，主产于河北、北京、安
徽[1]。翻白草具有止血、止痢、解毒的药用功效，是一
种重要的药用植物。近年来对翻白草的研究多集中
于其化学成分的分析和对I型糖尿病、乳腺炎等疾
病的治疗方面研究[2]，而在遗传多样性和亲缘关系
方面还没有深入的研究。
简单重复序列区间ISSR(intersimplesequence
repeat)是由Zietkiewicz等口]1994年发展的一种基
于微卫星系列的新的分子标记技术，具有简便、不需
预先知道序列信息、重复性强等特点，广泛用于植物
的分子标记和遗传育种。本实验采用该技术从DNA
分子水平分析了不同产地翻白草的遗传多样性，为
收稿日期：2007-07—27
基金项目：国家科技摹础条件平台建设项目：重要野生植物种质资源采集保存技术规范和标准研制及整合共享(2005DKA21006)
作者简介：罗弱佶(1983一)，女，湖南株洲人，现读湖南大学生命科学与技术研究院生物化学与分子生物学方向硕士研究生．从事药用植
物种质资源方面的研究。Tel：13467674559E—mail：bell0829@sohu．corn
*通讯作者伍贤进E—mail：hhuxianjin@163．corn刘选明E—mail：sw—xml@hnu．cn

万方数据
中草药 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第5期2008年5月·749·
翻白草种质鉴定、合理利用和保护翻白草种质资源
提供科学依据。
1材料与方法
1．1材料
1．1．1植物材料：供试材料9份取自于湖南省，1份
取自北京中国科学院植物研究所，2份取自湖北大
悟县。材料均经过湖南师范大学生命科学院刘克明
教授鉴定。每个产地均随机选取5株以上的成熟植
株，在植株上选取幼嫩叶片带回实验室，一80℃超
低温冰箱中保存备用。室内实验在湖南大学生命科
学与技术研究院植物分子生物学实验室进行。各材
料基本情况见表l。
表1翻自草种质资源来源
Table1 GermplasmresourcesofP．discolor
1．1．2主要试剂：MBITaq酶购于晶美生物有限
公司；DNAMarker购于北京天为时代科技有限公
司；其他生化试剂为国产分析纯。
1．1．3 仪器设备：PCR仪为德国Biometra公司生
产的T—GRADIENT，离心机为德国Eppendorf公司
产品，纯水器为美国Millipore公司产品，紫外可见
分光光度计为上海光谱仪器有限公司的765P紫外
可见分光光度计，水浴锅、电泳槽等为国产仪器。
1．1．4PCR引物：所用引物参照加拿大哥伦比亚
大学UBC公司2006年公布的ISSR引物序列，由上
海博亚生物技术有限公司合成。
1．2方法
1．2．1 DNA的提取和浓度的测定：采用改进的
CTAB法，取嫩叶约2g在液氮冷冻下研磨成粉末，
转入10mL离心管中，加入3mL预热至95℃的2×
CTAB提取缓冲液(100mmol／LTris—HCIpH8．0、
20mmol／LEDTA、1．4mol／LNaCl、2％CTAB、
2％PVP、0．2％p巯基乙醇)，500肛LPB溶液(10％
CTAB、10％PVP、4％NaCl)，0．02gVE，混匀后65
℃水浴1．5h，间颠倒翻转离心管若干次，取出离心
管冷却至室温。加入500pLPB溶液，等体积氯仿一
异戊醇(24：1)，混匀，后置于摇床上来回震荡1h。
取出离心管后6000r／min离心30min。取上清，加
入1mLPB溶液，等体积氯仿一异戊醇(24：1)，混匀
后6000r／min离心10min。取上清，加入一20℃预
冷的等体积异丙醇，轻柔混匀后静置30min，出现絮
状沉淀。用玻璃钩钩出絮状沉淀，转移至一干净1．5
mL离心管中，加入70％乙醇洗涤2～3次，倒去乙
醇，让DNA自然晾干，加入500tLLTE缓冲液(10
mmol／LTris—HClpH8．0、1mmol／LEDTA)溶解
DNA，加入RNaseA1弘L，于37℃恒温水浴1h。加
入1／10体积的3mol／LNaAc，并加入2倍体积的无
水乙醇，小心混匀后，置一20℃冰箱中60min，DNA
再次呈絮状沉淀析出，用玻璃钩钩出后，置1．5mL
离心管中。70％乙醇洗涤2～3次，倒去乙醇，自然晾
干，加入100---200弘LTE缓冲液(10mmol／LTris—
HClpH8．0、1mmol／LEDTA)，4℃保存。
1．2．2ISSR—PCR反应体系：在T—GRADIENT型
PCR仪上扩增，反应体系为25肛L，包括优化后的
ddH2014．5pL，10×PCR缓冲液2．5tLL，dNTPs
2．5弘L(2mmol／L)，M92+2．5pL(2mmol／L)，引
物1弘L(10mmol／L)，DNA模板1弘L(50ng／／1L)，
TaqDNA聚合酶1U(o．4U／t．tL)，所有操作均在冰
上进行。94℃预变性5min，94℃变性30s，51℃退
火45s，72℃延伸1．5min，共循环35次，然后72℃
后延伸10min，4℃保温。
1．2．3 扩增产物的检测：将PCR产物在含有溴化
乙锭(EtBr)染料染色的1．5％琼脂糖凝胶中电泳，
电泳结束后在凝胶成像系统中照相保存。
1．3数据分析：同一引物，同一位点，根据扩增产物
的有(1)无(O)得到二元资料，形成0、1矩阵。用
POPGENEl．32软件进行分析，计算Nei7s遗传距
离[4]，使用MEGA3．1软件根据遗传距离通过
UPMGA法进行聚类分析，构建聚类图。
2结果与分析
2．1 DNA提取与优化：本实验提取的DNA呈米白
的絮状和无色的沉淀，经紫外可见分光光度计测定，
DNA在260和280nm的吸光度比值(426。／428。)为
1．76～1．85。经电泳检测显示，所提取的DNA中蛋
白质、多糖和酚类等物质基本去除，纯度较高，符合
ISSR—PCR的要求(图1)。
2．2 引物筛选：从50条加拿大哥伦比亚大学
(UBC)提供的ISSR引物序列中筛选出12条扩增条
带较多、信号强、背景清晰的引物用于ISSR分析。变

万方数据
·750· 中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第5期2008年5月
性温度根据引物的Tm值变化1～3℃。具体引物、序
列及退火温度见表2。
图1
Fig．1
表2
Table2
12种不同地区翻白草样品所提取的DNA
PatternsofDNAextractedfromP．discolor
in12differenthabitats
用于ISSR分析的12条引物厦其扩增产物
Sequencesof12primersusedinISSRanalysis
andtheiramplificationproducts
2．3 ISSR—PCR扩增结果：用筛选出的12条引物
对12份种质进行扩增，共扩增出128条DNA条带，
其中多态性DNA条带101条，占总条带数的
78．91％，每个引物扩增出的DNA条带数为7～11
条，平均为9条(表2)。这些DNA片段大小主要集中
在300～1500bp(图2)。以上数据表明翻白草种质
相对分子质量从F往上依次为300、500、1000、1500、2000．
2 500bp，1～12泳道分别为12个不同地区翻白草DNA扩增的
PCR产物M—MarkerMDl07
Molecularweightfromdowntoupis300，500，100，I500．
2 000，and2 500bp，1--12lanes一12differentsamples’
ISSR·-PCRproductsM—-MarkerMDl07
图2 UBC817引物对翻白草基因组的ISSR扩增结果
Fig．2AmplificationresultofISSR—PCRto
samplegenomeDNAofP．discolor
withprimerUBC817
在分子水平上的多态性是丰富的，利用ISSR分子标
记能够检测翻白草的种质资源亲缘关系。
2．4聚类分析：12份翻白草材料总Nei7S基因多样
性指数(H)为0．2938，Shannon信息指数(I)为
0．4362。12份材料Nei’s基因遗传距离在0．1792～
0．6325(表3)。从图3中可以看出，在距离线约0．2
处，可将供试的12份翻白草材料分成3个大类。第1
大类包括1、5号共2份材料；第2大类包括2-．一4号、
6～11号共9份材料；12号材料单独成一类。其中第
2大类的2、3、6号聚成一亚类，7、11号和9、11号聚
成一亚类，4、8号聚成一亚类。取自湖南省怀化溆
浦竹彬山的7号材料与取自湖南省怀化溆浦杉木湾
1 号的遗传距离系数最近为0．1792，遗传距离系数
最远的是取自湖南省衡阳衡山的5号材料与取自北
京中科院植物研究所的12号材料，为0．6325。
表3 12份翻白草材料的遗传距离(对角线下)和遗传相似性(对角线上)
Table3 Geneticd stances(belowdiagonal)andgenetici entities(abovediagonal)in12species
ofP．discolormaterialsb sedonISSRanalysis

万方数据
中草药 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第5期2008年5月·751·
图3 12份翻自草材料基于ISSR遗传距离
系数的聚类图
Fig．3UPGMADendrogramof12speciesofP．discolor
materialsfromISSRgeneticd stances
3讨论
ISSR分析具有技术操作简单、成本低、条件稳
定、快速、灵敏、检测多态能力强、所需DNA模板量
少等优点[5]，目前已广泛应用于药用植物的育种、资
源评定、多样性保护、亲缘关系鉴定、品种鉴定等方
面，对于药用植物的利用、开发及保护起到了重要的
作用‘引。
从ISSR—PCR扩增和聚类分析的结果来看，来
自不同产地的12份翻白草种质的遗传多样性为
78．91％，各种质问遗传相似系数均在60％～80％，
表明供试材料之间的亲缘关系较远。许多遗传表明，
遗传多样性的高低与温度、干扰、生境复杂程度等因
素相关，翻白草没有大量人工栽培，多数为野生，各
地之间很少存在引种的现象，生境由于地理位置的
不同而有所不同，所以聚类分析结果存在一定的地
理界限。
Hamrich和Godtc73通过统计学验证表明，在物
种水平上影响遗传变异的因素依次为：分类地位、分
布范围、生活史、繁育系统和种子散播机制；而在居
群水平上，影响因素依次为：繁育系统、分布范围、生
活史、分类地位和种子散播机制。翻白草主要进行的
是有性繁殖，其花具有引诱昆虫传粉的特征，而且居
群规模大，密度高，风媒传粉效率高，因此相同地区
的翻白草居群间的差异不大，其差异来自翻白草不
同的分布范围。遗传关系最近的为湖南省怀化溆浦
7、11号材料，其次湖北省大悟县白云镇的4号和湖
北省大悟县城关镇的8号也聚成一小类，最后湖南
省株洲攸县岭北坪村的2号材料、湖南省株洲攸县
平阳庙的3号和湖南省株洲攸县高枧乡高枧村的6
号材料聚成一类，因此聚类结果有了明显的地域差
异。湖南邵阳的1号材料和湖南衡阳衡山的5号材料
聚成一类，推测与两地都属于湘南地区有关。北京中
科院的12号材料单独聚成一大类，有明显的地理界
限。各个不同地区的翻白草在植株形态上几乎无差
别，遗传距离系数与聚类分析表明，ISSR分子标记
技术可将翻白草供试的全部材料区分开来，同时也
进一步阐明了翻白草种质资源在分子水平上确实存
在遗传差异，为翻白草种质资源的保护提供遗传基
础。需要指出的是，本研究材料的采集不够广泛，大
部分采自湖南地区，要探明翻白草的遗传关系和地
理位置及生境的规律还需进一步的研究。
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万方数据
12种翻白草种质资源遗传多样性的ISSR分析
作者： 罗玥佶， 伍贤进， 彭帅， 刘选明， LUO Yue-ji， WU Xian-jin， PENG Shuai， LIU
Xuan-ming
作者单位： 罗玥佶,彭帅,刘选明,LUO Yue-ji,PENG Shuai,LIU Xuan-ming(湖南大学生命科学与技术研
究院生物能源与材料研究中心,湖南,长沙410082)， 伍贤进,WU Xian-jin(怀化学院生物工
程系,湖南,怀化418008)
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2008,39(5)
被引用次数： 10次

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