全 文 ：淫羊藿多糖硫酸化修饰条件的优化
卢　宇1 ,胡元亮1X ,孙峻岭1 ,黄小燕1,王德云1,赵晓娜1,王效田2
( 1. 南京农业大学 中兽医学研究室,江苏 南京　210095; 2. 南京市浦口区兽医站,江苏 南京　210095)
摘　要: 目的　优化淫羊藿多糖硫酸化修饰的最佳条件。方法　采用氯磺酸-吡啶法。以硫酸基取代度和糖的质量
分数为指标, 采用L 9( 34)正交试验对反应温度、试剂配比和反应时间进行优选。结果　反应温度对修饰的影响最大,
适宜的修饰条件为反应温度80 ℃, 氯磺酸与吡啶的体积比在1∶8～1∶10, 反应时间2～3 h。结论　采用优化的条
件对淫羊藿多糖进行硫酸化修饰可以获得理想的硫酸化淫羊藿多糖。
关键词: 淫羊藿多糖;硫酸化修饰; 氯磺酸-吡啶法; 试剂配比
中图分类号: R286. 1　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253- 2670( 2008) 03- 0357- 03
Optimization of sulfated modification conditions in epimedium polysaccharide
LU Yu
1
, HU Yuan-liang
1
, SUN Jun-ling
1
, Huang Xiao-yan
1
, WANG De-yun
1
,
ZHAO Xiao-na1 , WANG Xiao-t ian2
( 1. Institute o f T r aditional Chinese Veterina ry Medicine, Nanjing Agr icultur al U niver sity , Nanjing 210095, China;
2. Nanjing Pukou District Vet erinar y Workstation, Nanjing 210095, China)
Abstract: Objective　To optim ize the sulfated modif icat ion condit ions of epimedium po lysaccharide
( EPS) . Methods　EPS w as modif ied by cholo rsulfonic acid-py ridine method. L 9( 34) Orthogonal test w as
used to opt imize the r eaction temperature, reagent fo rmula , and react ion t ime with the degree o f sulfate
gr oup and carbohydrate content as index. Results　The most impor tant affect ing factor w as react ion tem-
peratur e. The opt imized modificat ion condit ions w ere the react ion temperature o f 80 ℃, the rat io o f chlo-
sulfonic acid to py ridine o f 1∶8- 1∶10, and the reaction t ime of 2- 3 h. Conclusion　The bet ter sulfated
EPS could be obtained using opt imized modification condit ions.
Key words: epimedium polysaccharide ( EPS ) ; sulfated modif icat ion; cholorsul fonic acid-pyr idine
method; reagent formula
　　硫酸化多糖也称硫酸酯多糖或多糖硫酸酯,是
指糖羟基上带有硫酸根的多糖, 其生物活性明显不
同于或显著强于天然多糖。许多天然多糖原来不具
有生物活性或生物活性很弱, 经硫酸化修饰后获得
或增强了活性 [ 1] , 尤其是抗病毒、抗肿瘤、抗艾滋病、
对免疫系统作用和抗凝等活性显著增强。淫羊藿多
糖( epimedium polysaccharide, EPS)是淫羊藿的活
性成分,具有增强免疫、抗病毒和调节内分泌系统等
多种生物活性[ 2, 3]。本研究室采用氯磺酸-吡啶法对
EPS 进行修饰,测定了硫酸化EPS 对鸡传染性法氏
囊病毒( IBDV)感染鸡胚成纤维细胞( CEF)的影响,
结果表明修饰后的EPS 抵抗IBDV 感染CEF 的活性
显著增强[ 4]。由于硫酸化修饰受多种因素的影响,筛
选出最佳修饰条件至关重要, 因此本实验考察了淫
羊藿多糖硫酸化修饰条件的优化过程。
1　材料与仪器
　　淫羊藿购于南京大华中药房,由南京农业大学
园艺学院中药学周立良副教授鉴定为箭叶淫羊藿。
氯磺酸、吡啶、蒽酮(分析纯) , 上海凌峰试剂有限公
司; ADS-7大孔树酯,安徽省蚌埠天星树脂有限公
司; DEAE Sephadex TM A-25, Amersham Bioscien-
ces; 透析袋(截留相对分子质量1 000) ,上海绿鸟科
技发展有限公司。
色谱柱、恒流泵和密度色谱混合仪,上海青浦沪
西仪器厂; 99—2恒温磁力加热搅拌器,江苏金坛新
一佳仪器厂制造; 冷冻干燥机, Labconco; 722 光栅
分光光度计,上海第三分析仪器厂。
2　方法与结果
2. 1　EPS的制备: 取箭叶淫羊藿2. 0 kg ,加 8倍水
煎煮2次, 合并滤液浓缩至2 000 mL, 缓慢加入95%
·357·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs　第39卷第 3期 2008 年3 月
X 收稿日期: 2007-07-20基金项目:国家自然科学基金资助项目( 30571360) ; 江苏省普通高校研究生科研创新计划资助项目( 2006)作者简介:卢　宇( 1978—) ,男,江苏睢宁人,博士研究生,主要从事兽医中药学与中药药理学研究。E-m ail : 2005207022@ njau. edu. cn
* 通讯作者　胡元亮　Tel: ( 025) 84395203　E-mail : ylhu@n jau . edu. cn
乙醇至含醇量达70%, 搅匀, 静置24 h,取沉淀, 挥去
乙醇,加蒸馏水溶解,重复醇沉1次。取沉淀冷冻干
燥,得粗淫羊藿多糖42. 77 g。然后用三氯乙酸法除
去蛋白, 过 ADS-7大孔树酯柱、DEAE Sephadex TM
A-25色谱柱( 0. 05～1. 0 mol/ mL NaCl溶液洗脱) ,
自来水流水透析48 h, 蒸馏水透析24 h, 冷冻干燥,
即得纯化的EPS [ 5]。
2. 2　修饰条件设计:由于反应温度、试剂配比、反应
时间对多糖硫酸酯化的影响较大 [ 6] , 在预试验的基
础上,以修饰试剂的反应温度、氯磺酸与吡啶的体积
比和反应时间为因素, 按3因素3水平的正交试验L 9
( 3
4
)设计9种修饰条件。
2. 3　酯化试剂的制备: 将带有搅拌(磁力搅拌)和冷
凝装置的三颈烧瓶置冰盐水浴中,加入25 mL 无水吡
啶, 快速搅拌, 充分冷却后,按表1设定的氯磺酸与吡
啶的体积比,边搅拌边逐滴加氯磺酸,于40 min 内加
完。反应结束后,撤去冰盐水浴和磁力搅拌装置。共
制备9份酯化试剂。
2. 4　修饰反应的操作: 分别精确称取纯化的EPS
500. 0 mg, 加入酯化试剂中,按表1设定的水浴温度
和反应时间搅拌反应, 反应结束后冷却至室温, 反应
液加入预冷的100 mL 冰水中,用15%氢氧化钠溶液
中和至pH 7. 0, 边摇边缓慢加入3倍体积的无水乙
醇,静置 24 h,离心, 取沉淀装入透析袋自来水流水
透析48 h、蒸馏水透析24 h,冷冻干燥,得9种硫酸化
淫羊藿多糖( sulfated EPS, sEPS)。
2. 5　蒽酮-硫酸法测定糖的质量分数[ 7]
2. 5. 1　标准曲线的绘制:精确称取经105 ℃恒重的
D-葡萄糖25. 0 mg 定容于100 mL 量瓶,在6支带塞
试管中分别加入葡萄糖对照品溶液0、0. 2、0. 4、0. 6、
0. 8、1. 0 mL,然后加蒸馏水至2. 0 mL,加0. 2%蒽酮
浓硫酸1. 0 mL,迅速垂直液面加入浓硫酸4. 0 mL,
混匀后在沸水浴中加热6 min,冷却后用分光光度仪
在 610 nm 处测定吸光度(以 0管吸光度值为校正
值) ,重复3次。以D-葡萄糖对照品溶液质量浓度对
吸光度值绘制标准曲线,得回归方程Y = 0. 030 6 X
+ 0. 002 3, r
2
= 0. 996。
2. 5. 2　样品测定:将待测样品经105 ℃恒重,精密
称取 2～5 mg 置于10 mL 量瓶中,加去离子水溶解
并稀释至1. 0 mg/ mL。吸取0. 4 mL 于带塞试管中
( n= 4) ,按2. 5. 1法测定各样品吸光度,求平均数后
代入回归方程,计算多糖的质量分数。
2. 6　氯化钡-明胶法测定硫酸基取代度[ 7]
2. 6. 1　标准曲线绘制: 在5支试管中分别加入100
Lg / mL 硫酸钾对照品溶液0、0. 1、0. 2、0. 3、0. 4 mL,
加去离子水至0. 4 mL,再加入0. 35 mL 三氯乙酸溶
液和0. 25 mL 氯化钡明胶溶液,混合。静置15～20
m in, 在360 nm 波长下测定浊度。同法用0. 25 mL 明
胶溶液替代氯化钡明胶溶液测定360 nm 处的吸光
度值。重复3次。用有氯化钡存在的平均吸光度值减
去此溶液无氯化钡存在的平均吸光度值为最终吸光
度值。以SO 42- 质量浓度为横坐标,吸光度值为纵坐
标, 绘制标准曲线, 得回归方程 Y = 37. 156 X -
0. 081 1, r
2
= 0. 995。
2. 6. 2　样品测定: 称取样品 ( 1～3 mg )放入盛有
1. 0 mol / mL HCl的试管中, 密封,于 100 ℃水解 6
h, 冷却后开启试管,内容物于 40 ℃减压旋转蒸干,
残渣用1. 0 mL 蒸馏水溶解。同2. 6. 1项下方法测定
有、无氯化钡吸光度的差值( n= 4) ,然后根据回归方
程和公式[取代度DS= 162×( SO 42- %) / 100- ( 96/
98×SO 42- %) ] 计算样品的硫酸基取代度。
2. 7　试验结果分析:见表1。以DS 为指标,反应温度
的影响最大,其次是反应时间,试剂配比的影响作用
最小,最佳组合为A 2B3C3 ;以糖质量分数为指标, 也
是反应温度的影响最大, 试剂配比次之,反应时间影
响最小,最佳组合为A 2B2C1。两个指标中A 因素即温
度的效应是可靠的。进一步进行方差分析,各因素影
响硫酸基取代度和糖质量分数的差异不显著( P>
0. 05)。根据本结果和从实际生产考虑,反应温度为
80 ℃,氯磺酸与吡啶的体积比应在1∶8～1∶10, 时
间2～3 h为宜。
2. 8　验证试验:进一步重复 80 ℃时3种条件,并将
反应原料(酯化试剂和淫羊藿多糖)数量增加1倍,
其他条件不变进行硫酸化反应,得到的相应多糖硫
酸酯的糖质量分数 和 DS, 分别为 48. 526%、
0. 773%, 70. 148%、0. 699%, 30. 632%、0. 841%。与
原来无显著性差异, 重复性好。笔者对9种硫酸化淫
羊藿多糖的体外抗病毒活性比较也证明, 在 80 ℃
下,氯磺酸与吡啶的体积比为1∶8, 反应3 h 获得的
sEPS5的活性最好[ 4]。
3　讨论
　　多糖硫酸酯化的方法很多,一般吡喃型多糖采
用Wolfrom 法,常用的方法有浓硫酸法、三氧化硫-
吡啶法和氯磺酸-吡啶法[ 8]。淫羊藿多糖为吡喃型多
糖, 采用氯磺酸-吡啶法修饰具有反应条件相对简
单、硫酸基取代率高、产物回收方便和收率较高等优
点[ 9] ,为大多数研究者采用。一般认为,升高温度可
以提高产物的硫酸基取代度。但本实验发现, 当温度
·358· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs　第39卷第 3期 2008 年3 月
表1　L9( 34)正交试验结果
Table 1　Results of L9( 34 ) orthogonal test
试验号 　多　糖 A 反应温度/℃ B氯磺酸与吡啶的体积比 C反应时间/ h D(误差)　 DS/ % 糖质量分数/ %
　　1 sEPS 1 　60 　　1∶ 6 　1 　1 0. 097 31. 843
　　2 sEPS 2 60 1∶ 8 2 2 0. 484 62. 474
　　3 sEPS 3 60 1∶10 3 3 1. 120 50. 949
　　4 sEPS 4 80 1∶ 6 3 2 0. 772 49. 938
　　5 sEPS 5 80 1∶ 8 1 3 0. 696 72. 380
　　6 sEPS 6 80 1∶10 2 1 0. 834 28. 049
　　7 sEPS 7 95 1∶ 6 2 3 0. 351 21. 027
　　8 sEPS 8 95 1∶ 8 3 1 0. 074 27. 699
　　9 sEPS 9 95 1∶10 1 2 0. 089 36. 190
　　DS K 1 0. 567 0. 407 0. 294 0. 335
K 2 0. 767 0. 418 0. 556 0. 448
K 3 0. 171 0. 681 0. 655 0. 722
R 0. 596 0. 274 0. 361 0. 387
糖质量分数 K 1 48. 222 34. 269 46. 804 29. 197
K 2 50. 122 54. 184 37. 183 49. 534
K 3 28. 305 38. 396 42. 729 47. 967
R 21. 817 19. 915 9. 621 20. 337
升高到95 ℃时,硫酸基的取代度和糖质量分数明显
降低,可能是淫羊藿多糖的结构被破坏,因此反应温
度宜控制在80 ℃。也有认为,提高氯磺酸的比例有
利于酯化反应,但实际操作中氯磺酸比例高,会出现
板结,搅拌困难,以致反应不均[ 6～8]。
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超滤和纳滤分离技术提取纯化地黄低聚糖的研究
董　艳1 ,高瑞昶1X ,潘　勤2,阎晓楠2
( 1. 天津大学化工学院,天津　300072; 2. 天津中新药业集团股份有限公司技术中心, 天津　300457)
摘　要: 目的　通过不同截留相对分子质量的超滤膜对地黄多糖分离纯化, 再利用纳滤膜对超滤液进行浓缩纯化。
方法　采用不同截留相对分子质量超滤再纳滤的工艺流程。结果　两次超滤得到低聚糖, 最佳操作条件为:料液质
量浓度为13～132 m g/ mL ,操作压力为 0. 25～0. 275 MPa, 温度20～40 ℃。然后采用纳滤膜对超滤液进行浓缩纯
化, 适宜工艺条件为:料温为20～40 ℃, 操作压力0. 59～0. 79 MPa,浓缩倍数可达3倍。应用超滤-纳滤技术,低聚糖
得率为46. 63% , 质量分数达到93. 3% ,凝胶过滤法验证低聚糖制品的相对分子质量低于6 000。结论　该工艺能有
效分离纯化地黄低聚糖, 简单可行,操作简便。
关键词: 地黄低聚糖;超滤; 纳滤;分离; 纯化
中图分类号: R286. 1　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253- 2670( 2008) 03- 0359- 05
·359·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs　第39卷第 3期 2008 年3 月
X 收稿日期: 2007-09-29作者简介:董　艳( 1981—) ,女,河北沧州人,硕士,研究方向为膜分离技术与化学工程。E-mail : yan yan-422@ 126. com
* 通讯作者　高瑞昶　E-mail: gaoruichang@ yahoo. com. cn