全 文 ：表 3 预测值与实测值的比较(x s, n= 3)
Table 3 Comparison of forecasted and true values
( x s, n= 3)
编号 预测值/ h 实测值/ h 偏差[ (预测值- 实测值) /预测值 100 % ] / %
处方 1 5 710 4 5 840 7 0 210 2 - 2 282 7 3 680 6
处方 2 5 943 2 5 973 7 0 168 8 - 0 513 2 2 840 6
处方 3 6 103 4 5 833 1 0 178 1 4 429 2 2 918 3
预试验中发现,当羧甲淀粉钠用量较少( 20 mg/片)
时,制剂无脉冲释药特性,仅缓慢释放药物; 其他两
因素对释药时滞影响较大, 这与盐酸青藤碱脉冲片
的释药过程有关,释药初期,脉冲片外层衣膜中凝胶
材料吸水形成凝胶层,阻滞水分渗入片芯,无药物释
放,随着释药过程进行, 衣膜凝胶层不断溶蚀变薄,
水分渗入速度加快, 片芯药物溶解扩散通过凝胶层
有少量释放,同时崩解剂吸水片芯开始膨胀, 当衣膜
凝胶层溶蚀到一定程度时, 其强度不足以承受片芯
膨胀产生的作用力, 衣膜出现破裂,药物以较快速度
释放, 实现一定时滞后的脉冲释药。外层衣膜的溶
蚀是决定盐酸青藤碱脉冲片释药时滞的关键, 而衣
膜中 HPMC/卡拉胶比例和凝胶材料用量均对衣膜
凝胶层的溶蚀有较大影响,从而决定释药时滞长短,
其中 HPMC/卡拉胶比例增加,释药时滞延长, 这与
卡拉胶形成的凝胶强度较弱, 易溶蚀有关;衣膜中凝
胶材料用量增加, 释药时滞延长,这与凝胶材料用量
增加,水化形成的衣膜强度提高,抗溶蚀能力增加有
关[ 7] 。
本实验通过星点-效应面法设计安排实验并对
结果进行方程拟合, 建立各因素和脉冲片释药时滞
之间的数学模型, 在优化处方区域,取影响因素的任
意值代入数学模型, 可准确预测脉冲片的体外释放
行为,实验值与预测结果相近,说明模型方程具有较
好的预测性, 可用于盐酸青藤碱脉冲片处方的优化。
体外释放度测定证实,盐酸青藤碱脉冲片具有
定时脉冲释药特性, 其体内释药特性及体内外相关
性还有待通过体内试验进一步证实。
参考文献:
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正交试验优选党参多糖的硫酸化工艺研究
杨淑娟1 ,胡元亮1* ,郭利伟1 , 赵晓娜1 , 范云鹏1 ,俞 涛2
( 1 南京农业大学 中兽医学研究室, 江苏 南京 210095; 2 南京市浦口区畜牧兽医站,江苏 南京 211800)
摘 要:目的 优选党参多糖硫酸化工艺。方法 用氯磺酸-吡啶法对党参多糖进行硫酸化修饰,以取代度和产物
得率为指标,用 L 9 ( 34)正交试验对试剂配比、反应温度、反应时间进行优选, 用氯化钡-明胶法测定硫酸基的取代
度。结果 试剂配比和反应时间分别对产物得率和取代度的影响最大, 氯磺酸与吡啶配比为 1 6 时产物得率最
高;反应时间为 3 h 时取代度最高,达 1 83; 各因素不同水平对产物得率和取代度的影响无显著差异。结论 综合
考虑最适宜的修饰条件为氯磺酸与吡啶配比为 1 6、反应温度 80 、反应时间 3 h。
关键词:党参多糖; 硫酸化修饰;正交试验
中图分类号: R284 2; R286 02 文献标识码: A 文章编号: 0253-2670( 2010) 07-1091-04
Optimization on sulfated technology of Codonopsis p ilosula polysaccharides by orthogonal design
YANG Shu-juan
1
, HU Yuan-liang
1
, GU O L-i w ei
1
, ZHAO Xiao-na
1
, FAN Yun-peng
1
, YU Tao
2
( 1 Institut e o f T r aditional Chinese Veter inary Medicine, Nanjing Agr iculture Univ ersity , Nanjing 210095, China;
2 Pukou Distr ict Animal H usbandry & Veter inary St ation, Nanjing 211800, China)
1091中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 7 期 2010 年 7 月
* 收稿日期: 2009- 10-22 基金项目:国家自然科学基金资助项目( 30871887) ;国家科技支撑计划课题( 2008BADB4B06)作者简介:杨淑娟( 1984 ) ,女,硕士研究生,主要从事中药多糖研究。
* 通讯作者 胡元亮 E- mail : ylhu@ njau edu cn
Abstract: Objective T o opt imize the sulfated modificat ion condit ions of Codonop si s p ilosula po lysac-
charides ( CPPS) Methods CPPS was modified by chlo rosulfonic acid-pyridine L9 ( 34 ) Orthogonal test
w as used to opt imize reagent rat io, react ion temperatur e, and react ion time, taking substitution deg ree and
product ivity as index Results The ef fects of reagent ratio and react ion t ime respect ively on product ivity
and subst itut ion deg ree were the st rongest When the ratio of chlorosulfonic acid to py ridine w as 1 6,
the product iv ity w as the highest When react ion t ime w as 3 h, the substitution degree w as the highest
reaching 1 83 T here w ere no significant dif ferences among dif ferent levels of each factor Conclusion
The opt imum modif icat ion condit ions ar e the rat io of chlo rosulfonic acid to pyridine of 16, react ion tem-
perature o f 80 , and react ion t ime of 3 h in synthet ical considerat ion
Key words: Codonop si s p ilosula poly sacchar ides ( CPPS) ; sulfated modificat ion; orthogonal test
党参 Codonop sis p ilosula ( F ranch. ) Nannf. 是
常用的补益中药, 具有补中益气、和脾胃、除烦渴等
功效,常作为人参的代用品。党参含有多糖、皂苷、
甾醇、三萜,生物碱、倍半萜内酯类及香豆素类等成
分,其中多糖的量最高。现代药理研究表明, 党参多
糖在调节机体免疫力、抗病毒、抗肿瘤、抗应激、抗氧
化等多个方面具有较好的生物活性 [ 1]。为了更进一
步提高党参多糖的生物活性, 可以对党参多糖进行
硫酸化修饰。研究表明, 硫酸化修饰能提高多糖的
生物活性。Nishimural等[ 2]定位合成了 O-2和 O-3
位硫酸酯化的新型硫酸甲壳质, 发现这两种硫酸多
糖比 O-6位硫酸酯化的多糖具有更强的抗 HIV 活
性,而且其抗凝血活性显著减小。硫酸化多糖的抗
病毒活性对于当前畜禽病毒性疾病的治疗具有极其
重要的临床意义,有望发展成为继病毒逆转录酶活
性抑制剂、蛋白酶抑制剂后的又一类潜在的新型抗
病毒药物。本实验选择党参多糖为研究对象, 采用
正交试验对党参多糖的硫酸化修饰条件进行优选,
旨在为研究党参多糖的硫酸化修饰奠定基础。
1 材料与仪器
氯磺酸、吡啶, 上海凌峰化学试剂有限公司; 硫
酸钾, 上海振欣试剂厂; 3% 三氯乙酸; 0 5% 明胶
( 5 g明胶溶于 100 mL 蒸馏水中, 4 过夜备用) ;
0 5%氯化钡-明胶( 5 g 氯化钡溶于 0 5%明胶溶液
中) ; 95%乙醇、NaOH 等, 均为分析纯。
99 2 恒温磁力加热搅拌器, 江苏金坛新一佳
仪器厂; SHZ 88水浴恒温振荡器,江苏太仓实验
设备厂;透析袋,上海绿鸟科技发展有限公司; 冷冻
干燥器,宁波新芝生物科技股份有限公司; 754紫外
分光光度计, FA1104N 型电子天平,上海精密科学
仪器有限公司。
2 方法与结果
2 1 党参多糖的制备:取党参饮片 500 g, 粉碎, 置
索式提取器中, 用 80%乙醇加热回流 3 次, 回流至
液体接近无色, 药渣 80 超声处理 2次, 每次 10
m in,加 20倍水煎煮 3次, 第1次 2 h,第2次 1 h,第
3次 0 5 h,滤过, 合并 3次滤液, 浓缩, 加 95%乙醇
使醇浓度达到 80%, 静置沉淀 12 h, 离心,取沉淀分
别用乙醇、丙酮洗涤, 干燥, 得粗多糖。将粗多糖配
成 5%溶液在- 20 冻融数次,先用 Savege法除蛋
白,然后过 Sephadex G-75柱,流水透析 72 h,干燥,
得精制的党参多糖。
2 2 正交试验的因素与水平: 根据文献报道[ 3, 4] ,
反应温度、试剂配比、反应时间对修饰的影响较大,
因此选取反应温度( A)、氯磺酸与吡啶的配比( B)和
反应时间( C)为因素,确立 3种水平, 按照 L9 ( 34 )正
交表设计修饰条件。
2 3 酯化修饰:将带有搅拌和冷凝装置的三颈烧瓶
置盐水-冰浴中, 按表 1设定的氯磺酸与吡啶的体积
比,先加入预冷的无水吡啶 50 mL,剧烈搅拌,使之
充分冷却,再将氯磺酸 40 m in 内逐滴加入, 见烧瓶
中出现大量淡黄色固体,停止反应,共制备 9种酯化
试剂。精确称取党参多糖 400 mg, 加入酯化试剂
中,按表 1设定的反应温度和时间在水浴中搅拌反
应。反应结束后冷却至室温, 反应液加入预冷的
100 mL 冰水中, 用 5 mo l/ L NaOH 溶液中和至
pH 7。加入 3倍体积的无水乙醇,静置 24 h, 沉淀用
自来水透析 2 d、蒸馏水透析 1 d,透析液冷冻干燥得
硫酸化党参多糖 ( sulfated Codonop sis p i losula
polysaccharides, sCPPS) , 共得到 9种 sCPPS。
2 4 硫酸基取代度的测定[ 5 ]
2 4 1 标准曲线的制作:称取 105 干燥恒重的硫
酸钾 100 mg ,以 1 mol/ L HCl定容至 100 mL 得到
1 mg / mL 的硫酸基标准溶液,取 5个带塞试管, 分
别量取 0 04、0 08、0 12、0 16、0 20 mL 硫酸钾,然
后补足 1 mo l/ L HCl至 0 20 mL,各管都加入 3%
1092 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 7 期 2010 年 7 月
三氯乙酸 3 8 mL 溶液, 再加氯化钡-明胶溶液 1
mL,室温静置 15 m in 后在 360 nm 处测其吸光值
A 1 , 再以相同体积的 0 5%明胶溶液代替氯化钡-明
胶溶液依法操作, 在 360 nm 处测其吸光值 A 2。以
硫酸基的浓度为横坐标, ( A 1 - A 2 )吸光度值为纵坐
标,绘制标准曲线,得回归方程Y= 1 65 X+ 0 022 6,
R
2
= 0 993 9。
2 4 2 样品测定:称取各硫酸化多糖样品 5 mg, 溶
于 l mol/ L HCl溶液中, 100 沸水浴水解 4 h, 吸
取 0 2 mL 样品同标准曲线的制作项下方法分析,
测量氯化钡-明胶与明胶的吸光度之差。然后代入
回归方程, 计算取代度 ( DS) [ DS = 1 62S/ ( 32 -
1 02S, S 为样品中硫酸基的量]。
2 5 正交试验结果:由表 1可见, 在 80 、试剂配
比1 8、反应时间 1 h的条件下的产物得率最高, 达
到 1 82。在 80 ,试剂配比为 1 6,时间 3 h条件
下产物的取代度最高,达 1 83。以产物得率为指标
的极差( R )值可以看出, 各因素对产物得率影响为
B> A> C,氯磺酸与吡啶的配比对产物得率的影响
最大,最佳的修饰条件为 A 3 B2C3 ; 以取代度为指标
的极差值可见, 各因素对取代度的影响为 C> B>
A,时间对取代度的影响最大,最佳组合为 A 2 B2C3。
2 6 各因素对产物得率和取代度的影响:反应温度
越高,产物得率就高;试剂配比为 1 6时产物得率
最高,继续提高试剂配比产物得率变化不大; 反应时
间为 3 h时产物量最高。以产物得率为指标的方差
分析可见, 反应温度、试剂配比和反应时间的 F 值
分别为0 835、2 153、0 308, P值分别为0 545、
0 317、0 764,均大于 0 05(表 2) ,说明各因素不同
水平对提取率的影响无显著差异。
随着反应时间的延长取代度逐渐提高, 反应 3
h时取代度最高; 反应温度为 80 取代度最高, 升
高到 95 时取代度下降;氯磺酸与吡啶配比在 1
6时取代度达到最高,为 1 83,再提高配比取代度下
降。以取代度为指标的方差分析可见,反应温度、试
剂配比和反应时间的 F 值分别为 1 578、3 184、
4 249, P 值分别为 0 388、0 239、0 191, 均大于
0 05(表 2) , 说明各因素不同水平对取代度的影响
无显著差异。
表 1 L9 ( 34)正交试验结果
Table 1 Results of L9( 34 ) orthogonal test
编号 A 温度/ B 配比 C时间/ h 产物得率/ % 取代度
1 60 1: 4 1 48 0 36
2 60 1: 6 2 173 1 47
3 60 1: 8 3 151 1 41
4 80 1: 4 2 98 1 22
5 80 1: 6 3 167 1 83
6 80 1: 8 1 182 1 26
7 95 1: 4 3 170 1 48
8 95 1: 6 1 176 1 31
9 95 1: 8 2 163 1 17
产物得率
k1 124. 0 105 3 135 3 126. 0
k2 149. 0 172. 0 144 7 175. 0
k3 169 7 165 3 162 7 141 7
R 45 7 66 7 27 4 49. 0
取代度
k1 1 080 1 020 0 977 1 120
k2 1 437 1 537 1 287 1 403
k3 1 320 1 280 1 573 1 313
R 0 357 0 517 0 596 0 283
表 2 方差分析
Table 2 Analysis of variance
来源 平方和 自由度 均方 F 显著性
产物得率 固定模型 12 384 667( a) 6 2 064 111 1 099 0 548
互作 195 953 778 1 195 953 778 104 299 0 009
温度 3 137 566 2 1 568 778 0 835 0 545
试剂配比 8 088 889 2 4 044 444 2 153 0 317
时间 1 158 222 2 579 11 0 308 0 764
误差 3 757 566 2 1 878 778
总和 212 096 9
校正总和 16 142 222 8
取代度 固定模型 1 133( b) 6 0 189 3 004 0 271
互作 14 720 1 14 72 234 105 0 004
温度 0 198 2 0 099 1 578 0 388
试剂配比 0 400 2 0 200 3 184 0 239
时间 0 534 2 0 267 4 249 0 191
误差 0 126 2 0 63
总和 15 579 9
校正总和 1 259 8
a: R2= 0 767 ( Adjusted R 2= 0 069) ; b: R2= 0 900 ( Adjusted R 2= 600)
1093中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 7 期 2010 年 7 月
综合考虑产物得率和取代度的情况, 试剂配比
对产物得率的影响较大, 故选择试剂配比为 1 6,
时间对取代度的影响较大, 选择反应时间 3 h, 温度
对二者影响都不明显, 由于高温会对多糖结构产生
影响,故选择反应温度为 80 。
2 7 验证试验结果: 在反应温度 80 、试剂配比
16、反应时间 3 h的最佳条件下,进行 3 次酯化操
作,获得的 3个 sCPPS 的得率分别为 171%、165%、
168% ,取代度分别为 1 42、1 75、1 63,与正交试验结
果的差异不显著,说明此条件为最佳修饰条件。
3 讨论
多糖硫酸酯化的方法很多,一般吡喃型多糖采
用Wolfrom[ 6] 方法, 呋喃型采用 Nagasaw a 方法。
常用方法包括浓硫酸法、三氧化硫-吡啶法、氯磺酸-
吡啶法、氯磺酸-甲酰胺法等。氯磺酸-吡啶法是在
无水环境吡啶中,利用氯磺酸中的磺酸根取代单糖
残基上一个或若干羟基上的氢得到硫酸酯多糖。党
参多糖为吡喃型多糖, 所以采用氯磺酸-吡啶法修
饰,此方法相对简单,取代度高,产物回收方便 [ 8]。
由于反应温度、试剂配比和反应时间对多糖的
硫酸化修饰有显著影响, 本研究用正交试验优选出
党参多糖硫酸化修饰的最佳条件, 反应温度 80 ,
氯磺酸-吡啶配比为 1 6,反应时间为 3 h。反应温
度为 80 时,取代度最高、产物得率较高,若再升高
温度可能使多糖结构破坏。有人研究了香菇多糖的
硫酸化修饰,证明温度达到 90 时产物收率急剧下
降[ 9] 。本实验发现,试剂配比在 1 4 时, 氯磺酸-吡
啶盐出现板结,搅拌困难,使产物得率和取代度都较
低,这与卢宇等[ 9]的报道一致。反应时间长,多糖与
酯化试剂充分接触反应越完全, 可使取代度升高。
综合考虑 3个因素,因此选择了适中反应温度、试剂
配比和较长的反应时间。同时, 验证试验也证明了
选择的条件是最佳条件。
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Box-Behnken设计-效应面法优化木犀草素--环糊精包合物的
制备工艺研究
伍永富1 ,吴品江2 , 魏 萍2 , 吴大章3*
( 1 太极集团重庆涪陵制药厂有限公司,重庆 408000; 2 成都中医药大学,四川 成都 611137;
3 太极集团重庆桐君阁药厂,重庆 400066)
摘 要:目的 优化木犀草素--环糊精包合物的制备工艺。方法 采用饱和水溶液法包合木犀草素,以包合率、收
率和总评 归一值为评价指标,采用 Box-Behnken 设计考察-环糊精-木犀草素投料比例、包合时间、包合温度对制
备工艺的影响,对结果进行多元线性和二项式拟合, 效应面法选取最佳工艺条件进行预测分析。结果 从相关系
数上看,各项指标二项式拟合方程均优于多元线性回归方程, 根据优化制备工艺制得木犀草素--环糊精包合物的
平均包合率为 75% , 收率为66% 。结论 优化的木犀草素--环糊精包合物制备工艺稳定可行,包合率和收率同时
都高,可用于生产。
关键词:木犀草素;-环糊精包合物; Box-Behnken 设计;效应面法
1094 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 7 期 2010 年 7 月
* 收稿日期: 2009- 09-21 作者简介:伍永富( 1974 ) ,男(土家族) ,重庆黔江人,制药工程师,硕士研究生,从事中药生产新技术和新剂型研究。
T el: ( 023) 72801079 E-mail: f ive1975@ 126 com
* 通讯作者 吴大章 E- mail : 271241334@ qq com